2020, Vol. 41
2. 云南省环境监测中心站, 昆明 650100;
3. 昆明科净源科技股份有限公司, 昆明 650228
2. Yunnan Environmental Monitoring Center Station, Kunming 650100, China;
3. Kunming Science and Technology Co., Ltd., Kunming 650228, China
水生态系统的氮素循环是一个复杂的生物化学过程, 细菌和古菌是微生物氮素循环中的主要参与者, 在维持生态系统结构和功能稳定, 能量流动和物质循环转化过程中起着核心作用[1].细菌和古菌的群落结构因不同区域地理气候特征影响呈现时空差异性[2, 3], 细菌和古菌的功能特性及其在生物地球化学循环中的作用, 在一定程度上能够反映水生态系统的状况[4~8].滇池是云贵高原地区最大的淡水湖泊, 近年来滇池正处于由中度富营养向轻度富营养转化的关键时期[9, 10], 氮含量过高是滇池水循环中长期面临的水环境问题[11].以微生物为主导的氮代谢是地球氮循环的主要驱动力[12, 13], 对于水环境中氮素循环转化起到了决定性的作用[14].因此, 要全面了解滇池水生态系统状况, 揭示滇池氮素的生物地球化学循环机制, 对滇池水中细菌和古菌群落结构组成及功能的研究显得尤为重要[15, 16].
随着分子生物学技术的推陈出新, 方便快捷经济可靠的微生物检测技术和方法被越来越多的研究学者所接受[17~19].高通量测序技术能够获得全面的微生物群落信息, 其包含的PICRUSt软件能够更高效准确地解析微生物功能信息[20, 21], 该技术已在淡水生态系统和海洋生态系统中得到良好的应用[22, 23].目前, 研究人员在滇池开展了大量关于微生物的研究工作, 初步探究了滇池细菌群落组成的时空分布特征和影响因素[24, 25], 然而针对滇池水中细菌和古菌氮代谢过程的研究却鲜见报道.因此, 本研究选取滇池草海和外海两个典型区域样品, 基于微生物学角度, 采用16S rDNA高通量测序技术研究滇池水中细菌和古菌群落组成, 预测参与氮循环的细菌和古菌功能基因, 分析滇池不同点位氮循环功能差异, 以期为进一步揭示氮循环机制, 解决氮素污染引起的富营养化提供理论参考.
1 材料与方法 1.1 研究区概况滇池位于云南省昆明市, 流域面积约为2 920 km2, 是我国最为重要的高原湖泊之一.滇池南北长度约39.4 km, 东西宽度约12.7 km, 周长为161.6 km[26].滇池湖体东北部有障壁沙坝, 将湖体分成南北两个部分, 沙坝以北称为草海, 离市区较近, 面积约10 km2, 占滇池湖体总面积的3%, 是昆明市西部区域纳污河道的过水流域；沙坝以南称为外海, 是滇池的主体部分, 面积约289 km2, 占滇池湖体总面积的97%[27].
1.2 研究方法 1.2.1 样品采集根据高原湖泊滇池水文特征, 于2018年1月在滇池的草海和外海区域采集表层水样品.水样选择在滇池表层0.5 m处用采水器采集, 同时取3个平行样品.采样共设置13个采样点, 由北向南依次为, 草海3个采样点, 外海10个采样点, 采样点位置如图 1.
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图 1 滇池采样点位示意 Fig. 1 Sampling sites in Dianchi Lake |
野外采集现场进行了水温及溶解氧浓度检测, 其余水中理化指标检测带回实验室进行.水样经0.45 μm滤膜过滤后, 进行水中理化参数的测定.溶解性总磷(DTP)采用过硫酸钾法测定[28], 采用碱性过硫酸钾消解法测溶解性总氮(DTN), 氨氮(NH4+-N)通过纳氏试剂法测定, 硝态氮(NO3--N)测定通过紫外分光光度法[29].DON通过DTN与NH4+-N和NO3--N浓度差所得.
1.2.3 细菌和古菌群落结构和功能解析将滇池每个点位现场采集的1 000 mL水样置于聚乙烯塑料桶中, 带回实验室, 用于16S rDNA细菌和古菌高通量测序分析.水样通过0.22 μm滤膜后用于水中细菌和古菌DNA提取.细菌的PCR扩增所用的引物已经融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物, 引物分别为341F引物和805R引物, 341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物：GACTGGAG TTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGT ATCTAATCC.古菌引用槽式PCR扩增有三轮, 第一轮使用M-340F, GU1ST-1000R引物扩增：古1st-340F：CCCTAYGGGGYGCASCAG；古1st-1000R：GGCCATGCACYWCYTCTC. PCR结束后进行第二轮扩增.第二轮使用第一轮PCR产物进行扩增, PCR所用的引物已经融合了测序平台的V3-V4通用引物. 349F引物：CCCTACACGACGCTCTTCC GATCTN(barcode)GYGCASCAGKCGMGAAW；806R引物:GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GGACTACVSGGGTATCTAAT.第三轮扩增, 引入Illumina桥式PCR兼容引物, PCR扩增后进行上机测试[30].数据预处理后去除嵌合体及非特异性扩增序列, 最终得到细菌和古菌丰度, 最后通过PICRUSt软件进行基因解释分析, 利用QIIME获得的closed OTU-table与KEGG数据库进行比对, 获得水中细菌和古菌功能信息[31].
1.2.4 数据统计分析采用R语言gplots package建立滇池水中细菌和古菌属水平物种丰度图, 同时基于PICRUSt功能分类结果, 通过STAMP软件, 采用Welch's t-test方法, 比较草海和外海水中微生物存在显著差异的功能分类.
2 结果与讨论 2.1 滇池氮磷浓度的分布特征对滇池13个点位水中理化参数指标进行整理分析如表 1.滇池草海和外海区域水中DTN浓度存在显著差异, 草海水中DTN平均浓度为1.98 mg·L-1, 草海水中NH4+-N和NO3--N浓度分别为0.12 mg·L-1和1.20 mg·L-1, 占草海DTN的质量分数分别为6%和62%, DON占DTN的32%.外海水中DTN平均浓度为1.41 mg·L-1, 外海水中NH4+-N和NO3--N浓度分别为0.10 mg·L-1和0.19 mg·L-1, 占外海DTN的质量分数分别为7%和13%, DON占DTN的80%, DON是外海水中氮的重要形态, 占有较高的比重.草海和外海水中DTP浓度分别为0.06 mg·L-1和0.09 mg·L-1, 草海和外海水中DTP浓度在P < 0.05水平上无显著性差异.草海水中DO浓度平均值为11.62 mg·L-1, 外海水中DO浓度平均值为8.71 mg·L-1, 外海水中DO浓度显著低于草海水中DO浓度.草海和外海区域水温平均浓度变化范围在11.7~12.7℃之间, 滇池平均水温为12.2℃, 滇池整体表层水温变化不大.
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表 1 滇池水中理化参数指标1) Table 1 Physical and chemical parameters in Dianchi Lake |
综合来看, 根据《地表水环境质量标准》(GB 38382-2002), 滇池溶解氧含量高, 符合Ⅰ类地表水标准.草海总氮浓度为Ⅴ类地表水标准, 外海总氮浓度达到Ⅳ类地表水标准, 草海和外海总磷浓度符合Ⅳ类地表水标准.滇池氮磷污染仍较为严重, 但水质状况已有所改善[11, 32].水中营养盐浓度的变化不仅能改变微生物的丰度水平还能显著影响微生物的群落功能[33].董志颖[22]的研究表明, 氮的输入影响了固氮、异化硝酸盐还原、反硝化、异化硝酸盐还原到铵和同化硝酸盐还原相关基因的相对丰度, 氮源输入影响了细菌群落代谢潜力.目前滇池湖体水质状况整体趋稳向好, 对入水中氮素循环的深入了解将有助于滇池水环境改善, 增速滇池水循环的健康发展.
2.2 滇池水中细菌和古菌群落结构特征滇池水中细菌和古菌的群落结构组成如图 2.在滇池水中样品中共获得35门、75纲、143目、274科和427属细菌群落组成, 细菌群落组成在门水平上主要以变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势门类, 变形菌门和拟杆菌门占总细菌群落组成的90%以上.在细菌属水平上, 主要以假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)和不动杆菌属(Acinetobacter)为优势属, 如图 2(a)和2(c).古菌共获得14门、19纲、25目、31科和61属, 古菌群落组成主要以广古菌门(Euryarchaeota)为优势门类, 其次为泉古菌门(Crenarchaeota).在古菌属水平上, 主要以甲烷丝状菌属(Methanothrix)、甲烷细菌属(Methanobacterium)和甲烷绳菌属(Methanolinea)等为优势属类, 如图 2(b)和2(d).滇池细菌和古菌的聚类分析, 如图 2(c)和2(d), 在相似性水平上, 除13号点位外, 草海(1~3号)和外海(4~12号)样品分成两大组, 结果表明不同点位中属水平下细菌和古菌的群落结构存在一定差异.
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图 2 细菌和古菌门和属分类水平下的群落组成 Fig. 2 Community composition at the phylum and genus level of bacteria and archaea |
对水中细菌和古菌微生物多样性进行分析如表 2.高通量测序分析共获得细菌优质序列总数为57 260, 聚类后OTU总数为1 205, 样品文库覆盖率达到0.992；古菌优质序列总数为85 009, 聚类后OTU总数为335, 样品文库覆盖率达到0.999, 表明细菌和古菌测序数据合理, 能够代表样品中物种的丰富度和多样性.采用Chao1指数和ACE指数计算群落分布丰度, Shannon和Simpson指数计算群落分布多样性.结果表明滇池水中细菌和古菌群落多样性指数均较高, 草海中细菌多样性指数高于外海中细菌多样性指数, 滇池所有水中样品中细菌丰度指数高于古菌丰度指数.
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表 2 滇池水中细菌和古菌多样性 Table 2 Richness and diversity of bacteria and archaea in Dianchi Lake |
2.3 滇池水中细菌和古菌功能分类
PICRUSt能较为准确地给出功能基因的存在及其丰度情况.通过PICRUSt对滇池水中细菌和古菌功能构成进行分析, 从而获得滇池不同区域之间微生物功能上差异.基于KEGG数据对比样品中的微生物功能类别, 共获得6大类功能信息, 包括代谢(metabolism)、人类疾病(human diseases)、有机系统(organismal systems)、遗传信息过程(genetic information processing)、细胞进化过程(cellular processes)和环境信息(environmental information processing).草海(CH)样品中细菌和古菌总功能基因的丰度比例均略高于外海(WH)样品中总功能基因的丰度比例.氨基酸代谢功能(amino acid metabolism)、碳水化合物代谢功能(carbohydrate metabolism)以及膜运输功能(membrane transport)在细菌功能组成中所占丰度比例较高[图 3(a)].氨基酸代谢功能(amino acid metabolism)、碳水化合物代谢功能(carbohydrate metabolism)以及能量代谢功能(energy metabolism)在古菌功能组成中所占比例较高[图 3(b)].基于PICRUSt功能三级分类结果, 在显著性水平P < 0.05水平上, 比较草海和外海存在差异的功能丰度比例及95%置信区间内的功能丰度的差异比例, 草海和外海样品中存在显著差异的功能丰度如图 3(c)所示.根据细菌三级功能分类, 草海和外海细菌代谢功能基因存在显著差异, 脂多糖生物合成蛋白质代谢基因所占的丰度比例比其他代谢功能基因更大.根据古菌功能基因三级功能分类, 在P < 0.05水平上类固醇激素生物合成功能基因(steroid hormone biosynthesis)在草海和外海样品中存在显著差异.草海和外海样品在某些与微生物代谢功能相关的基因上表现出了显著差异性.
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图 3 KEGG功能基因组成及差异 Fig. 3 Composition and differences of KEGG functional genes |
滇池水中氮污染情况存在显著差异, 因此进一步研究了滇池水中细菌和古菌参与氮代谢途径的基因(K00910).为了研究滇池水中细菌和古菌参与氮代谢途径的基因, 将滇池水中细菌和古菌的功能基因解释的结果与KEGG数据库中氮代谢直系同源基因进行对比, 以结果中具有基因拷贝数的氮代谢通路基因进行分析, 结果如图 4和图 5.功能基因中共有35个细菌氮代谢功能基因和23个古菌氮代谢功能基因具有数值, 表现出丰富的氮代谢能力[7, 21].在细菌氮代谢基因拷贝数聚类分析中, 在0.97的相似性水平上, 外海北部区域与滇池其他区域分成两个部分.在古菌氮代谢基因拷贝数聚类分析中, 在0.81相似性水平上, 滇池南部13号采样点与滇池其他区域分成两个部分.结果表明, 在滇池不同区域水中细菌和古菌的氮代谢具有差异.
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图 4 细菌和古菌氮代谢通路基因热图 Fig. 4 Heatmap of nitrogen metabolism pathway in bacteria and archaea |
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图 5 细菌和古菌氮代谢途径及关键丰度差异 Fig. 5 Nitrogen metabolism pathway and gene copy number in bacteria and archaea |
根据氮在氮循环中的不同价位变化, 将氮循环中的代谢通路依次进行关键基因丰度分析, 从而了解不同代谢通路中各基因所做的贡献.在细菌中氮异化硝酸盐还原过程中, 亚硝酸盐还原酶基因nirB最为丰富, 滇池外海中nirB基因拷贝数高于草海, 其次是基因nirD和narL, 异化还原酶基因nrfA所含基因拷贝数最少.在氮同化硝酸盐还原过程中, 硝酸还原酶基因nasK拷贝数高于基因nirA、nasB和narB基因.亚硝酸盐同化还原酶基因nirA被认为是导致全球污水处理厂硝酸盐吸收减少的主导基因, 在滇池水中细菌硝酸盐吸收中, 也起到了一定的作用.反硝化作用中一氧化氮还原酶基因norB丰度最高, 其次是硝酸还原酶基因narG, 亚硝酸还原酶基因nirK、norC和narH基因, 反硝化作用途径的氧化亚氮还原酶的编码基因nosZ、异化还原酶基因napA和napB基因与同途径基因呈现显著差异.硝化作用基因显著低于上述氮代谢中的其他基因.古菌氮循环过程中, 固氮酶基因nifH、nifK和nifD在固氮中起重要作用, 古菌固氮作用中固氮酶基因拷贝数远高于细菌中固氮基因拷贝数.针对于PICRUSt基因预测古菌与细菌固氮酶基因的研究较少.固氮酶是一种催化N-2还原的功能恒定蛋白, 存在于古细菌和细菌的许多系统发育谱系中[34].大多数生物固氮是由分布在细菌和古细菌中的含钼固氮酶催化的.尽管从各种细菌和古细菌中纯化出来的钼固氮酶的生化特性和结构非常相似, 但是重氮营养菌之间合成、组装和维持其活性的遗传要求却大不相同.在固氮细菌和古细菌中, 使重氮营养生长所需的nif基因的互补序列差异很大[35].
3 结论(1) 滇池水中细菌主要以变形菌门和拟杆菌门为优势门类, 古菌主要以广古菌门为优势门类.滇池全湖细菌丰富度指数高于古菌丰富度指数, 草海中细菌多样性指数高于外海中细菌多样性指数.
(2) PICRUSt功能解析出滇池水中细菌和古菌功能上的丰富性, 草海中古菌氮代谢能力整体高于外海, 滇池水中古菌比细菌固氮潜能更大.
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