2020, Vol. 41
2. 山西省环境监控中心, 太原 030027
2. Environmental Supervision Center of Shanxi Province, Taiyuan 030027, China
我国是世界上最大的煤炭生产国和消费国, 每年因矿山开采产生的固体废弃物占全国工业固废产生量的80%以上[1].煤矸石是在煤炭开采和洗煤过程中产生的一种复杂的工业固体废弃物, 其排放率可达原煤开采量的10%~15%, 此外, 洗煤过程中还可排放10%~15%[2].截止2013年, 中国煤矸石累积堆放量约为45亿t, 规模较大的煤矸石山达2 600多座, 每年生产约6.59亿t煤矸石[3].煤矸石的大量排放及露天堆放, 特别是在风化和雨淋条件下能够释放多种污染物(主要是多环芳烃和重金属)[4, 5], 这些污染物进入水体或渗入土壤后, 从而对周边土壤和水环境造成严重危害[6, 7].
有研究表明, 煤矸石的长期堆放会对周边环境土壤和玉米作物造成严重的重金属污染, 且玉米中重金属含量随着土壤中重金属含量的增加而增高[8]；用煤矸石的浸出水灌溉栽培小麦的土壤, 会降低土壤的pH值, 增加土壤中Cr和Pb的积累, 不仅抑制了土壤酶的活性, 还引起了植物的生理功能障碍, 同时促进了小麦对重金属的吸收, 降低了作物产量[9].还有研究报道, 山西省某矸石山堆积区及其周围的土壤可能会给人类带来潜在的致癌风险[10], 并且会对斑马鱼的发育和甲状腺激素产生破坏[11].大麦是北方常见的作物之一, 被作为模式植物广泛应用于环境毒理学实验中[12].与大多数传统方法相比, 植物生物测定法在检测生态系统中污染物的毒性作用时更为灵敏与简便, 并且植物微核实验是评价环境诱变因子对生物遗传物质造成损伤的有效方式[13].
为此, 本研究选取大麦为实验作物, 采用水培的方式分析、比较煤矸石堆积区及其下游村庄土壤浸出液对其萌发、生长等生理生化指标的影响和遗传毒性, 以期为评估矸石堆放区生态风险提供基础毒性数据.
1 材料与方法 1.1 样品的采集与处理本研究选取的采样地点为沁源县沁新煤矿的煤矸石山(36°34′12.24″N, 112°18′55.67″E)和其下游的沁源县下兴居村庄, 两采样点相距1.6 km.沁源县位于山西省东南部, 是山西省重点煤炭生产基地.土壤取样点包括3个子样本, 每个取样点收集0~20 cm的表层土壤, 包装后在自然干燥条件下移至实验室.将所有土壤样品冷冻干燥并研磨破碎, 然后用20目筛过滤后储存(4℃).
1.2 煤矸石及村庄土壤浸出液的制备取研磨过筛后的煤矸石和村庄土壤各100 g于锥形瓶中, 分别加入100 mL的超纯水(1 g·mL-1), 密封后置于HZQ-F100振荡箱中, 在常温条件下振荡3 d后静置一晚.次日, 将泥水混合物取出在KDC-40低速离心机上以3 000 r·min-1的条件下离心10 min, 然后将上清液转移到聚四氟乙烯(PTFE)瓶中, 密封保存在4℃的黑暗条件下.
1.3 植物材料的处理大麦种子(Hordeum vulgare L.)购自山西省农业科学院.挑选颗粒饱满的大麦种子数颗, 在室温条件下用蒸馏水浸泡4~6 h.该实验分为4个处理组, 分别用蒸馏水稀释煤矸石和村庄土壤浸出液至不同浓度(1:27、1:9、1:3和1:1), 对照组用蒸馏水.然后将所有种子置于(26±0.5)℃的温度下, 光照:黑暗为14 h:10 h的条件下生长.实验设置为3个重复, 每组30粒种子, 每隔一段时间适当更换处理液.
1.4 大麦种子萌发实验大麦种子经浸种后, 随机选择30粒大小一致的种子置于铺有两层滤纸的培养皿内, 随后添加不同浓度的处理液.以种子破白为萌发标准, 每隔24 h检测种子萌发率.
1.5 大麦生长毒性实验大麦种子经浸种后, 用湿纱布包裹催芽24 h.当幼苗的根长达到1~1.5 cm时, 随机挑选30粒长势一致的种子置于铺有两层滤纸的培养皿内, 随后添加不同浓度的处理液.每隔24 h检测大麦幼苗的根长、芽长, 计算各处理组的单株平均值, 作为该组大麦幼苗的平均根长、芽长.
大麦种子处理7 d后, 剪下幼苗的根和茎叶部分, 用蒸馏水洗净后放置在滤纸上晾干、称重, 得到大麦幼苗的根和茎叶的鲜重.计算各处理组的单株平均重量, 作为该组大麦幼苗的平均根重和茎叶重.
1.6 丙二醛及叶绿素含量的测定大麦种子处理7 d后, 采集幼苗的新鲜叶片以测定其生理生化指标.丙二醛(MDA)含量的测定方法采用硫代巴比妥酸(TBA)加热比色法[14]；叶绿素(Chl)含量的测定方法采用丙酮-乙醇混合提取法[15].
1.7 有丝分裂指数(MI)和微核率(MCN)用不同浓度的煤矸石和村庄土壤浸出液分别处理大麦种子根系24 h后, 自根尖顶端切下1cm长的幼根放入盛有卡诺固定液(甲醇:乙酸=3:1)的小瓶中固定24 h, 随后转入70%的乙醇中保存.通过Feulgen法对根尖进行染色后, 切去根尖1 mm左右, 加盖玻片, 常规压片, 用光学显微镜在800×放大倍数下进行观察.每个处理组观察10株植物的幼根, 每株约1 000个细胞, MI为根尖有丝分裂细胞占细胞总数的百分比, MCN为根尖细胞中的微核率, 以千分比表示[16].
1.8 数据统计与分析采用Origin8.0统计软件对数据进行统计分析, 数据用平均值±标准误差(SE)表示, 用One-way ANOVA法检验染毒组与对照组的差异显著性.
2 结果与分析 2.1 矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦种子萌发率的影响矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦种子萌发率的影响如图 1所示.不同浓度的浸出液均对大麦种子的萌发率产生了抑制作用, 并且随着浸出液浓度的增加, 抑制作用增强.染毒48 h, 浓度为1:1时, 煤矸石处理组萌发率为对照组的88%(P＜0.01), 村庄土壤处理组萌发率为对照组的85%(P＜0.01). 72 h后, 处理浓度为1:27、1:9、1:3和1:1时, 煤矸石处理组萌发率分别为对照组的91%、90%、87%和83%, 村庄土壤处理组萌发率分别为对照组的90%、90%、91%和82%.
|
与CK相比有显著差异, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01, ***表示P＜0.001, 下同 图 1 矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦种子24、48和72 h萌发率的影响 Fig. 1 Effects of soil leachate from coal gangue and its surrounding village on germination rate of barley seeds at 24, 48, and 72 h |
图 2和图 3为矸石山及其周边村庄土壤的浸出液对大麦幼苗早期生长的影响.图 2结果显示, 染毒24 h, 煤矸石浸出液处理组的芽长[图 2(a)]和根长[图 2(b)]均显著降低(P＜0.01)；但随着处理时间的延长, 浸出液对其生长的影响逐渐变弱, 168 h时仅有1:3和1:1组的芽长明显受到抑制(分别为对照组的83%和75%), 而所有处理组的根长与对照相比均无显著性差异.由图 3可以看出, 村庄土壤浸出液高浓度能够抑制大麦幼苗芽与根系的生长.
|
图 2 矸石山土壤浸出液对大麦幼苗24、48、72、96、120、144和168 h芽长和根长的影响 Fig. 2 Effects of soil leachate from coal gangue on shoot length and root length of barley at 24, 48, 72, 96, 120, 144, and 168 h |
|
图 3 周边村庄土壤浸出液对大麦幼苗24、48、72、96、120、144和168 h芽长和根长的影响 Fig. 3 Effects of soil leachate from surrounding village on shoot length and root length of barley at 24, 48, 72, 96, 120, 144, and 168 h |
图 4为矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦幼苗染毒168 h后的芽重和根重变化情况.从图中可以看出, 当煤矸石浸出液处理组浓度为1:9时, 芽重和根重相比对照组有显著增加, 而当浓度达到1:3和1:1时, 芽重和根重相比对照均有降低(P＜0.05)；随着村庄土壤浸出液处理组浓度的增加, 芽重和根重逐渐降低, 当浓度为1:1时, 芽重和根重分别为对照组的68%和65%, 表现出极显著差异(P＜0.01).
|
图 4 矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦芽重和根重的影响 Fig. 4 Effects of soil leachate from coal gangue and its surrounding village on shoot weight and root weight of barley |
植物叶片具有一定的蒸腾作用, 在外界污染物的作用下, 会影响植物叶片的生长、氧化损伤和光合作用等一系列生理活动[17].由图 5(a)可以看出, 处理168 h后, 随着煤矸石浸出液浓度的升高, 叶片MDA的含量显著上升(P＜0.05), 而村庄土壤浸出液对叶片MDA含量影响并不明显.从图 5(b)可知, 煤矸石浸出液低浓度(1:27和1:9)时促进Chl含量的上升, 高浓度(1:1)则显著抑制Chl的含量(P＜0.01)；而村庄土壤浸出液对叶片Chl水平的影响较小, 仅在高浓度(1:1)表现出抑制作用(达到对照组的83%(P＜0.01)).
|
图 5 矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦叶片丙二醛和叶绿素含量的影响 Fig. 5 Effects of soil leachate from coal gangue and its surrounding villages on malondialdehyde and chlorophyll content in barley leaves |
本研究使用有丝分裂指数(MI)和微核(MCN)作为损伤终点考察了对大麦的遗传毒性.如表 1所示, 煤矸石浸出液处理组MI随着浸出液浓度的增加呈现出先上升后下降的趋势, 而村庄土壤浸出液处理组MI仅在高浓度处理时出现下降趋势, 浓度1:3和1:1时分别为对照组的67%和46%(P＜0.001).由表 2可知, 根尖细胞微核发生率在矸石山和村庄土壤浸出液处理组均呈现出浓度依赖性增加(P＜0.01).
|
表 1 矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦根尖细胞有丝分裂指数的影响1) Table 1 Effects of soil leachate from coal gangue and its surrounding village on the mitotic index(MI)of barley root tips |
|
|
表 2 矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦根尖细胞微核率的影响 Table 2 Effects of soil leachate from coal gangue and its surrounding village on micronucleus frequency(MCN)of barley root tips |
3 讨论
本研究首先探讨了矸石山及其周边村庄土壤对大麦种子萌发率的影响.结果表明, 萌发率在煤矸石和村庄土壤浸出液的处理下均受到不同程度的抑制作用, 且在高浓度下较为显著.类似地, 李云玲等[18]研究了煤矸石淋滤液对小麦种子萌发的影响, 结果表明, 煤矸石淋滤液对小麦种子的发芽有一定的抑制作用, 且浓度越高抑制作用越显著.据报道, 重金属等有害化学物质对种子萌发的影响主要取决于它们穿过种皮到达胚胎组织的能力, 不同植物种皮对不同物质的渗透性也不同[19].造成这一现象的原因可能是高浓度煤矸石和土壤浸出液中所含有的重金属元素破坏了发芽时期大麦种皮的渗透性, 导致煤矸石浸出液进入了植物细胞、扰乱了种子的正常萌发.
在此基础上, 本文又进一步研究了矸石山及其周边村庄土壤浸出液对大麦幼苗早期生长的影响, 发现其对于大麦的生长具有双重作用, 即较低浓度下促进根长、芽长和根重、芽重, 而在较高浓度下对其产生抑制作用.有研究表明, 将煤灰用于土壤可促进植物生长并能够提高作物的产量, 例如苜蓿、大麦、向日葵和花生[20].原因可能是煤矸石中某些微量金属有助于植物的生长发育, 如果适当地添加, 其可以成为增加土壤肥力的宝贵资源[21].而当这些微量金属浓度过高时, 它们会被植物吸收, 破坏植物体内的新陈代谢和光合作用, 最终降低植物的产量[9, 22].如Mtisi等[23]的报道指出, 施用低剂量的粉煤灰能够促进莴苣根系的伸长和生物量的上升, 然而高剂量的粉煤灰会导致莴苣的生长和产量显著地降低.
植物的生长发育离不开叶片光合作用的进行, 而叶绿素含量的变化能够直接反映植物体对外界环境胁迫的程度.本研究结果进一步显示, 矸石山和周边村庄土壤浸出液对叶片叶绿素含量的影响与根重芽重的变化趋势一致.据报道, 叶绿素的合成需要多种微量元素的参与, 而煤矸石中含有一系列植物生长所必需的元素, 其中包括大量营养素, 例如磷、钾、硫、钙和镁, 以及微量元素铁、锰、铜、锌、钼、镍和硼[24, 25].所以低浓度的煤矸石浸出液能够诱导大麦叶片中叶绿素含量的上升, 但当浸出液浓度过高时, 其中的重金属等污染组分就会被植物吸收运输到叶片, 进而抑制叶绿素酸酯酶和氨基酮戊酸的合成, 从而造成叶绿素含量降低, 植物生长受抑[26].也有研究表明, 煤中可能含有高浓度的可溶性盐, 当盐分过高时会引起植物的生理压力, 进而造成其养分失衡, 破坏叶片的光合作用和呼吸作用, 从而导致叶片发黄、坏死等一系列不良后果[23].通常, 叶绿素不仅可用来评估植物的非破坏性效应, 其含量又被证明与脂质过氧化有关[27].MDA是膜脂过氧化的最终分解产物, 能够直接反映出植物细胞膜受到损伤的程度, 它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系.本研究显示, 村庄土壤浸出液对于大麦叶片MDA含量无显著影响, 而矸石山土壤浸出液暴露后则导致叶片中MDA水平升高, 且呈现出显著的剂量-效应关系.这可能是由于浸出液含有大量的可溶性盐和重金属离子, 会打破植物体内自由基的平衡, 使自由基代谢失调, 导致膜脂质过氧化程度上升, 从而造成MDA含量的上升[28].
为了深度阐明矸石堆放区土壤浸出液造成大麦幼苗生长发育受抑的机制, 本研究又探讨了大麦根尖分生组织细胞的有丝分裂指数和微核发生情况.结果表明, 浸出液均对根尖细胞有丝分裂指数造成了“低促高抑”的现象, 而对微核率则呈现出明显的剂量依赖性增加.这可能是由于污染组分通过植物根部进入根尖分生区干扰细胞内的有丝分裂过程, 同时造成细胞内核的结构发生改变, 影响细胞分裂与细胞周期以及植物细胞器功能紊乱, 从而抑制根系的伸长[29].同时, 根尖细胞微核率的结果表明, 浸出液也会造成根尖细胞染色体的损伤, 提示煤矸石堆放对周边环境的潜在生态风险.
4 结论矸石山及其周边村庄土壤浸出液影响大麦萌发和早期生长过程.矸石山土壤浸出液诱导大麦叶片丙二醛含量上升和叶绿素含量下降, 而周边村庄土壤的影响不显著.矸石山及其周边村庄土壤浸出液造成大麦根尖细胞有丝分裂指数先上升后下降和微核发生率增加.这些结果提示, 煤矸石堆放可能会导致周边土壤环境污染, 引发生态风险.
| [1] | Guo X, Ren J, Xie C J, et al. A comparison study on the deoxygenation of coal mine methane over coal gangue and coke under microwave heating conditions[J]. Energy Conversion and Management, 2015, 100: 45-55. DOI:10.1016/j.enconman.2015.04.079 |
| [2] | Sun Y Z, Fan J S, Qin P, et al. Pollution extents of organic substances from a coal gangue dump of Jiulong Coal Mine, China[J]. Environmental Geochemistry and Health, 2009, 31(1): 81-89. DOI:10.1007/s10653-008-9158-9 |
| [3] | 国家发展和改革委员会. 中国资源综合利用年度报告(2014)[J]. 再生资源与循环经济, 2014, 7(10): 3-8. DOI:10.3969/j.issn.1674-0912.2014.10.003 |
| [4] | Tong R P, Yang X Y, Su H R, et al. Levels, sources and probabilistic health risks of polycyclic aromatic hydrocarbons in the agricultural soils from sites neighboring suburban industries in Shanghai[J]. Science of the Total Environment, 2018, 616-617: 1365-1373. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.10.179 |
| [5] | Fan J S, Sun Y Z, Li X Y, et al. Pollution of organic compounds and heavy metals in a coal gangue dump of the Gequan Coal Mine, China[J]. Chinese Journal of Geochemistry, 2013, 32(3): 241-247. DOI:10.1007/s11631-013-0628-0 |
| [6] | Chen W H, Liu Y W, Wang H J, et al. Long-term exposure to silica dust and risk of total and cause-specific mortality in Chinese workers:a cohort study[J]. PLoS Medicine, 2012, 9(4): e1001206. DOI:10.1371/journal.pmed.1001206 |
| [7] | Field R W, Withers B L. Occupational and environmental causes of lung cancer[J]. Clinics in Chest Medicine, 2012, 33(4): 681-703. |
| [8] |
李旭华, 王心义, 杨建, 等. 焦作矿区煤矸石山周围土壤和玉米作物重金属污染研究[J]. 环境保护科学, 2009, 35(2): 66-69. Li X H, Wang X Y, Yang J, et al. Review on heavy metal pollution to soil and corn near coal waste rock dump in Jiaozuo diggings[J]. Environmental Protection Science, 2009, 35(2): 66-69. DOI:10.3969/j.issn.1004-6216.2009.02.021 |
| [9] | Ma S C, Zhang H B, Ma S T, et al. Effects of mine wastewater irrigation on activities of soil enzymes and physiological properties, heavy metal uptake and grain yield in winter wheat[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2015, 113: 483-490. DOI:10.1016/j.ecoenv.2014.12.031 |
| [10] | Yun Y, Gao R, Yue H F, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-containing soils from coal gangue stacking areas contribute to epithelial to mesenchymal transition (EMT) modulation on cancer cell metastasis[J]. Science of the Total Environment, 2017, 580: 632-640. DOI:10.1016/j.scitotenv.2016.12.010 |
| [11] | Yang F L, Li G K, Sang N. Embryonic exposure to soil samples from a gangue stacking area induces thyroid hormone disruption in zebrafish[J]. Chemosphere, 2019, 236: 124337. DOI:10.1016/j.chemosphere.2019.07.068 |
| [12] | Sang N, Li G K, Xin X Y. Municipal landfill leachate induces cytogenetic damage in root tips of Hordeum vulgare[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2006, 63(3): 469-473. DOI:10.1016/j.ecoenv.2005.02.009 |
| [13] | Yi H L, Si L Y. Vicia root-mirconucleus and sister chromatid exchange assays on the genotoxicity of selenium compounds[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2007, 630(1-2): 92-96. DOI:10.1016/j.mrgentox.2007.03.003 |
| [14] | 熊庆娥. 植物生理学实验教程[M]. 成都: 四川科学技术出版社, 2003. |
| [15] | 张宪政. 植物叶绿素含量测定——丙酮乙醇混合液法[J]. 辽宁农业科学, 1986(3): 26-28. |
| [16] | 卢龙斗, 常重杰. 遗传学实验技术(修订版)[M]. 北京: 科学出版社, 2007. |
| [17] | Anjum S A, Xie X Y, Wang L C, et al. Morphological, physiological and biochemical responses of plants to drought stress[J]. African Journal of Agricultural Research, 2011, 6(9): 2026-2032. |
| [18] |
李云玲, 侯沁文, 任嘉红. 煤矸石淋滤液对小麦种子及幼苗的生态毒性研究[J]. 西南林业大学学报, 2015, 35(4): 39-45. Li Y L, Hou Q W, Ren J H. Ecotoxicity of coal gangue leaching filtrate on wheat seed and seedlings[J]. Journal of Southwest Forestry University, 2015, 35(4): 39-45. |
| [19] | Akinci I E, Akinci S. Effect of chromium toxicity on germination and early seedling growth in melon (Cucumis melo L.)[J]. African Journal of Biotechnology, 2010, 9(29): 4589-4594. |
| [20] | He H H, Dong Z G, Peng Q, et al. Impacts of coal fly ash on plant growth and accumulation of essential nutrients and trace elements by alfalfa (Medicago sativa) grown in a loessial soil[J]. Journal of Environmental Management, 2017, 197: 428-439. DOI:10.1016/j.jenvman.2017.04.028 |
| [21] | Liu H B, Liu Z L. Recycling utilization patterns of coal mining waste in China[J]. Resources, Conservation and Recycling, 2010, 54(12): 1331-1340. DOI:10.1016/j.resconrec.2010.05.005 |
| [22] | Motesharezadeh B, Ahmadiyan E, Ail Alikhani H, et al. The use of coal gangue as a cultivation bed conditioner in forage maize inoculated with arbuscular mycorrhizal fungi[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2017, 48(11): 1266-1279. DOI:10.1080/00103624.2017.1322602 |
| [23] | Mtisi M, Gwenzi W. Evaluation of the phytotoxicity of coal ash on lettuce (Lactuca sativa L.) germination, growth and metal uptake[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 170: 750-762. DOI:10.1016/j.ecoenv.2018.12.047 |
| [24] | Jablonska B, Kityk A V, Busch M, et al. The structural and surface properties of natural and modified coal gangue[J]. Journal of Environmental Management, 2017, 190: 80-90. |
| [25] | Li J Y, Wang J M. Comprehensive utilization and environmental risks of coal gangue:A review[J]. Journal of Cleaner Production, 2019, 239: 117946. DOI:10.1016/j.jclepro.2019.117946 |
| [26] |
侯沁文. 煤矸石淋滤液对柳叶空心菜幼苗生长的影响[J]. 长治学院学报, 2015, 32(5): 21-26. Hou Q W. Effects of coal gangue leaching filtrate to water spinach germination and seedling growth[J]. Journal of Changzhi University, 2015, 32(5): 21-26. DOI:10.3969/j.issn.1673-2014.2015.05.005 |
| [27] | Pompelli M F, Barata-Luís R, Vitorino H S, et al. Photosynthesis, photoprotection and antioxidant activity of purging nut under drought deficit and recovery[J]. Biomass and Bioenergy, 2010, 34(8): 1207-1215. DOI:10.1016/j.biombioe.2010.03.011 |
| [28] | Yu C L, Deng Q, Jian S Y, et al. Effects of fly ash application on plant biomass and element accumulations:a meta-analysis[J]. Environmental Pollution, 2019, 250: 137-142. DOI:10.1016/j.envpol.2019.04.013 |
| [29] | Martins M N C, De Souza V V, Da Silva Souza T, et al. Genotoxic and mutagenic effects of sewage sludge on higher plants[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016, 124: 489-496. DOI:10.1016/j.ecoenv.2015.11.031 |