2020, Vol. 41
2. 南阳师范学院生命科学与技术学院, 南阳 473061;
3. 生态环境部南京环境科学研究所, 南京 210042
, LI Ying-jun2 , SHAO Yang2 , LIN Li-an2 , XU Ge2 , CHEN Yan2 , TIAN Wei3 , YAO Lun-guang1 , HAN Hui1
2. School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China;
3. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China
由于矿山开采、重金属污水灌溉等原因, 我国约1/5面积的耕地受不同程度重金属污染, 严重影响我国粮食安全[1].因此, 土壤重金属污染治理与修复迫在眉睫[2, 3].轻微、轻度污染的农田可通过物化稳定-低吸收作物联合阻控、农艺调控等措施改变重金属在土壤中的存在形态, 降低其迁移性和生物可利用性, 减少植物吸收富集, 实现边修复边利用[4, 5].其中微生物固定重金属修复技术, 具有环境友好、无二次污染等特点, 逐渐成为国内外研究的热点[6~10].有研究表明细菌通过钝化作用可使重金属在土壤中沉淀或被吸附固定, 改变土壤重金属赋存形态, “钝化”其生物有效性, 从而降低植物对重金属的吸收和转运.Xu等[11]的研究表明Enterobacter cloacae TU对Cd的吸附率高达97%, 吸附的Cd主要位于胞外, 其胞外聚合物中的O—H、N—H和S—H是Cd结合的主要位点.细菌具有分泌吲哚乙酸(IAA)、1-氨基环丙烷-1-羟酸(ACC)脱氨酶、溶磷等植物促生特性, 能与生物炭、有机肥等其他固定剂联合使用, 取长补短, 降低吸收植物重金属同时提高植物生物量、品质等, 具有较好的应用前景[9].Dary等[12]的研究发现接种植物促生菌(Bradyrhizobium sp.750、Pseudomonas sp.和Ochrobactrumcytisi cytisi)能够缓解重金属对于黄羽扇豆(Lupinus luteus)毒害作用, 显著增加其生物量, 并且显著降低植物根部重金属(Cd、Pb、Zn和Cu)含量与地上部重金属(Cd和Pb)含量.Wang等[13]的研究发现生物炭与植物促生细菌Neorhizobium huautlense T1-17联合施用能够显著增加蔬菜生物量, 并且显著降低蔬菜可食用部位Cd和Pb浓度.
新乡市是我国电池生产的重要基地, 被授予“中国电池工业之都”.由于电池行业重金属耗用量大, 长期生产容易造成周边土壤、水体重金属超标.据调查新乡市环宇大道工业区周边土壤Cd含量超标176.85倍, 小麦中重金属Cd含量超标1.7~12.8倍[14, 15].重金属污染土壤中具有丰富的微生物群落组成, 为生物修复提供了微生物资源[10, 16].因此, 本研究以新乡Cd污染土壤为研究对象, 采用高通量测序和平板分离方法分析其细菌群落组成, 并测定Cd固定细菌降低青菜富集Cd效果, 以期为新乡市重金属污染土壤修复提供菌种资源, 同时为重金属污染土壤细菌群落和功能提供参考依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集根据相关资料, 以河南省新乡市郊区某电池厂为中心, 设置厂旁(编号CP, 电池厂600 m外土壤)、河道(HD, 电池厂3 km外河道)和农田(NT, 电池厂3 km外农田)这3个采样点, 采用土钻采集Cd污染土壤.去除土样中的植物和动物残体等杂质后测定土壤理化性质, 厂旁样品理化性质为：pH值6.03、有机质24.42 g·kg-1、总磷6.55 g·kg-1、总氮7.43 g·kg-1和总钾12.35 g·kg-1, 河道样品理化性质为：pH值6.73、有机质22.48 g·kg-1、总磷3.46 g·kg-1、总氮5.83 g·kg-1和总钾9.67 g·kg-1, 农田样品理化性质为：pH值6.67、有机质20.62 g·kg-1、总磷2.53 g·kg-1、总氮5.44 g·kg-1和总钾5.52 g·kg-1.采用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)测定土壤Cd, 结果表明厂旁、河道和农田样品Cd含量分别为24.2、7.5和0.8 mg·kg-1, 根据《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018)分析评价, 土壤镉污染达到重度或中度污染.
1.2 高通量测序和分子生态网络分析土壤细菌总DNA采用美国MP公司FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒提取.采用通用引物(338F/806R)对细菌16S rRNA基因的V3~V4区进行PCR扩增, 具体PCR扩增体系和反应条件参照文献[17].修饰后的通用引物含有不同的Tag标签用以区分不同样品, 利用上海美吉生物医药科技有限公司的MiSeq PE300测序仪(Illumina Inc, San Diego, CA, USA)完成序列测定.高通量数据的生物信息学分析采用QIIME(quantitative insights into microbial ecology)进行, 根据序列的相似度, 将序列归为多个OTU(operational taxonomic unit), OTU产出后, 统计各个样品含有OTU情况及每个OTU中含有序列的数目, 得到每个OTU的分类学信息[18].采用LEfSe在线工具寻找组与组之间有统计学差异的生物标志物[19].分子生态网络分析选取随机矩阵理论(random matrix theory, RMT), 在Molecular Ecological Network Analyses Pipeline(MENAP, http://ieg2.ou.edu/MENA/main.cgi)上完成[20, 21].利用软件Cytoscape 3.7.0对网络进行可视化处理, 得到可视网络结构图及相关信息, 包括类别、模块化属性、相关性和模块枢纽等[22].在可视化网络结构中, 节点代表群落中的种群, 节点之间的连线代表种群之间的相互作用关系(正、负相关性等).
1.3 可培养细菌分离和鉴定可培养细菌分离采用稀释梯度平板法, 将取1.0 g土壤加入100 mL无菌水中, 稀释到合适梯度, 取100 μL涂布于LB培养基.根据菌落形态、颜色、大小分别挑取不同细菌, 在平板上划线纯化.参考Sun等[23]的方法提取细菌基因组DNA, 采用通用引物27F和1492R对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增, PCR产物送公司进行序列测定.将测序结果与EzBioCloud网站(https://www.ezbiocloud.net)模式菌株的16S rRNA基因序列相比对, 判定菌株所属类群.菌株产IAA能力采用Salkowski显色法进行测定[24], ACC脱氨酶测定参照文献[25].
1.4 菌株吸附Cd能力测定将Cd质量浓度为5 mg·L-1的培养基50 mL分装到三角瓶中, 按1%的比例接种培养至对数生长期的供试菌株菌悬液, 30℃、180 r·min-1条件下摇床振荡培养24 h.培养结束后取5 mL发酵液, 5 000 r·min-1离心5 min, 采用ICP-OES测定上清液中Cd的质量浓度.通过计算得出各个菌株对Cd的吸附率, 计算公式如下：
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式中, c0表示溶液中重金属的初始质量浓度, mg·L-1；cs表示供试菌株上清液中重金属质量浓度, mg·L-1.
1.5 菌株降低青菜富集重金属效果实验采集南阳市西郊无污染农田土壤, 风干后过20目筛, 去除植物组织和石块, 加入分析纯CdSO4·8H2O使土壤中Cd的浓度分别为10 mg·kg-1, 充分混合并放置1个月, 将300 g土样加入350 mL塑料杯中.选取表面消毒的青菜(品种为鸡毛菜)种子, 种植于塑料杯, 每盆留苗2株.待苗长至5 cm时, 选取1.3节和1.4节实验中筛选到高效固定Cd的菌株作为供试菌株进行接种.供试细菌接种于液体LB培养基中, 振荡培养至对数生长期后期, 菌液离心收集菌体, 用无菌去离子水清洗两遍, 使细胞悬液中菌体数量约为108 cfu·mL-1, 用无菌镊子将植物根部四周表层土壤挖开, 沿着植物根系接种10 mL菌悬液.种植50 d后, 从盆中小心取出植物, 根部用去离子水充分洗净, 将植物根部浸泡于0.01 mol·L-1EDTA-2Na溶液中10 min, 以去除植物根表面吸附的重金属离子及沉淀.样品置于烘箱中105℃烘干, 沿根茎结合处分离根部、茎部和叶部, 称取植物干重, 采用ICP-OES测定植物组织中Cd含量.
2 结果与分析 2.1 高通量测序分析细菌群落组成 2.1.1 高通量测序结果及多样性的评估厂旁、河道和农田的3样品测序条带均高于27 000条, 样品的文库覆盖率高于99.00%, 稀释性曲线趋向平稳, 表明测序数据量合理, 能够代表物种的丰富度.实际观测到的OTU数Sobs排序为厂旁>农田>河道, 均达到显著差异水平(P < 0.05).对群落丰富度和多样性指数(Chao1、ACE、Shannon、Simpson)进行分析, 结果表明Chao1、ACE和Shannon指数为厂旁最高, 河道最低, Simpson指数与之相反(表 1).综合Sobs、群落丰富度和多样性指数, 新乡重金属污染土壤细菌多样性排序为厂旁>农田>河道.
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表 1 不同样品细菌多样性评估1) Table 1 Estimation of bacterial community diversity in different samples |
2.1.2 细菌群落组成及Beta多样性分析
高通量测序结果表明, 厂旁样品由20门、43纲、93目、170科和198属组成；河道样品由22门、45纲、97目、166科和276属组成；农田样品细菌由19门、42纲、81目、128科和201属组成.门的水平上包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、Saccharibacteria和疣微菌门(Verrucomicrobia)等(图 1).其中变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门为优势种群, 总占比为74.94%~81.36%.属的水平上鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、Skermanella、硝化螺旋菌(Nitrospirae)、Steroidobacter、Bryobacter等属的细菌占比超过1.00%.
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图 1 不同样品门水平上物种相对丰度分布 Fig. 1 Relative read abundance of bacterial community structures at the phylum levels in different samples |
采用非加权组平均聚类分析(UPGMA)对不同样品β多样性进行分析, 结果如图 2所示.在0.2的相似性水平上, 厂旁、河道和农田样品各自分开, 分为3大组, 结果表明不同样品细菌群落结构有所差异.其中厂旁和农田样品在UPGMA聚类图中更为接近, 河道样品细菌群落差异最大.
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图 2 不同样品UPGMA聚类 Fig. 2 UPGMA clusters of different bacterial communities |
为分析不同样品差异细菌组成, 采用LEfSe软件寻找各组间差异的细菌种类, 图 3所示在LDA score大于3.5时不同组中相对丰度差异显著的物种.在门的水平上, 农田样品硝化螺旋菌(平均占比2.54%)显著高于厂旁(1.30%)和河道样品(0.66%).在属的水平上, 厂旁样品中变形菌门的德沃斯氏菌(Devosia)存在显著差异；河道样品中放线菌门的Nocardioides、大理石雕菌(Marmoricola)、冷杆菌(Cryobacterium), 拟杆菌门的Arcticibacter, 芽单胞菌门的Longimicrobium, 变形菌门的马赛菌(Massilia)存在显著差异.
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图 3 不同样品差异细菌分布 Fig. 3 Taxa with statistical differences between different bacterial communities |
将厂旁、河道和农田样品高通量测序得到的细菌相对丰度表基于RMT方法构建分子生态网络, 采用Cytoscape 3.7.0软件进行可视化分析, 具体如图 4所示.其中每个节点代表一个OTU, 节点之间颜色(红色或者蓝色)代表正负相关关系, 由此显示细菌之间的相互联系.网络的基本属性为：相关性阈值(similarity threshold)为0.970、节点数(total nodes)为449个、连接数为(total links)为1352、幂律分布系数(R2)为0.904、平均群聚系数(average clustering coefficient)0.226、平均路径长度(average path length)为4.318、模块性(modularity)为0.531.在分子生态网络的拓扑结构中, 不同节点的拓扑学角色可以作为识别关键微生物的依据.参考Deng等[26]的研究, 将模块内连通度Zi≥2.5或是模块间连通度Pi≥0.62的所有节点定为关键细菌(key bacteria), 这些细菌在各自的大模块中起着联系模块内部细菌的重要作用.关键细菌分别为放线菌门的Arthrobacter(OTU15, Zi=-0.112、Pi=0.686)、Marmoricola(OTU376, Zi=-0.181、Pi=0.625)、Nocardioides(OTU2187, Zi=-0.37、Pi=0.750)；拟杆菌门的Ferruginibacter(OTU2019, Zi=2.568、Pi=0.244)、Flavitalea(OTU2336, Zi=2.504、Pi=0.314)；厚壁菌门(Firmicutes)的Clostridium_sensu_stricto_1(OTU1474, Zi=0.874、Pi=0.659)；硝化螺旋菌门(Nitrospira)的Nitrospira(OTU1038, Zi=2.568、Pi=0.628)；变形菌门的G55(OTU2376, Zi=-0.613、Pi=0.625)和Lysobacter(OTU1235, Zi=3.041、Pi=0.593).
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图中每个节点代表一个OTU，节点颜色与右侧相同颜色门分类单元对应，节点之间的红色或者蓝色连线代表OTU之间正、负相关关系 图 4 新乡重金属污染土壤细菌生态网络 Fig. 4 Overview of the bacterial networks in the heavy metal contaminated soils in Xinxiang City |
平板上生长的细菌, 根据菌落形态、颜色、大小分别挑取不同细菌, 经纯化、保藏最终从厂旁、河道和农田样品中各成功分离到菌株52株、52株和55株, 共计159株细菌.对其16S rRNA基因进行PCR扩增, 序列测定, 并与EzBioCloud网站中模式菌株进行比对, 确定其分类学地位, 结果如图 5所示.结果表明, 可培养细菌分布于厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门这4个门, 其中厚壁菌门、放线菌门和变形菌门在3个样品中占比均高于18.87%, 为其主要组成.与高通量测序的变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门为优势组成结果相比, 有所差异(图 1).可培养细菌属的水平上由芽孢杆菌属(Bacillus)、Pseudarthrobacter、节杆菌属(Arthrobacter)、Paenarthrobacter、根瘤菌属(Rhizobium)、Paenibacillus和剑菌属(Ensifer)等30个属组成(图 5).不同样品可培养细菌群落组成有所差异, 其中芽孢杆菌属在厂旁、河道和农田样品中菌株数分别为16、24和14, 为优势组成.厂旁样品由15个属组成, 其中Pseudarthrobacter(株菌数6株, 下同)、节杆菌属(5株)、Paenarthrobacter(4株)、Aneurinibacillus(3株)和根瘤菌属(3株)占比较高；河道样品由11个属组成, 其中微杆菌属(Microbacterium, 7株)、剑菌属(5株)、节杆菌属(4株)、假单胞菌属(Pseudomonas, 3株)和Pseudarthrobacter(2株)占比较高；农田样品由19个属组成, 其中节杆菌属(7株)、假单胞菌属(6株)、微杆菌属(5株)、Chitinophaga(3株)和寡养单胞菌(Stenotrophomonas, 3株)占比较高.
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图 5 不同样品中可培养细菌在门和属上的群落结构 Fig. 5 Community structure of culturable bacteria at the phylum and genus level of different samples |
对厂旁、河道和农田样品分离得到的159株细菌进行摇瓶吸附实验, 通过测定上清液中Cd的质量浓度, 得出菌株对溶液中Cd的吸附率.结果表明大多数菌株具有不同程度Cd吸附能力, 吸附率介于0~65.56%之间.以Cd吸附率大于25%为分界线, 分析具有较高吸附能力的菌株群落组成和分类学地位, 结果如图 6所示.厂旁、河道和农田样品Cd吸附率大于25%菌株数分别为17、8和5株, 分别占各自总细菌的32.68%、15.38%和9.09%.这些细菌主要分布于Aneurinibacillus、Arthrobacter、芽孢杆菌属、Chitinophaga和假单胞菌属等11个属(图 6).厂旁样品Cd吸附率细菌主要为芽孢杆菌属(4株)、Aneurinibacillus(3株)和根瘤菌属(2株), 其中菌株Ochrobactrum sp. 1-6、Bacillus sp. 2-28、Rhizobium sp. 1-3和Pseudomonas sp. 1-9的吸附率高于50%；河道和农田样品主要Cd吸附率细菌分别为假单胞菌属(3株)和孢杆菌属(2株).以上结果表明Cd污染高的土壤中, 具有重金属固定能力的细菌种类更为丰富, 占可培养细菌比例更高.
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图 6 不同样品中Cd固定能力大于25%的菌株在属水平上的分布 Fig. 6 Community structure of the Cd-immobilizing bacteria at the genus level of different samples |
从30株高效吸附菌株中挑选出6株吸附率高于40%的菌株用于效果实验(表 2).经比对, 这6株菌分别与根瘤菌属Agrobacterium deltaense YIC 4121T(菌株编号：1-3, 下同)、Ochrobactrum属Ochrobactrum anthropic ATCC 49188T(1-6)、假单胞菌属Pseudomonas yamanorum 8H1T(1-9)和芽孢杆菌属Bacillus tequilensis KCTC 13622T(2-28)、Bacillus pseudomycoides DSM 12442T(2-11)、Bacillus wiedmannii FSL W8-0169T(2-12)相似度最高.供试菌株均能产生ACC脱氨酶, 能产不同量的IAA(33.45~62.87 mg·kg-1), 表明供试菌株具有植物促生特性.土壤接种实验表明, 供试菌株接种能提高青菜生物量, 根部提高比例36.92%~95.18%, 茎部和叶部除Bacillus sp. 2-28外, 提高比例分别为0.81%~27.52%和9.25%~26.63%.青菜不同组织中Cd含量测定结果表明, 供试菌株接种能降低青菜不同组织中的Cd含量, 根、茎和叶降低比例分别为14.67%~54.84%、34.06%~63.09%和4.52%~25.96%.不同菌株对青菜促生或Cd固定效果有所差异, 其中菌株Ochrobactrum sp. 1-6和Bacillus sp. 2-11对青菜生物量具有较好的促生效果, Pseudomonas sp. 1-9对青菜不同组织中Cd含量均具有较好的固定效果, Agrobacterium sp. 1-3和Bacillus sp. 2-11对茎部Cd含量均具有较好的固定效果(分别降低63.09%和49.88%), Bacillus sp. 2-12和Ochrobactrum sp. 1-6对叶部Cd含量均具有较好的固定效果(分别降低25.96%和20.00%).
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表 2 供试菌株促生特性及其对青菜各组织Cd含量的影响1) Table 2 Growth promotion characteristics of the heavy metal-immobilizing bacteria and its effect on the Cd concentration in Pak Choi |
3 讨论
土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分, 其群落结构是土壤生态功能的基础[27].新乡市因长期电池生产, 造成部分电池生产厂周边土壤重金属污染严重[14, 15].目前针对新乡市重金属污染土壤细菌群落组成研究较少开展[16].土壤微生物中很多具有丰富的功能, 如能产生植物激素(IAA等)和活化土壤中的矿质营养元素(溶磷和解钾等)的植物促生细菌, 能通过沉淀、吸附固定重金属的细菌, 纯培养菌株的获得是这些微生物资源开发利用的重要前提和关键因素[28].采用传统培养方法共从新乡市重金属污染土壤中分离159株细菌, 经鉴定分布于厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门这4个门, 芽孢杆菌属、节杆菌属和根瘤菌属等30个属, 表明其具有较为丰富的可培养细菌群落.有研究表明芽孢杆菌属、根瘤菌属、微杆菌属、节杆菌属和Chryseobacterium等出现在重金属污染土壤中, 同时具有植物促生特性、重金属固定或活化能力, 在重金属污染土壤植物-微生物联合修复中起到重要作用[29, 30].由于绝大多数的微生物不能纯培养(>99%), 本实验同时采用高通量测序对细菌群落进行分析[31].与曹荣等[32]的研究结果类似, 高通量结果表明新乡市重金属污染土壤细菌由25门400属组成, 相较于培养方法, 群落组成更为丰富.可培养和高通量测序细菌群落组成分析表明, 可培养细菌群落绝大多数同时出现在高通量测序的结果中, 但因所采用的培养基组成等所限, 很多关键种群未能分离得到.高通量测序技术及其分子生态网络在微生物生态研究中的关键种群识别和微生物之间相互作用等方向得到良好的应用[33~35].本实验样品分子生态网络分析表明, 关键细菌为: Arthrobacter、Marmoricola、Nocardioides、Ferruginibacter和Flavitalea等.比对可培养细菌可以发现, 除Arthrobacter和Nocardioides外, 其他关键细菌均未分离培养得到.因此后续实验可针对这些关键细菌种群, 参照KOMODO数据库(http://komodo.modelseed.org/default.htm)等[36]针对性设计、优化培养基, 以此指导重要功能菌株的筛选, 同时根据细菌正负相互作用构建功能菌群, 提高修复效率[34].
重金属进入土壤后, 某些种类的微生物能适应环境压力, 并能通过钝化作用使重金属在土壤中沉淀或被吸附固定, 改变土壤重金属赋存形态, 降低植物对重金属的吸收[9, 37].为了研究新乡市重金属污染土壤细菌固定细菌种群分布, 对分离的菌株进行摇瓶吸附实验.结果表明芽孢杆菌属、根瘤菌属、假单胞菌属等11个属具有较高吸附能力, 该结果表明所采集的新乡市重金属污染土壤蕴含较为丰富的可固定重金属的细菌(图 6).这与之前报道的芽孢杆菌属[38]、根瘤菌属[39]、假单胞菌属[40]、Arthrobacter[41]、Ochrobactrum[42]和Neorhizobium[43]具有重金属固定能力, 能降低植物富集重金属的研究结果一致.对不同样品高效吸附(>25%)的菌株占总细菌比例分析发现, 厂旁、河道和农田样品比例分别为32.68%、15.38%和9.09%, 表明随着重金属污染的加重, 能高效固定重金属的细菌比例明显提升.细菌通过产生胞外聚合物等物质固定土壤重金属, 这是其耐受高浓度重金属的机制之一, 因此随着土壤重金属浓度的增加, 具有重金属固定能力的菌株得以富集, 比例有所提升[44].选取6株高效固定菌株进行效果验证实验, 结果表明供试菌株均能不同程度提高青菜生物量, 同时能降低青菜Cd含量.不同菌株提高青菜量和降低Cd含量有所差异, 可能与其具体的固定机制有关, 需后续研究证实.
4 结论(1) 传统培养方法表明新乡市重金属污染土壤由厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门这4个门, 芽孢杆菌属、节杆菌属、根瘤菌属等30个属组成；高通量测序表明其由变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门等25门, 鞘氨醇单胞菌、Skermanella和硝化螺旋菌等400属组成.
(2) 基于高通量测序的分子生态网路分析新乡市重金属污染土壤关键细菌分别为: Arthrobacter、Marmoricola、Nocardioides、Ferruginibacter、Flavitalea、Nitrospira和Lysobacter等组成.
(3) 可培养菌株Cd摇瓶吸附实验表明Aneurinibacillus、Arthrobacter和芽孢杆菌属等11个属的30株菌具有较好的固定效果.效果验证实验表明, 6株高效菌株能提高青菜生物量和降低青菜不同组织中的Cd含量.
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