2020, Vol. 41
2. 广东省水库蓝藻水华防治中心, 广州 510632
2. Guangdong Center for Control and Prevention of Reservoir Cyanobacterial Blooms, Guangzhou 510632, China
拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)属热带特征性蓝藻, 近20年来不断向温带地区扩张, 目前已广泛分布于世界各地的湖泊、水库和河流中[1, 2].该藻能产生拟柱孢藻毒素和石房蛤毒素等多种蓝藻毒素, 严重危害人类健康, 已成为一个对水环境安全极具挑战性的物种[2, 3].磷是所有藻类生长所必须的营养物质, 在合成核苷酸和磷脂以及通过磷酸化调控蛋白质功能中起重要作用, 是浮游植物生长的首要限制因子之一[4~6], 也在拟柱孢藻的优势形成和地理扩张中起着决定作用[2, 3].有研究发现拟柱孢藻可在各种不同氮磷比的水体或实验条件下达到高生物量乃至形成水华[7~11], 如Chislock等[10]进行的围隔实验中, 拟柱孢藻在氮磷比低至7或高至122时, 其生物量均占浮游植物总生物量的100%.在以色列的Kinneret湖和巴西的Ingazeira水库中, 拟柱孢藻在低氮磷(< 6.4)时达到较高生物量[7, 11], 但在澳大利亚的Wivenhoe湖, 该藻在氮磷比22时形成水华[11].初步认为拟柱孢藻拥有快速吸收和储存无机磷的能力, 不但能在高磷环境中生长良好, 还能适应低磷环境, 从而在无机磷浓度极低的环境中占优势[3, 12, 13].
在无机磷浓度较低的环境条件下, 通过碱性磷酸酶的作用有效地利用环境中的有机磷被认为是浮游植物获得竞争优势的重要原因之一[14, 15].目前已有少量研究对拟柱孢藻耐受低磷的机制进行了探讨, 发现该藻同样可在无机磷不足的情况下提高碱性磷酸酶活性, 特异性水解水体中的磷酸单酯, 释放无机磷供藻细胞生长[13, 16~18].Wu等[16]的研究发现在磷浓度低于0.05 mg·L-1的限制条件下, 拟柱孢藻藻株CHAB155能产生大量的碱性磷酸酶; 在仅有有机磷的条件下, 拟柱孢藻能利用不同的有机磷源进行生长, 且实验中有机磷组的碱性磷酸酶活性均显著高于无机磷培养组[13]. Prentice等[17]的研究发现在无机磷不足的情况下, 碱性磷酸酶对有机磷的矿化对浮游植物(拟柱孢藻占优势)生长所需磷源的贡献可达到89%, 因此能否产生碱性磷酸酶在一定程度上决定水华蓝藻的发生和分布.
目前人们在拟柱孢藻对低磷的响应策略上已积累了一定的认识, 但这些研究基本采用单藻株或模式株开展工作[13, 16].对不同拟柱孢藻藻株的比较基因组分析表明, 这些藻株都拥有完整的磷代谢相关基因[19, 20], 但基因的拷贝数大多不同, 这可能使得不同藻株对磷限制的响应存在差异[18].其它研究也发现拟柱孢藻在资源利用特性上具有高度的可塑性和株系多样性. Piccini等[21]对比分析了来自乌拉圭不同水体中的两株拟柱孢藻生理生化特征, 发现两藻株的形态以及对光照和磷供应的生长响应差异显著, 因此作者认为拟柱孢藻存在不同的生态型.近年来, 越来越多的研究表明同一区域甚至同一水体来源的拟柱孢藻藻株间存在高的性状差异, 不同藻株对温度、光强和营养等环境因子的喜好差异明显, 从而在生长速率、毒素含量和形态上表现出不同[22~26].这种株系多样性被认为有利于拟柱孢藻适应多变的环境, 并成功入侵到新的群落和生境[3].由于拟柱孢藻生态型和株系差异的广泛存在, 越来越多的研究者认为在室内实验中需采用多藻株[18, 24].
拟柱孢藻在广东省水库分布广泛[27], 甚至已成为该省多座水库的优势种类[28], 开平镇海水库中的浮游植物群落更是常年以拟柱孢藻为主, 总磷在其绝对优势形成中起决定作用[29].笔者发现从镇海水库分离到的拟柱孢藻也具株系多样性[30], 本研究继续以该水库分离的拟柱孢藻藻株为材料, 观测它们在不同磷浓度和磷形态下的生长和碱性磷酸酶活性, 了解4株拟柱孢藻在磷需求上是否存在差异, 探讨碱性磷酸酶在广东省拟柱孢藻适应低磷中的作用.
1 材料与方法 1.1 藻种的来源与培养本实验所用藻种拟柱孢藻N1、N8、N9和N10分离自广东省江门市镇海水库(库中22°34′N, 112°33′E; 取水口22°55′N, 112°57′E), 藻株均在(25.5±1)℃、光照强度为35 μmol·(m2·s)-1、光暗周期比为12 h:12 h的培养箱中进行保存培养, 培养基为BG11.
1.2 不同磷浓度下的培养实验本研究以BG11培养拟柱孢藻, BG11中磷浓度为7.13 mg·L-1, 为磷丰富培养基, 因此直接将其设为高磷(HP)浓度组, 同时调整K2HPO4的浓度, 配置中磷(MP)和低磷(LP)浓度培养基, 其中的磷浓度分别为0.64 mg·L-1和0.03 mg·L-1, 每个处理组设置3个平行.取一定体积生长良好的4株拟柱孢藻7 000 r·min-1离心15 min, 弃去上清液, 用无菌水清洗3次, 随后置于无磷的BG11培养基中饥饿培养3 d.将饥饿培养后的藻细胞分别转移到装有400 mL不同磷浓度的锥形瓶中, 置于恒温光照培养箱中培养, 培养条件同1.1节.生长测定参考文献[31], 即每隔2~3 d取样测定D680 nm, 同时取1 mL藻细胞用于碱性磷酸酶活性的测定.
1.3 不同磷形态下的培养实验以BG11培养基为基础, 维持培养基中磷浓度为7.13 mg·L-1, 分别以3种无机磷[磷酸氢二钾(K2HPO4)、焦磷酸钾(K4P2O7)、三聚磷酸钾(K5P3O10)]和3种有机磷[D-葡萄糖-6-磷酸(D-G-6-P)、三磷酸腺苷(ATP)、环磷酸腺苷(cAMP)]为磷源配置培养基.这6种磷源常见易获得, 是观测不同浮游植物磷利用策略的常用磷形态[13, 32, 33].本实验藻株为拟柱孢藻N8和N9, 接种方法、培养条件和取样方式均同1.2节.
1.4 碱性磷酸酶活性的测定碱性磷酸酶(ALP)活性测定方法为分光光度比色法[34], 本研究采用试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)对拟柱孢藻的碱性磷酸酶活性进行测定.测试时, 在酶标板孔中依次加入显色底物和样品各50μL, 混匀后37℃孵育10 min, 终止反应后用酶标仪在405 nm处测定对硝基苯酚的吸光值, 根据试剂盒的说明制作标准曲线, 计算单位时间内单位生物量产生的对硝基苯酚浓度, 以此表示细胞碱性磷酸酶活性(μmol·min-1, 以D680 nm计).
1.5 比生长速率计算比生长速率(μ)指在某一时间段内藻类生长的速率, 计算方法为:
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式中, T1和T2为培养时间, X1和X2分别为培养T1和T2时的D680 nm的值.
1.6 数据分析显著性分析采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)和多重比较分析(least-significant difference, LSD), 显著水平为P < 0.05.数据处理和图形绘制在SPSS Statistics 16.0、Microsoft Excel 2013和Origin 8.0中进行.
2 结果与分析 2.1 3种无机磷浓度对拟柱孢藻生长及碱性磷酸酶活性的影响由图 1可知, 不同无机磷浓度下4株拟柱孢藻的生长趋势基本一致, 它们的生物量随磷浓度的增加而增加.不同磷浓度下4藻株的生长在前8 d没有显著差异; 在HP浓度组中, 4藻株直到实验结束时仍处于对数生长期, 4藻株在MP浓度组中的生长表现出株系差异, 除N8藻株一直良好生长外, 其他3藻株在实验末期进入稳定期, LP浓度则显著限制拟柱孢藻的生长, 4藻株均没有明显的指数生长期.
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图 1 不同无机磷浓度下4株拟柱孢藻(N1、N8、N9和N10)的生长曲线 Fig. 1 Growth curves of four strains of Cylindrospermopsis raciborskii (N1, N8, N9, and N10) under different inorganic phosphorus concentrations |
由图 2可知, 4株拟柱孢藻在HP和MP浓度组中的比生长速率显著高于LP浓度组中同藻株的比生长速率(P < 0.05).其中N10藻株的HP浓度组比生长速率最高, 为0.058 71 d-1, N8藻株的LP浓度组比生长速率最低, 为0.013 29 d-1.在相同磷浓度处理下, 4藻株在HP和MP浓度组中的比生长速率具有株系差异, 其中N8、N9藻株在HP浓度组的比生长速率显著低于N10藻株(P < 0.05), N9藻株在MP浓度组的比生长速率显著低于N1藻株的比生长速率(P < 0.05).
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不同字母表示具有显著性差异(P<0.05),下同 图 2 不同无机磷浓度下4株拟柱孢藻(N1、N8、N9和N10)的比生长速率 Fig. 2 Specific growth rates of four strains of Cylindrospermopsis raciborskii(N1, N8, N9, and N10) under different inorganic phosphorus concentrations |
不同无机磷浓度下4株拟柱孢藻的碱性磷酸酶活性见图 3.4藻株的响应趋势基本相同, 即碱性磷酸酶活性随着磷浓度的降低而升高, LP浓度组下的碱性磷酸酶活性显著高于MP和HP浓度组(P < 0.05), 而4藻株的碱性磷酸酶活性在HP和MP浓度组中无显著差异(P>0.05).
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图 3 不同无机磷浓度下4株拟柱孢藻(N1、N8、N9和N10)的碱性磷酸酶活性 Fig. 3 Alkaline phosphatase activity of four strains of Cylindrospermopsis raciborskii (N1, N8, N9, and N10) under different inorganic phosphorus concentrations |
LSD分析表明, N1藻株的LP浓度组碱性磷酸酶活性最高, 除与N10藻株的LP浓度组无差异外, 与其他藻株不同浓度组碱性磷酸酶活性均有显著性差异(P < 0.05).在相同磷浓度处理下, 4藻株的碱性磷酸酶活性具有株系差异, 其中N8藻株的碱性磷酸酶活性均显著低于其他3藻株(P < 0.05), 这表明N8藻株更适应环境中磷浓度的波动.
2.2 不同形态的磷源对拟柱孢藻生长及碱性磷酸酶活性的影响由图 4可知, 在3种无机磷条件下, 拟柱孢藻N8和N9均能良好生长, 其中在以磷酸氢二钾为磷源的条件下表现出最佳生长, 最大生物量(以D680 nm计)分别为1.15±0.029和1.08±0.019, 比生长速率分别为(0.044±0.000 8)d-1和(0.041±0.000 0)d-1(图 5).拟柱孢藻N8和N9在3种有机磷中的生长显著低于无机磷, 在D-葡萄糖-6-磷酸和环磷酸腺苷条件下, 2藻株在实验开始前6 d可缓慢生长, 随后它们的生物量基本稳定直至实验结束, 而拟柱孢藻N8和N9在三磷酸腺苷下的生长基本停滞.
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图 4 不同磷源下拟柱孢藻(N8和N9)的生长曲线 Fig. 4 Growth curves of Cylindrospermopsis raciborskii(N8 and N9) under different phosphorus sources |
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图 5 不同磷源下拟柱孢藻(N8和N9)的比生长速率 Fig. 5 Specific growth rates of Cylindrospermopsis raciborskii(N8 and N9) under different phosphorus sources |
由图 5可知, 在同种磷源条件下, N8和N9藻株的比生长速率没有显著差异, 但2藻株在无机磷组的比生长速率均显著高于有机磷组(P < 0.05).N8藻株在三磷酸腺苷的比生长速率显著低于该藻株在D-葡萄糖-6-磷酸以及环磷酸腺苷的比生长速率(P < 0.05); N9藻株在有机磷源的比生长速率则没有显著差异(P>0.05).
由图 6可知, 3种有机磷培养下拟柱孢藻N8和N9的碱性磷酸酶活性高于3种无机磷实验组, 但仅N8藻株的碱性磷酸酶活性在2类磷源下存在显著差异(P < 0.05).在无机磷充足的培养下, 拟柱孢藻N8和N9藻株的碱性磷酸酶活性一直维持在较低水平, 2藻株的碱性磷酸酶活性均在磷酸氢二钾培养下最低, 在三聚磷酸钾下最高, 但两者差异不显著(P>0.05).在仅有有机磷源培养下, N8藻株在三磷酸腺苷中的碱性磷酸酶活性显著高于D-葡萄糖-6-磷酸和环磷酸腺苷中的碱性磷酸酶活性(P < 0.05), 而N9藻株的碱性磷酸酶活性在3种有机磷培养下无显著差异(P>0.05), 这表明N8藻株对无机磷缺乏的响应较N9藻株更为敏感.
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图 6 不同磷源下拟柱孢藻(N8和N9)的碱性磷酸酶活性 Fig. 6 Alkaline phosphatase activity of Cylindrospermopsis raciborskii(N8 and N9) under different phosphorus sources |
LSD分析表明, N8藻株在三磷酸腺苷中的碱性磷酸酶活性最高, 显著高于其它5种磷源, 以及N9藻株在所有6种磷源的碱性磷酸酶活性(P < 0.05).
3 讨论营养盐对浮游植物的生长至关重要, 环境中的磷含量影响着浮游植物的生物量及其群落结构[35].本研究发现, 在MP和HP浓度下, 4株拟柱孢藻的生物量和比生长速率显著高于LP浓度组, 即高浓度的无机磷更适合拟柱孢藻的生长.这与前人的研究结果一致[8, 16, 36], 即低浓度无机磷显著地限制浮游植物的生长.
本实验所用的4株拟柱孢藻均来自于镇海水库, 其中藻株N1、N9和N10的比生长速率在3种无机磷浓度中差异显著, 藻株N8的生长也随磷浓度的降低而降低, 但其比生长速率在MP和HP浓度下无显著差异, 这表明4藻株对磷浓度的响应存在株系差异.有研究表明, 拟柱孢藻具有较高的株系多样性[21, 22, 37], 笔者之前的研究已发现N8藻株对低温的适应能力要高于N1藻株[30], 本研究显示N8藻株在实验设置的MP浓度下的生长与HP无显著差异, 表明该藻株对磷浓度波动的适应要高于其他3藻株, 另外N8藻株碱性磷酸酶活性对无机磷缺乏的响应也高于N9藻株.前人的研究也观察到不同藻株对磷浓度变化的响应差异, 如乌拉圭藻株MVCC19对低磷的适应性要高于另一藻株MVCC14[21], 澳洲藻株CS-505的碱性磷酸酶活性在磷充足和缺乏条件下均高于藻株CS-506[18].同一水体株系多样性的存在可能是拟柱孢藻在镇海水库长期占据绝对优势的重要因素之一.
在无机磷不足的水体中, 溶解性有机磷(DOP)被认为是蓝藻磷营养的重要来源[14, 38].已有研究表明拟柱孢藻能利用溶解性有机磷作为唯一磷源进行生长[13, 38].本研究也发现在仅有D-葡萄糖-6-磷酸和环磷酸腺苷的培养条件下, 拟柱孢藻N8和N9在早期都能缓慢地生长, 但它们的生物量显著低于3种无机磷培养下的生物量.这与Bai等[13]的结果相反, 他们发现拟柱孢藻FACHB 1096在D-葡萄糖-6-磷酸等有机磷培养下的生物量比磷酸氢二钾中高.这可能是拟柱孢藻的株系差异性所致, 而本研究的结果更倾向于与Ren等[39]和Vrba等[40]的发现一致, 即在同样的磷浓度下, 无机磷比有机磷能更好地满足藻类的生长, 这可能是因为合成水解有机磷的生化酶是一个高度耗能的过程[41], 碱性磷酸酶裂解有机磷所释放的无机磷难以满足藻类较快生长[39, 40, 42, 43].一般认为藻类普遍能以三磷酸腺苷作为生长所需的唯一磷源[44], 但本研究发现拟柱孢藻N8和N9在仅有三磷酸腺苷为磷源下几乎不能生长, 这表明拟柱孢藻对培养基中三磷酸腺苷的利用能力极低, 目前认为浮游植物对水环境中三磷酸腺苷的利用需要5-核苷酸酶[6], 对本实验室N8藻株全基因组数据(未发表的数据)分析表明5-核苷酸酶以单拷贝基因存在, 因此该酶在拟柱孢藻中的活性表达条件还有待阐明.
作为一种诱导酶, 碱性磷酸酶的上调表达被认为可指示水体环境处于磷限制状态, 浮游植物可通过碱性磷酸酶活性水解含磷酸单酯键的有机磷分子, 从而获得生长所需无机磷[18, 42, 45].本研究发现4株拟柱孢藻的碱性磷酸酶活性和无机磷浓度呈显著的负相关, 生长最差的LP浓度组中碱性磷酸酶活性最高, 这种磷限制下碱性磷酸酶活性升高的现象不仅发现在拟柱孢藻中[8, 13, 31], 也已在其它很多藻类中观察到[46~48].在用3种无机磷作为磷源培养下, 拟柱孢藻的生长和碱性磷酸酶活性不存在显著差异, 这与钱善勤等[32]的结果不一致, 他们发现微囊藻更偏好磷酸氢二钾, 在2种磷酸盐聚合体下的生长受到一定的限制, 这意味着拟柱孢藻比微囊藻能更好地利用各种无机磷源.不同磷源培养实验中, N8藻株的碱性磷酸酶活性在三磷酸腺苷实验组中最高, 但拟柱孢藻在该种条件下生长最差, 因此高的碱性磷酸酶表达只是指示了环境中磷不足, 并不代表着对有机磷的高效利用[49].这意味着在磷限制水体中碱性磷酸酶的大量表达并不能赋予拟柱孢藻以竞争优势.因此, 广东省拟柱孢藻在低无机磷水体形成优势的策略还需进一步研究.
4 结论(1) 拟柱孢藻N1、N8、N9和N10均能适应较宽范围的无机磷浓度波动, 可以较好地将磷酸盐多聚体用于生长, 但它们在有机磷下生长极差.
(2) 来源于同一水体的拟柱孢藻对磷浓度波动的适应和响应存在显著的株系差异, 这有利于该藻在多变的环境条件下形成优势.
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