2020, Vol. 41
四环素类抗生素(TCs)是一类广谱抗生素药物, 能够有效地抑制革兰氏阴性和阳性细菌的生长和繁殖, 已被广泛应用于人体和动物体流行病的预防和治疗中[1, 2].据统计, 美国2012年用于畜禽养殖的TCs已超过5 900 t[3], 而中国2013年TCs使用量则高达12 000 t[4].近年来, 越来越多的研究报道在不同环境介质中检出TCs及其代谢产物[5, 6], 浓度水平可高达μg ·L-1甚至mg ·L-1级别, 对生态环境及人体健康具有潜在危害影响[7].
已有研究表明, TCs残留对四环素抗性细菌(TRB)和四环素抗性基因(TC-ARGs)的富集、演变和散播具有重要影响[8~10], 但关于TCs对TRB的选择性作用过程, 及其对TC-ARGs的演变影响仍尚不明晰[11].现阶段, 针对TCs暴露对细菌微生物抗药性的演变影响主要集中于对TC-ARGs丰度变化相关研究[12, 13], 如Zhang等[14]的研究发现, SBR活性污泥系统中四环素(TC)抗生素暴露能够富集TC-ARGs. Gao等[9]同样在污泥厌氧系统中发现梯度TC暴露(50~500 μg ·L-1)会造成TC-ARGs丰度的升高.虽然TC-ARGs丰度的高低一定程度上能够反映其污染程度, 但并不能准确地体现其实际风险水平, 因为某些TC-ARGs在特定环境中可能处于休眠或无反应活性状态.由此可见, 与TC-ARGs丰度相比, 其抗性表达的强弱更能反映其反应活性和实际风险, 但目前针对TC-ARGs抗性表达及其影响因素方面的研究较少[15].
笔者前期研究发现, 在从活性污泥中筛选获得的TRB混合菌体系中, 不同浓度TC暴露对TC-ARGs丰度和表达水平的变化影响差异很大, 推测可能是由于不同TRB对TC胁迫的耐受程度和响应行为具有差异性所导致的[16].基于此, 本文对从活性污泥中筛选获得的TRB进一步梯度筛选和纯化, 最终获得具有TC抗性的单一菌属, 通过16S rDNA测序鉴定为弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri), 考察不同浓度TC胁迫对其生长过程的作用影响, 采用荧光定量PCR(qPCR)和逆转录PCR方法对不同抗性机制的TC-ARGs, 包括tetC、tetO和tetX基因丰度及其表达水平进行定量分析, 探讨TC胁迫对Shigella flexneri细菌TC-ARGs丰度及表达水平的演变影响, 以期为探明TC对TC-ARGs的内在作用过程及其实际风险评估提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 TRB筛选本研究目标TRB从污水污泥中通过梯度筛选获得, 污泥样品取自实验室处理含TC污水的厌氧/好氧活性污泥系统沉淀池.首先量取10 mL泥水混合物于10 000 r ·min-1和4℃条件下离心10 min(Heraeus Multifuge X1R, Thermo Scientific), 其中污泥VSS为(10.0±0.1) g ·L-1, 弃去上清液, 收集沉淀污泥; 称取0.1 g沉淀污泥均匀分散至100 mL添加有10 mg ·L-1 TC的LB液体培养基中, 然后置于恒温振荡培养箱(SPH-1102C, 上海世平实验设备有限公司), 在(37±2)℃和150 r ·min-1转速下连续培养20 h, 获得混合培养液; 量取1 mL混合培养液于100 mL LB液体培养基中再次培养筛选, 按此操作连续培养7个周期, 最终筛选获得不含固体颗粒的TRB混合菌溶液.
上述LB培养基组成如下：10 g ·L-1 NaCl、10 g ·L-1胰蛋白胨和5 g ·L-1酵母提取物[生工生物工程(上海)股份有限公司].其中, TC筛选浓度根据美国临床和实验室标准协会(Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI)针对TC对细菌微生物的致死浓度进行确定.量取100 μL上述TRB混合菌溶液(D600=0.8±0.02), 按10-7~10-1梯度稀释后接种于添加有TC的LB固体培养基中, 静置片刻后, 将培养平板倒置于(37±2)℃的恒温培养箱中培养24 h, 连续筛选培养3个周期, TC筛选浓度分别为12、14和16 mg ·L-1依次递增, 最终筛选获得边缘清晰的单一菌落, 如图 1(a)所示.
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(a) TRB菌落; (b)扫描电子显微镜图 图 1 TRB筛选菌落照片及其扫描电子显微镜图 Fig. 1 Optical photograph and scanning electron micrograph of the screened bacterial colonies of TRB |
挑取上述划线分离获得的TRB菌落于添加有TC的LB固体培养基中进行纯化培养, 连续培养3代, 然后将纯化后的菌株于LB液体培养基中扩大培养, 培养后送至上海桑尼生物科技有限公司进行16S rDNA测序分析, 将测序所得的序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中BLAST进行同源性比对分析, 选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果.此外, 通过电子扫描显微镜观察TRB的外观形貌特征.
量取100 μL纯化培养后的TRB菌液于LB液体培养基中, 然后置于(37±2)℃的恒温振荡培养箱中培养, 振荡速率为150 r ·min-1, 每隔2 h采样在600 nm波长下进行测定(UV-5200PC, METASH), 考察TRB生长状况, 绘制TRB生长特性曲线.
1.3 TRB培养条件量取100 μL上述筛选获得的TRB菌液于100 mL LB液体培养基中, 菌液浓度D600=0.8±0.02, 培养基中TC浓度分别为10 μg ·L-1、50 μg ·L-1、100 μg ·L-1、1 mg ·L-1和20 mg ·L-1, 考察不同浓度TC对TRB不同生长阶段的胁迫效应, 同时设置未添加TC的LB液体培养基作为空白对照样, 所有实验均平行设置3组.
1.4 基因组DNA和RNA提取及单链cDNA合成基因组DNA和RNA提取：将TRB培养后所得培养基在12 000 r ·min-1条件下离心进行固液分离, 收集菌体沉淀, 使用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗以去除残留培养基, 然后分别采用细菌基因组DNA提取试剂盒和RNA prep Pure提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取TRB菌体的总DNA和总RNA.
单链cDNA合成：将上述提取的RNA样品与FastKing cDNA第一链合成试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]中的预混试剂进行混合, 利用FastKing反转录酶与RNA之间的强亲和性及其自身的热稳定性, 在42℃条件下充分反应15 min, 以完成cDNA第一链的合成.试剂盒预混试剂中含有热敏gDNase, 对基因组DNA具有高效去除效果, 能够消除其对RNA的干扰影响.cDNA第一链合成完成后, 于95℃条件下反应3 min, 以获得具有较高灵敏度和较好稳定性的单链cDNA样品.
采用QubitⓇ 2.0核酸蛋白测定仪[Invitrogen, 赛默飞世尔科技(中国)有限公司]分别测定所提取的总DNA、RNA和cDNA的浓度.所有样品均保存于-80℃冰箱中待用.
1.5 TC-ARGs丰度与表达水平检测分析目标TC-ARGs和16S rRNA基因丰度采用LightCyclerⓇ 96全自动qPCR(Roche)进行定量检测, 所需扩增引物序列、扩增子大小和退火温度等参照文献[17, 18]. qPCR为20 μL反应体系, 包括Essential DNA Green Master 10 μL、100 μmol ·L-1上下游引物各1.5 μL、DNA或cDNA模板1 μL, 以及ddH2 O 6 μL.每组样品设置3个平行样, 同时使用无菌水作为阴性对照.利用熔解曲线(65~95℃)分析qPCR扩增产物的特异性, 优化并消除非特异性扩增对最终结果的干扰影响.
TC-ARGs表达水平采用2-ΔΔCt法[19, 20]进行计算分析, 方法如下：
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(1) |
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(2) |
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(3) |
式中，Ct为循环阈值.
1.6 数据分析目标TC-ARGs和16S rRNA基因丰度通过qPCR仪器自带的SW1.1软件进行计算分析; 采用Microsoft Excel 2017软件分析TC-ARGs丰度变化及其表达水平; 采用SPSS 22.0软件(IBM)对数据进行统计分析, 设置统计检验显著性水平P=0.05, 若P < 0.05, 认为具有显著相关性, 反之则相关性不显著.所有图表均采用Origin 8.5软件进行绘制.
2 结果与讨论 2.1 TRB测序鉴定与分析将筛选分离的TRB进行16S rDNA测序, 测序序列经NCBI数据库BLAST比对分析后, 发现其与Shigella flexneri的同源性高达99%以上, 将其命名为TRB-68-B, GenBank登入号为SRR10592619.由图 1(b)可以看出, Shigella flexneri菌株外观形态呈杆状, 尺寸大小约为18 μm×6 μm, 菌体边缘较为整齐, 表面无芽孢、荚膜和鞭毛, 无运动特征.
Shigella flexneri属于弗氏志贺氏菌, 是导致人体腹泻的主要原因之一, 每年约造成70万人因腹泻死亡[21].有研究表明, Shigella flexneri对TC、氨苄西林和磺胺甲唑具有广泛抗药性[22].Yang等[23]在从中国河南众多痢疾患者的粪便标本中发现, Shigella flexneri菌属对TC抗药性比例高达75%.笔者的前期研究同样发现, 在Shigella flexneri中检出多种TC-ARGs, 包括tetC、tetO和tetX基因等.
2.2 TC胁迫对Shigella flexneri生长状况的影响图 2为不同浓度TC胁迫对Shigella flexneri生长状况的作用影响.Shigella flexneri为兼性厌氧菌, 可以看出, Shigella flexneri经过初始阶段适应后, 开始进入对数增长期.TC胁迫对Shigella flexneri生长具有一定抑制作用, 随着TC浓度的升高, 细菌细胞浓度(D600)增长速率相应减小.当TC浓度分别为10 μg ·L-1和20 mg ·L-1时, Shigella flexneri培养6 h后的D600分别为空白对照组的85.4%和64.6%.尽管如此, 随着培养时间的延长, Shigella flexneri生长曲线趋于平缓, 不同浓度TC胁迫对细菌细胞浓度变化影响不显著.由此可知, 高浓度TC对Shigella flexneri生长具有较为明显的抑制作用, 随着TC胁迫时间的延长, 细菌细胞能够通过分泌胞外蛋白做出应激响应, 以抵御外界不利因素对自身的侵害作用.相比之下, 低浓度TC(10~100 μg ·L-1)对Shigella flexneri生长的影响较小, 除在初始阶段(6 h)对其产生一定抑制作用外, 后期抑制影响不显著.
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图 2 不同浓度TC下Shigella flexneri生长曲线 Fig. 2 Growth curves of Shigella flexneri under stresses of different TC concentrations |
图 3为不同浓度TC胁迫对Shigella flexneri细菌tetC、tetO和tetX基因丰度变化的影响过程.分析可知, 不同浓度TC暴露对TC-ARGs丰度变化影响较小, TC浓度从10 μg ·L-1升高至20 mg ·L-1时, 并未发现其对TC-ARGs丰度产生显著影响, 这可能是因为在单一抗药性细菌培养体系中, ARGs主要通过垂直基因转移进行亲代传递, 而无法通过可移动基因元件如质粒和转座子等进行水平转移, 因此TC胁迫对TC-ARGs丰度变化影响较小.在整个培养周期内, TC-ARGs丰度相对稳定, 但在培养时长为16 h时出现升高趋势, 当TC浓度为20 mg ·L-1时, tetC、tetO和tetX基因丰度分别升高6.4%、6.0%和4.4%, 这可能与细菌发生基因突变有关.有研究表明, 亚致死浓度的抗生素暴露能够诱导细菌细胞产生活性氧物质(ROS), 导致基因突变的发生, 且细胞内ROS累积会降低细菌对抗生素分子的敏感性, 从而增强细菌的抗药性能[24].
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图 3 不同浓度TC对Shigella flexneri细菌TC-ARGs丰度变化的影响 Fig. 3 Impact of different TC concentrations on the gene abundance of TC-ARGs in Shigella flexneri |
图 4为不同浓度TC对Shigella flexneri细菌tetC、tetO和tetX基因表达水平的影响过程.可以看出, 在不同浓度TC暴露下, tetC、tetO和tetX基因表达水平均出现了不同程度的上调, 表明TC胁迫能够促进TC-ARGs的转录表达, 以应对TC分子对细菌细胞的侵害作用.TC胁迫能够影响TC-ARGs启动子的活性, 进而影响抗生素抗性功能蛋白的表达过程.
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图 4 不同浓度TC胁迫下Shigella flexneri细菌TC-ARGs的表达水平 Fig. 4 Expression levels of TC-ARGs in Shigella flexneri under stresses of different TC concentrations |
在整个培养周期内(24 h), 不同TC-ARGs转录表达水平均呈现出先升高后降低的变化趋势, 在第16 h时出现最大值, 其中, 当TC浓度为20 mg ·L-1时, tetC和tetX基因表达水平分别上调1.5倍和0.5倍.有研究表明, 亚抑制浓度TC(20 mg ·L-1)胁迫能够促使大肠杆菌启动自我保护机制, 通过调节自身细胞代谢过程以抵御TC的毒性影响, 进而导致TC-ARGs表达水平的上调[25].因此, TC的持续性选择性作用一方面能够维持TC-ARGs的稳定存在和活跃的转录表达能力, 另一方面还可能会增大细菌基因突变的发生几率, 促进TC-ARGs的增殖和散播.tetO基因表达水平在TC浓度为100 μg ·L-1时上调幅度最大, 约1.2倍, 表明TC胁迫对不同抗性机制的TC-ARGs作用影响程度不同.与tetC和tetO基因相比, tetX基因表达水平变化幅度相对较小, 在Shigella flexneri细菌培养24 h后已出现下调, 这可能与tetX基因本身的抗药性机制有关, tetX基因所编码的功能蛋白具有化学修饰和降解TC分子的能力[26, 27], 可以通过化学修饰或分解TC分子以削弱其对Shigella flexneri细菌细胞的选择性效应, 从而导致tetX基因表达水平较低.
2.5 相关性分析表 1为TC胁迫浓度与Shigella flexneri细菌tetC、tetO和tetX基因丰度及其表达水平之间的相关性分析结果.可以看出, TC浓度与不同TC-ARGs丰度之间相关性不显著, 且也未发现TC浓度与tetC、tetO和tetX基因表达水平之间存在显著相关性, 表明TC胁迫对TC-ARGs丰度和转录表达水平的直接影响不明显.此外, Shigella flexneri细菌细胞对TC胁迫的抵抗作用也可能是由多种TC-ARGs共同响应的结果.由于本研究只考察了tetC、tetO和tetX基因, 对于不同浓度TC的选择性作用, Shigella flexneri细菌也可能会通过其他TC-ARGs的共同作用或其他方式抵御TC的胁迫影响[28], 从而表现出TC浓度与特定TC-ARGs丰度及其表达水平之间相关关系不显著.此外, TC分子在与细菌细胞相互作用的过程中也可能会发生转化或修饰, 影响其生物有效性, 进而影响其对TC-ARGs丰度及其转录表达水平.
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表 1 TC浓度与Shigella flexneri细菌TC-ARGs丰度及表达水平相关性分析 Table 1 Correlation analyses between the TC concentrations and abundance of TC-ARGs as well as their expression levels in Shigella flexneri |
从图 5分析可知, Shigella flexneri细菌tetC和tetO基因丰度与其转录表达水平之间存在显著线性正相关关系(P < 0.001), 表明在TC胁迫作用下, tetC和tetO基因丰度的升高能够同步促进其转录表达水平的上调, 因此某种程度上对于Shigella flexneri细菌可以采用tetC和tetO基因丰度衡量其转录表达水平.尽管如此, tetX基因丰度与其转录表达水平之间线性相关关系不显著(P=0.098), 表明其基因丰度高低并不能真实反映其转录表达水平.
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图 5 Shigella flexneri细菌TC-ARGs丰度与其转录表达水平相关性分析 Fig. 5 Correlations between gene abundance of TC-ARGs and their expression levels |
(1) 不同浓度TC胁迫对Shigella flexneri细菌生长具有一定抑制作用, 细菌细胞浓度增长速率随TC浓度的升高而减小.
(2) 在不同浓度TC胁迫条件下, Shigella flexneri细菌TC-ARGs丰度变化较小, 当TC浓度为20 mg ·L-1时, tetC、tetO和tetX基因在培养时长为16 h时出现升高趋势, 幅度分别约为6.4%、6.0%和4.4%.
(3) TC胁迫能够促进Shigella flexneri细菌TC-ARGs的转录表达, tetC、tetO和tetX基因表达水平在整个培养周期内均表现出先升高后降低的变化趋势, 当TC浓度为20 mg ·L-1时, tetC和tetX基因表达水平在第16 h时分别上调1.5倍和0.5倍.相比之下, tetO基因表达水平在TC浓度为100 μg ·L-1时上调幅度最为明显, 可达1.2倍.
(4) 由相关性结果分析可知, TC浓度与Shigella flexneri细菌tetC、tetO和tetX基因丰度及其转录表达水平之间相关关系均不显著, 表明TC胁迫对TC-ARGs丰度和转录表达水平的直接影响不明显.此外tetC和tetO基因丰度与其转录表达水平之间存在显著线性正相关关系, 表明某种程度上对于Shigella flexneri细菌可采用tetC和tetO基因丰度来衡量其转录表达水平.
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