2020, Vol. 41
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
全世界每年都生产和消耗大量的塑料, 塑料及塑料制品在工业、商业和农业等行业中广泛使用.据估计, 早在2010年, 全球192个沿海国家就产生了约2.75亿t塑料废弃物, 而到2025年, 经由河流排放到海洋的塑料废弃物可能增加10倍[1].大量的塑料废弃物在全球海洋环境中积累赋存, 并可能经过数个世纪仍未降解[2].有研究表明, 2015年全球约有(6.0~9.9)×103万t的处置不当的塑料废弃物(mismanaged plastic waste, MPW)产生, 其中超过91%的塑料废弃物经由河流, 最终归向大海[3, 4].人类弃置的塑料虽然性质稳定, 但在长期物理、化学和生物的影响下, 会部分分解成较小体积的塑料碎片、塑料纤维条带或塑料颗粒; 此外一些日化用品, 比如牙膏和护肤品等也含有塑料微球, 随着人类的日常使用排入自然环境中.微塑料(microplastics, MPs)被定义为粒径小于5 mm且来源于人工合成的有机聚合物, 其自然降解速度缓慢, 并可吸附、转运或释放有害污染物质[5], 直接影响海洋生物健康, 并会经由海洋食物网传递而放大这种危害[6, 7].
抗生素自被人类发现并利用以来, 拯救了无数生命, 有效地保障了人类健康[8].抗生素还广泛使用于畜牧养殖中, 具有疾病预防和促进禽畜生长的作用[9, 10].但长期以来, 在卫生健康领域和畜禽养殖业中一直存在抗生素过度使用甚至滥用的现象, 抗生素的实效性不断降低, 抗性(耐药性)微生物感染或使人致病的现象不断加重和蔓延[11], 最终可能导致人类落到无药可用的境地[8].城市河流、农田水稻土、生活垃圾渗滤液甚至地下水, 都检测出了多种抗生素抗性基因[11~14], 突显了抗生素和抗性基因对生态环境具有的潜在风险.
微塑料比表面积大, 具有吸附解析重金属、有机污染物及抗生素的特性[15, 16].在河水中, 微塑料表面能附着形成微生物群落[17].微塑料上富集的有害物质可能对附着其上的微生物产生持久性的选择压力, 进而增加基因突变和基因水平转移(horizontal gene transfer, HGT)的风险[18], 抗性基因通过基因水平转移机制进入致病菌而传播扩散, 从而危害人类的健康.有研究表明, 河口海岸带可以检测出多种类型的微塑料颗粒和种类繁多且丰度高的抗生素抗性基因[15], 环境中微塑料和抗性基因的赋存也与人类活动密切相关[1, 19].目前对微塑料与河水微生物抗生素抗性基因复合污染的相关研究相对匮乏, 本文以快速城市化小流域为研究背景, 采集城郊河水, 通过添加不同类型微塑料进行培养实验, 采用高通量定量PCR技术研究河水的抗生素抗性基因种类、抗性机制和丰度, 探究微塑料对河水抗性基因的影响和变化特征, 以期为河流生态环境健康评估、(微)塑料污染治理和政策制定提供一定参考依据.
1 材料与方法 1.1 河水样品采集与实验室微塑料添加模拟培养后溪是厦门市第二大河流, 上游是石兜水库和坂头水库, 下游是杏林湾水库[20].后溪流域是厦门市跨岛发展战略重点发展区域, 处于快速城镇化的进程中, 外来人口快速集聚, 对所在的小流域生态环境产生了显著影响.本研究的河水采集地点为后溪的苎溪桥, 该地点位于河流上游水库下方约610 m处, 用5 L的窄口棕色玻璃瓶收集样品, 总计采集了12份平行水样(3份水样作为原样, 9份水样用于后续培养实验).
测得水样的悬浮物(Suspended Solids, SS)为118 mg·L-1, 总有机碳(TOC)为1.37 mg·L-1, 总氮(TN)为1.03 mg·L-1.玻璃瓶中水样体积统一至4 L, 总计9份培养实验样品, 分别为空白对照组(BLK)、添加聚氯乙烯微塑料组(PVC, 不易降解微塑料)和添加聚乙烯醇微塑料组(PVA, 具有一定水溶性的微塑料), 每组各3个实验重复.添加的微塑料粒径为100 μm, 浓度为所测得水样悬浮物浓度的一半(59 mg·L-1), 进行连续曝气培养14 d.采集到的新鲜河水原样和培养后的水样采用六联抽滤设备(天津津腾, 中国)进行抽滤, 滤膜为0.22 μm无菌的过滤膜(ADVANTEC, 日本).
1.2 河水微生物DNA提取抽滤河水原样样品、空白对照培养样品和微塑料添加培养实验的样品, 将得到的滤膜分别适当剪碎, 选用FastDNA® Spin Kit for Soil提取试剂盒(MP Biomedicals, 美国), 按说明书获得水样中微生物的总DNA[21, 22].每个样品用100 μL洗脱液洗脱得到最终的DNA样品, 并用NanoDrop 1000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc., 美国)测定其DNA浓度.之后, 取每个样品的部分原液配置成体积为40 μL, 浓度为50 ng·μL-1的样品, 并置于-20℃冰箱冷冻保存, 用于后续的高通量定量PCR实验.
1.3 抗生素抗性基因高通量定量PCR与河水微生物16S rRNA基因定量PCR该研究依托的高通量定量PCR反应平台为TAKARA公司的SmartChip Real-Time PCR Systems, 采用之前相关研究使用的296种目标基因引物[9, 23, 24], 其中包含283种抗生素抗性基因, 12种可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)及1种16S rRNA基因.这些抗生素抗性基因和可移动遗传元件涵盖的种类全面, 具有典型的代表性.该PCR单次通量为5 184个(72×72), 单个反应体系的终体积为100 nL, 体系中各试剂的终浓度为: 1×的LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix试剂(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN), 5 ng·μL-1的样品DNA, 0.5 μmol·L-1的目标基因上下游引物.PCR反应热循环条件为:时长10 min, 温度95℃的预变性; 时长30 s, 温度95℃的变性, 时长30 s, 温度60℃的退火延伸, 以上两项总计40个循环; 最后进行仪器Cycler程序自带的熔解曲线分析.反应得到的数据用Cycler自带程序进行初步筛选, 保留扩增效率介于1.8~2.2的有效特异性扩增数据.根据反应平台的检测性能(检测限为31), 当PCR热循环次数的Ct值小于等于31时, 定义样品为阳性有效扩增.
根据标准质粒外标法, 采用Roche 480Ⅱ荧光定量PCR仪对河水微生物的16S rRNA基因进行绝对定量PCR.本次制备的标准质粒浓度为1.47×1010 copies·L-1, 标准曲线由10倍浓度梯度稀释标准质粒所组成, 浓度变化范围为1.47×103~1.47×109 copies·L-1.本研究的定量PCR扩增体系为20 μL, 包括10 μL的2×LightCycler 480 SYBR® Green Ⅰ Master Mix, 1 μL DNA模板, 7 μL无菌超纯水, 及上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1).定量PCR反应的热循环条件为: 5 min时长的95℃预变性(热启动); 15 s的95℃变性, 40 s的60℃退火, 20 s的72℃延伸, 总计40个循环; 仪器自动进行PCR产物熔解曲线分析.所有DNA样品均进行3次技术重复并用无菌超纯水进行阴性PCR对照实验.
1.4 实验数据分析处理Pearson线性拟合结果显示高通量PCR定量得到的核糖体16S rRNA基因的相对拷贝数[11](relative copy number)和荧光定量PCR得到的16S rRNA基因绝对拷贝数(absolute copy number)呈极显著相关关系(P < 0.01), 说明两者的线性关系明显.参照现有的方法[15, 25, 26], 可以得到各种抗生素抗性基因的绝对拷贝数.本实验得到的数据通过Excel 2010进行计算整理, 采用OriginPro 9.0进行相关作图, 采用R 3.6.3软件进行热图综合分析, 采用SPSS Statistics 22进行数据的相关性分析.
2 结果与讨论 2.1 抗生素抗性基因的种类和多样性本研究采用的高通量荧光定量PCR芯片可检测283种抗生素抗性基因, 包含以下8种抗生素类型:氨基糖苷类(Aminoglycoside)、β-内酰胺类(β-Lactam)、氟喹诺酮类/氯霉素类/胺酰醇类(FCA)、大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类(MLSB)、多重抗药类(Multidrug)、磺胺类(Sulfonamide)、四环素类(Tetracycline)和万古霉素类(Vancomycin).同时也检测了12种可移动遗传元件.在本实验中总共检测到165种抗生素抗性基因(ARGs)和8种可移动遗传元件(MGEs), 不同实验处理河水样品中的抗性基因种类数具体如图 1所示.
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图 1 抗生素抗性基因和可移动遗传元件种类数 Fig. 1 Detected number of ARGs and MGEs |
采样点河水原样(ORI)检测到了151种抗性基因和8种可移动遗传元件.经过14 d的连续曝气培养后, 3种不同处理的河水的抗性基因和可移动遗传元件的种类数都显著下降, 空白对照河水(BLK)、添加PVC的河水(PVC)和添加PVA的河水(PVA)样品检测到的抗性基因种类数分别为71、87和95种, 而可移动遗传元件(MGEs)的种类数分别为4、3和5种.有研究表明, 曝气(搅拌和增加溶解氧)能够有效减少水中的化学需氧量(COD)和铵(NH4+)的浓度水平, 可能导致微生物多样性的减少[27].本研究显示, 曝气培养会使得水中抗性基因种类减少, 但同时显示河水添加微塑料(PVC或PVA)后, 相对空白对照培养的河水样品抗性基因种类显著增加.此外, 比较两种添加不同类型微塑料培养的样品, 添加具有水溶性的聚乙烯醇微塑料(PVA)的河水抗生素抗性基因种类增加更多.因此, 微塑料使得河水抗性基因的组成(抗性谱)发生了变化, 增加了河水抗性基因种类, 表明微塑料改变了河水抗生素抗性基因的种类组成, 因此微塑料污染的河水可能会有更多的抗性基因污染.
2.2 微塑料对河水抗生素抗性基因丰度的影响不同实验处理的河水抗生素抗性基因的丰度水平如图 2所示.在绝对丰度水平上, 河水原样(ORI)、空白对照河水(BLK)、添加PVC的河水(PVC)和添加PVA的河水(PVA)总的抗性基因丰度分别为1.2×1010、2.8×109、3.2×109和8.1×109 copies·L-1, PVC处理组和对照组(BLK)的抗性基因没有显著差异(P>0.05), 但是PVA处理组的抗性基因丰度与对照组(BLK)有显著差异(P < 0.05).在单细胞水平[图 2(a)], 添加PVC的河水(PVC)和添加PVA的河水(PVA)抗性基因的丰度分别为0.26 copies·cell-1和0.62 copies·cell-1, 高于空白对照河水(BLK)的0.21 copies·cell-1, 但是低于河水原样(ORI)的1.21 copies·cell-1.从单位体积河水分析[图 2(b)], 4类河水样品的可移动遗传元件绝对丰度分别为2.0×109、7.6×108、7.3×108和1.4×109 copies·L-1, 可移动遗传元件分布特征与总的抗性基因接近.
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图 2 抗生素抗性基因和可移动遗传元件的丰度 Fig. 2 Abundance of ARGs and MGEs |
从图 2可以看出, 不管是细菌单水平, 或是单位体积河水, 曝气培养的3种处理样品中抗性基因的丰度都低于河水原样, 因此连续曝气且没有养分补给, 可能会直接影响微生物的多样性[27], 进而降低抗性基因的丰度.有研究表明, 添加PVC和PVA微塑料能够显著增加河口沉积物中抗性基因的丰度[15].虽然本研究培养体系不包含河流沉积物, 但添加水溶性微塑料PVA培养的河水抗性基因丰度也显著增加了(P < 0.05), 特别是β-内酰胺类抗性基因和多重耐药抗性基因的丰度增长明显.相对于空白对照(BLK), 微塑料使得河水抗性基因丰度显著增加, 说明微塑料和抗性基因的复合污染可能会引发河流生态风险.
2.3 抗生素抗性基因的分布格局将八大类抗性基因、可移动遗传元件(MGEs)、未知抗性机制的基因(others)和总抗性基因(ARGs)的丰度进行热图分析(图 3), 能够比较直观地展现微塑料对河水抗性基因的影响.在各类不同抗性基因的丰度水平上, 河水原样(ORI)都是最高的.经过14 d的培养, 河水中的抗性基因显著减少.添加不易降解的微塑料(PVC)培养后, 河水抗性基因分布格局与空白对照组(BLK)分布格局相似; 而添加具有一定水溶性可降解微塑料(PVA)培养后的河水, 抗性基因丰度则显著增加.
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图 3 河水抗生素抗性基因聚类分布热图 Fig. 3 Heatmap of ARGs in river water |
具体来看, 各类抗性基因聚类成两大簇, 一簇是磺胺类(Sulfonamide)、氟喹诺酮类/氯霉素类/胺酰醇类(FCA)及其它未知机制的抗性基因(others), 经曝气培养后, 这3类抗性基因丰度显著降低, 特别是空白对照河水(BLK)中丰度最低, 而微塑料对这几类抗性基因的影响不大; 另一大簇则包含除以上3种之外的其他抗性基因.经相关性分析得知, 可移动遗传元件(MGEs)丰度与四环素类(Tetracycline)、氨基糖苷类(Aminoglycoside)、多重抗药类(Multidrug)和万古霉素类(Vancomycin)四类抗生素抗性基因丰度呈显著正相关关系(r>0.9, P < 0.05).同时, 河水总抗性基因(ARGs)也聚类在此簇, 表明这几类抗性基因对河水总体抗生素抗性基因的分布格局影响较大(图 3).相关性分析结果也显示, 河水总抗性基因与可移动遗传元件呈显著正相关关系(r>0.9, P < 0.05), 表明可移动遗传元件可能通过基因横向转移机制影响河水抗性基因的赋存与演变.
3 结论(1) 加入微塑料培养可改变河水抗生素抗性基因的组成(抗性谱), 不易降解的微塑料(PVC)和具有水溶性的微塑料(PVA)均能够增加河水中抗性基因的种类.
(2) 曝气培养可显著减少河水中抗性基因的种类和丰度, 但相对于空白对照, 添加具有水溶性的微塑料能使得河水抗性基因丰度显著增加.同时, 抗生素抗性基因与可移动遗传元件呈显著正相关关系, 说明可移动遗传元件可能通过基因横向转移机制影响河水抗生素抗性基因的赋存与演变.
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