2020, Vol. 41
厌氧条件下, 厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)以亚硝态氮为电子受体, 直接将氨氮转化为氮气.与传统脱氮工艺相比, 该工艺更加环保且经济有效, 适于处理高氨氮污废水[1].但厌氧氨氧化菌世代时间长(9~11 d)[2], 对环境条件要求苛刻[3], 尤其是对重金属[4, 5]、抗生素[6]、硫化物[7]、高溶解氧[8]和高盐度[9]等物质敏感度高.一些高氨氮污水, 比如垃圾渗滤液[10]、金属冶炼废水和新能源生产废水等[11], 通常含有高浓度的重金属, 主要包括Cu、Zn、Pb、Ni、Co和Mo[12, 13].应用ANAMMOX工艺处理这类污废水将会受到一定程度限制.因此, 有必要明确污水中存在的物质对ANAMMOX的影响.
目前, 重金属对各类脱氮工艺影响的研究很多.Daverey等[14]指出Zn(Ⅱ)对SNAD(厌氧氨氧化和反硝化)的抑制阈值为6.9 mg·L-1, Yang等[15]报道向ANAMMOX系统中投加5 mg·L-1的Cu(Ⅱ)会在短时间内导致ANAMMOX细菌细胞裂解, SAA降低94%.Hu等[16]探讨了Zn(Ⅱ), Ni(Ⅱ)和Cr胞外吸附量和胞内积累量与硝化抑制百分比之间的关系.Chen等[17]通过批次实验得出Ni(Ⅱ)的浓度低于1.74 mg·L-1时, SAA提高了63.5%.Ni(Ⅱ)作为金属蛋白酶和其他辅酶合成的重要辅助因子, 对微生物的生长代谢有重要意义[17], 而高浓度的Ni(Ⅱ)会与官能团作用破坏蛋白质结构, 抑制微生物的正常代谢[18].目前, 工业废水和市政污水中Ni(Ⅱ)的浓度范围为3.8~183.56 mg·L-1[19], 远高于微生物生命活动所需要的浓度.然而, Ni(Ⅱ)对ANAMMOX工艺影响的研究尚未完全展开, 相关报道鲜见.
研究Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的影响对于该工艺在含镍高氨氮污水处理领域的应用具有重要意义.因此, 本文主要研究了：①Ni(Ⅱ)对ANAMMOX脱氮性能的短期影响及性能恢复；②Ni(Ⅱ)在ANAMMOX系统中的分布与脱氮抑制的关系；③Ni(Ⅱ)作用下ANAMMOX动力学特征的变化；④Ni(Ⅱ)对ANAMMOX脱氮性能的长期影响.
1 材料与方法 1.1 进水水质和颗粒污泥本实验采用人工配水, 其中的NH4+-N和NO2--N分别由NH4Cl和Na2NO2提供.Ni(Ⅱ)以NiCl2·6H2O的形式按需投加.批次实验的ANAMMOX污泥来自启动成功的实验室规模的UASB反应器, 反应器的负荷(以TN/VSS计)大约为0.5 g·(g·h)-1.
1.2 批次实验批次实验在250 mL的血清瓶中进行, 其有效体积为180 mL.污泥用0.1mol·L-1的NaCl洗涤溶液洗涤3次, 逐滴投加HCl(1 mol·L-1)或NaOH(2 mol·L-1)将pH调节至7.0±0.2.用高纯氮气除氧5 min, 然后将血清瓶置于(35±1)℃和120 r·min-1的恒温振荡培养箱.以规定的时间间隔取样测定三氮的浓度和溶液中Ni(Ⅱ)的浓度.
1.2.1 Ni(Ⅱ)对ANAMMOX脱氮性能的短期影响及恢复性能Ni(Ⅱ)的浓度梯度为0、1、5、10、25、50和100 mg·L-1.实验结束时, 保留污泥样品用于测定MLVSS、肼脱氢酶(HDH)活性、蛋白质浓度、胞外吸附的Ni(Ⅱ)浓度和胞内Ni(Ⅱ)浓度.恢复阶段用改良的EDTA洗涤程序[20]洗涤每个血清瓶中的ANAMMOX污泥, 实验时每24 h更换新鲜底物, 每24 h取样测定三氮的浓度.
1.2.2 动力学特征确定Ni(Ⅱ)对ANAMMOX动力学特征的影响, 表征底物浓度与总氮(TN)去除速率q的关系, 底物(NH4+-N, NO2--N)的浓度(mg·L-1)为：(35, 46)、(55, 73)、(75, 99)、(105, 139)、(125, 165)、(150, 198)、(200, 264)、(250, 330)、(300, 396)和(400, 528), Ni(Ⅱ)的浓度为50 mg·L-1.
1.3 连续流实验实验在稳定运行的UASB反应器中分6个阶段进行, 每阶段进行20 d, 包括P0、P1、P2、P3、P4和P5.将P0设定为控制相, P1、P2、P3和P4阶段Ni(Ⅱ)的浓度分别为1、5、10和15 mg·L-1, P5终止添加Ni(Ⅱ), 以考察ANAMMOX在长期Ni(Ⅱ)抑制后的自我恢复能力.每日取样测定三氮的浓度.
1.4 测定项目和方法氨氮通过纳氏试剂分光光度法测定, 亚氮通过N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定, 硝氮通过紫外分光光度法测定；溶液中Ni(Ⅱ)的浓度通过丁二酮肟分光光度法测定.其他指标测定方法如下.
(1) 胞内Ni(Ⅱ)浓度的测定批次实验结束时从血清瓶中取出1 g(湿重)颗粒污泥, 用改进的EDTA洗涤程序[20]洗涤.利用HNO3(4 mol·L-1)消解污泥样品, 以120 r·min-1消解25 min.然后, 在22 000 g下, 离心15 min以获得上清液.通过ICP Instrument Perkin Elmer OES Optima 2000 DV测定上清液中Ni(Ⅱ)的浓度.
(2) 肼脱氢酶(HDH)活性的测定批次实验结束时从血清瓶中取出5 g(湿重)颗粒污泥, 在22 000 g, 4℃下离心20 min, 用磷酸钠缓冲液(20 mmol·L-1, pH7.0)洗涤两次.然后将洗涤后的污泥重悬于20 mL相同的缓冲液中冷冻24 h, 超声处理(225 W, 4℃, 30 min).混合物在22 000 g, 4℃下离心30 min以获得上清提取液, 用于测定蛋白质浓度和HDH活性.根据改良的Bradford方法[21]测量蛋白质浓度.HDH活性酶促反应体系共3 mL, 依次加入1.5 mL磷酸缓冲溶液(200 mmol·L-1), 0.3 mL细胞色素c(500 μmol·L-1), 1.0 mL肼(75 mmol·L-1)和0.2 mL提取液, 在550 nm处测得吸光度.HDH活性的单位(以还原的细胞色素c/蛋白质计)为:μmol·(min·mg)-1.
1.5 方程和模型 1.5.1 SAA的确定比厌氧氨氧化活性[SAA, 以TN/VSS计, mg·(g·h)-1]：
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(1) |
式中, cTN(始)和cTN(末)是反应开始和反应结束时的总氮浓度(mg·L-1), V为血清瓶的容积(mL), MLVSS为污泥浓度(mg·L-1).
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(2) |
式中, SAAi为实验组的SAA, SAA0为对照组的SAA.
1.5.2 IC50的确定(1) 线性回归方程
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(3) |
式中, SAA0和SAAi是对照组[不含Ni(Ⅱ)]和实验组[含不同浓度的Ni(Ⅱ)]的SAA.当IP=50%时, 对应Ni(Ⅱ)的浓度即为IC50.
(2) 指数回归方程
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(4) |
式中, cNi(Ⅱ)是Ni(Ⅱ)的浓度(mg·L-1), IC50是半抑制浓度(mg·L-1), a是拟合参数.
1.5.3 动力学模型(1) Monod模型
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(5) |
式中, qmax是最大TN去除速率[以TN/VSS计, mg·(g·h)-1], q是TN去除速率[以TN/VSS计, mg·(g·h)-1], KS是半饱和浓度(mg·L-1), S是底物浓度(mg·L-1).
(2) Haldane模型
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(6) |
式中, qmax是最大TN去除速率[以TN/VSS计, mg·(g·h)-1], q是TN去除速率[以TN/VSS计, mg·(g·h)-1], KS是半饱和浓度(mg·L-1), S是底物浓度(mg·L-1), Ki是抑制系数.
1.5.4 生物抑制模型引入饱和型生物抑制模型研究胞内Ni(Ⅱ)的浓度对ANAMMOX脱氮抑制比之间的关系：
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(7) |
式中, IPmax是最大抑制程度(100%), cNi(Ⅱ)是胞内累积的Ni(Ⅱ)含量[以VSS计, mg·g-1], K是抑制系数.
1.5.5 抑制类型判定方程Ni(Ⅱ)对ANAMMOX抑制的类型可以通过应用方程式(8)和(9)来判断.
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(8) |
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(9) |
式中, qmax0和qmax分别是ANAMMOX反应不投加Ni(Ⅱ)和投加50 mg·L-1 Ni(Ⅱ)时的最大TN去除速率[以TN/VSS计, mg·(g·h)-1]；KS0和KS分别是ANAMMOX反应不投加Ni(Ⅱ)和投加50 mg·L-1 Ni(Ⅱ)时的饱和浓度(mg·L-1)；K*和KS*分别是K和KS的抑制系数.
2 结果与讨论 2.1 Ni(Ⅱ)对ANAMMOX脱氮性能的短期影响及性能恢复向ANAMMOX系统中投加不同浓度的Ni(Ⅱ)后NH4+-N和NO2--N的浓度随反应时间的变化如图 1(a)和图 1(b)所示.投加1 mg·L-1 Ni(Ⅱ)时, NH4+-N和NO2--N的浓度分别为0.64 mg·L-1和2.03 mg·L-1, 与不投加Ni(Ⅱ)相比, 去除率分别提高了8.75%和5.84%；比厌氧氨氧化活性(SAA)[以TN/VSS计, mg·(g·h)-1]由8.46 mg·(g·h)-1提高到9.10 mg·(g·h)-1, 增强了11.14%, 肼脱氢酶(HDH)活性由21.46提高到23.31 μmol·(min·mg)-1, 提高了8.56%[图 1(c)].这表明投加适当浓度的Ni(Ⅱ)可以提高ANAMMOX生物质细胞中HDH活性.这类酶能够催化ANAMMOX反应, 促进联氨转化为氮气的过程[22].HDH活性的提高有助于ANAMMOX脱氮性能的提高.因此, 投加低浓度的Ni(Ⅱ)(1 mg·L-1)对ANAMMOX有促进作用.Chen等[17]也证实了低浓度的Cu(1 mg·L-1)、Ni(Ⅱ)(1.74 mg·L-1)和Fe(3.68 mg·L-1)均能提高ANAMMOX性能.Ni(Ⅱ)是F430酶的重要成分, F430酶是产甲烷过程中催化多种反应的关键酶, 废水中Ni(Ⅱ)浓度的增加可能会刺激F430酶的合成, 促进甲烷的产生.
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(a)NH4+-N浓度随时间的变化；(b)NO2--N浓度随时间的变化；(c)SAA、HDH活性和蛋白质随Ni(Ⅱ)浓度的变化；(d) ANAMMOX性能恢复 图 1 Ni(Ⅱ)的浓度对ANAMMOX脱氮性能的短期影响 Fig. 1 Short-term effects of Ni(Ⅱ) concentration on ANAMMOX |
随着Ni(Ⅱ)的浓度提高, 反应结束时NH4+-N和NO2--N的浓度不断升高, 表明ANAMMOX脱氮性能受到了不同程度的抑制.投加100 mg·L-1 Ni(Ⅱ), NH4+-N和NO2--N的浓度达到29.23 mg·L-1和36.83 mg·L-1, SAA仅为不投加Ni(Ⅱ)时SAA的50.45%.同时, HDH活性和蛋白质浓度随Ni(Ⅱ)的浓度提高逐渐降低[图 1(c)].通常, 人们认为重金属对于生物系统的抑制主要是由于酶和蛋白质中存在的一些特异型金属改变为其他金属使得蛋白质发生结构变异, 导致蛋白质功能丧失[23, 24].因此, 系统内逐渐提高的Ni(Ⅱ)浓度超过了ANAMMOX微生物对Ni(Ⅱ)的耐受程度, 破坏了ANAMMOX关键酶HDH的蛋白质的结构, HDH活性降低, 使得脱氮性能下降.
图 1(d)给出了24、48、72和96 h恢复后ANAMMOX的SAA.当Ni(Ⅱ)的浓度为5 mg·L-1和10 mg·L-1时, SAA能分别恢复95.61%和97.42%.这说明低浓度Ni(Ⅱ)的冲击, ANAMMOX微生物的活性在很大程度上是可以恢复的.但是当Ni(Ⅱ)的浓度为100 mg·L-1时, SAA只能恢复46.49%, 表明高浓度的Ni(Ⅱ)对ANAMMOX微生物造成了不可逆转的失活.
2.2 IC50的确定利用线性[方程式(3)]和指数[方程式(4)]回归方程对Ni(Ⅱ)浓度与脱氮抑制百分比之间的关系进行拟合, 如图 2所示.线性拟合和指数拟合的相关系数R2分别为0.958 98和0.997 41, 拟合得到Ni(Ⅱ)的IC50分别为83.91 mg·L-1和83.86 mg·L-1.而Kimura等[24]在连续流条件下得到Ni(Ⅱ)的IC50为7.9 mg·L-1.Li等[25]的研究得出Ni(Ⅱ)对EGSB中ANAMMOX颗粒污泥的IC50为48.6 mg·L-1.由于本实验所用颗粒污泥取自运行稳定的UASB反应器, 耐冲击负荷强, 因此, 本实验得出的IC50值高于其他研究的IC50.
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图 2 Ni(Ⅱ)浓度与抑制百分比的拟合 Fig. 2 Fitting of Ni(Ⅱ) concentration to the inhibition percentage |
图 3(a)描述了ANAMMOX系统中Ni(Ⅱ)的3种分布形式及所占比例.Ni(Ⅱ)主要吸附在胞外聚合物表面, 这是因为细胞外聚合物和细菌细胞表面含有多种结合位点(比如氨基、羧基、羟基和磷酸酯官能团)[26]供Ni(Ⅱ)离子吸附；少部分的Ni(Ⅱ)通过跨膜转运被微生物摄取到胞内, 这一过程依赖于细胞活性和微生物的代谢活性.利用线性抑制方程[方程式(3)]对胞外吸附的Ni(Ⅱ)和ANAMMOX脱氮抑制百分比进行相关性拟合[图 3(b)]得到IC50(吸附)为52.78 mg·L-1, R2为0.854 81.利用生物抑制模型[方程式(7)]对胞内累积的Ni(Ⅱ)与系统脱氮抑制百分比进行拟合[图 3(c)]得到K[即IC50(胞内), 以VSS计]为0.072 mg·g-1, R2为0.984 95, 相关程度更高.这可能是因为Ni(Ⅱ)作为ANAMMOX微生生长所需要的微量元素, 可以通过转运蛋白家族诱导特异性金属转运孔蛋白而被摄取到微生物体内, 与官能团相互作用, 破坏蛋白质的结构和功能.因此, 摄取到胞内的Ni(Ⅱ)是抑制ANAMMOX系统脱氮性能的主要抑制因子.
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(a)Ni(Ⅱ)在ANAMMOX系统中的分布；(b)胞外吸附的Ni(Ⅱ)和抑制百分比的拟合；(c)胞内的Ni(Ⅱ)和抑制百分比的拟合 图 3 Ni(Ⅱ)分布与ANAMMOX脱氮性能抑制的关系 Fig. 3 Relationship between Ni(Ⅱ) distribution and inhibition of ANAMMOX |
TN去除速率q随TN浓度的变化如表 1所示, 在低TN浓度(≤500 mg·L-1)下, 对照组和实验组的q均随底物浓度的升高而增加, 但实验组的q值比对照组小, 这表明Ni(Ⅱ)的投加不仅降低了系统的氮去除率, 同时降低了TN去除速率q；而高TN浓度(＞500 mg·L-1)时, 实验组的q随底物浓度的增加而减小, 说明Ni(Ⅱ)对ANAMMOX过程q的抑制与底物浓度有关, TN浓度过高加剧了Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的抑制, 这是因为底物中亚硝氮浓度过高, 亚硝氮会与Ni(Ⅱ)发生氧化还原反应被还原为如二氧化氮或过氧亚硝酸根阴离子等有毒副产物, 这类有毒副产物与生物分子(包括DNA、脂质和蛋白质)反应[27], 对ANAMMOX微生物产生毒性, 进而加剧Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的抑制.
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表 1 TN去除速率与TN浓度之间的关系 Table 1 Relationship between TN removal rate and TN concentration |
为进一步了解Ni(Ⅱ)对ANAMMOX反应动力学的影响, 研究了不投加Ni(Ⅱ)和投加50 mg·L-1 Ni(Ⅱ)时ANAMMOX动力学特征的变化.不投加Ni(Ⅱ)时[图 4(a)], 用Monod方程模拟ANAMMOX动力学得到的qmax0(以TN/VSS计)和KS0分别为12.25 mg·(g·h)-1和405.36 mg·L-1, R2为0.978 56；投加50 mg·L-1 Ni(Ⅱ)时[图 4(b)], Monod方程模拟的R2为0.536 35, 无法预测动力学参数.采用修正后的Haldane模型模拟投加50 mg·L-1 Ni(Ⅱ)的ANAMMOX反应动力学, R2达0.902 41, 模拟得到的qmax(以TN/VSS计)、KS和Ki分别为6.78 mg·(g·h)-1、313.28 mg·L-1和1.32.
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(a)不投加Ni(Ⅱ)时, ANAMMOX反应动力学Monod模拟；(b)Ni(Ⅱ)=50 mg·L-1时, ANAMMOX反应动力学Monod模拟；(c)Ni(Ⅱ)=50 mg·L-1时, ANAMMOX反应动力学Haldane模拟 图 4 动力学拟合 Fig. 4 Kinetics simulation |
Ni(Ⅱ)对ANAMMOX抑制的类型可以利用方程式(8)和(9)来判断, 其中qmax0(以TN/VSS计)和qmax(以TN/VSS计)分别为12.5 mg·(g·h)-1和6.78 mg·(g·h)-1, KS0和KS分别为405.36 mg·L-1和313.28 mg·L-1.按照方程式(8)和(9)计算, 可以得到K*和KS*分别为0.542和0.772.通过比较qmax、qmax0和Ks、Ks0可推知抑制类型: ①对于竞争性抑制, 有qmax=qmax0、KS>KS0、K*=1和KS*>1；②对于非竞争性抑制, 有qmax < qmax0、KS < KS0、K* < 1和KS*=1；③对于反竞争性抑制, 有qmax < qmax0、KS < KS0、K* < 1和KS* < 1；④对于混合性抑制, 有qmax < qmax0、KS>KS0、K* < 1和KS*>1[28].本研究中, qmax < qmax0、KS < KS0、K* < 1和KS* < 1.因此, Ni(Ⅱ)对ANAMMOX动力学的抑制作用是反竞争性抑制.
2.5 Ni(Ⅱ)对ANAMMOX系统脱氮性能的长期影响图 5为Ni(Ⅱ)长期作用下ANAMMOX系统进出水中的氮素浓度和各阶段的TN去除率.P0阶段出水NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度分别为5.8、9.8和13.2 mg·L-1, TN平均去除率为76.25%, 表明不添加Ni(Ⅱ)时ANAMMOX系统脱氮性能稳定.在P1中, 将1 mg·L-1 Ni(Ⅱ)投加到ANAMMOX系统, TN去除率在前几天轻微升高, 这与短期批次实验得到结论一致, 低浓度的Ni(Ⅱ)可提高ANAMMOX的脱氮性能.在该阶段后期, 出水NH4+-N、NO2--N浓度呈现逐渐升高的趋势, NO3--N浓度则逐渐下降, 这表明Ni(Ⅱ)的添加并在系统内逐渐累积抑制了ANAMMOX的脱氮性能.随着Ni(Ⅱ)浓度增加至5 mg·L-1, P2阶段出水NH4+-N呈现先增加后下降的趋势, TN去除率也呈现先下降后上升的趋势, 表明ANAMMOX菌在经过一段时间的驯化后对Ni(Ⅱ)产生了一定的耐受性.而在P3阶段Ni(Ⅱ)的浓度进一步增加到10 mg·L-1, TN去除率急剧下降, 并在整个阶段的未来几天逐渐下降, 出水NH4+-N和NO2--N浓度分别增加至36.5 mg·L-1和46.9 mg·L-1, 由于Ni(Ⅱ)的投加量超过了ANAMMOX颗粒污泥EPS的吸附容量, ANAMMOX系统内累积了大量的Ni(Ⅱ), 严重抑制了ANAMMOX菌的生物活性.P4阶段, Ni(Ⅱ)的浓度增加到15 mg·L-1, TN的去除率再次急剧下降, 并且在整个阶段不再上升.该结果表明, 15 mg·L-1 Ni(Ⅱ)是ANAMMOX的长期抑制阈值.最后在P5中停止添加Ni(Ⅱ), 以研究Ni(Ⅱ)长期抑制后厌氧氨氧化菌的自我恢复能力.如图 5所示, NH4+-N和NO2--N的出水浓度逐渐降低, TN去除率缓慢上升, 这表明Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的抑制在一定程度上是可恢复的.但是经过20 d的恢复, TN去除率仅恢复到33.6%, 这是由于ANAMMOX系统中累积的Ni(Ⅱ)的抑制.这一结果表明, 不仅进水中的Ni(Ⅱ)抑制了ANAMMOX微生物的活性, 微生物摄取到体内累积的Ni(Ⅱ)进一步抑制了系统的脱氮性能.此外, 整个实验硝酸盐的产量要低, 可能的原因是高浓度的Ni(Ⅱ)导致生物体死亡, 内源性反硝化作用消耗了一定量的硝酸盐.
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图 5 Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的脱氮性能的长期影响 Fig. 5 Long-term effects of Ni(Ⅱ) on ANAMMOX |
(1) Ni(Ⅱ)短期作用下, 低浓度的Ni(Ⅱ)对ANAMMOX有促进作用, 投加1 mg·L-1的Ni(Ⅱ), NH4+-N和NO2--N的去除率分别提高了8.75%和5.84%, HDH活性提高了8.56%, SAA增加了11.14%；但高浓度的Ni(Ⅱ)会抑制ANAMMOX的脱氮性能, 当Ni(Ⅱ)的浓度为100 mg·L-1时, SAA仅为不投加Ni(Ⅱ)的SAA的50.45%.通过指数回归拟合得到Ni(Ⅱ)的IC50值为83.86 mg·L-1.
(2) 缓冲液洗涤污泥能有效缓解低浓度Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的抑制.当Ni(Ⅱ)的浓度为5和10 mg·L-1时, 通过缓冲液洗涤, SAA能分别恢复95.61%和97.42%；当Ni(Ⅱ)的浓度为100 mg·L-1时, SAA仅能恢复46.49%.
(3) Ni(Ⅱ)在ANAMMOX系统中的去向为存留于液相基质、胞外吸附和胞内累积.Ni(Ⅱ)对ANAMMOX系统脱氮性能的抑制主要与胞内Ni(Ⅱ)的有关, 胞内Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的IC50(胞内)(以VSS计)为0.072 mg·g-1.
(4) 不投加Ni(Ⅱ)时, Monod模型可以用来模拟ANAMMOX的动力学, 模拟得到qmax0(以TN/VSS计)和KS0分别为12.5 mg·(g·h)-1和405.36 mg·L-1.当50 mg·L-1的Ni(Ⅱ)冲击ANAMMOX系统时, 修正后的Haldane模型可用于模拟其动力学, 模拟得到qmax(以TN/VSS计), KS和Ki分别为6.78 mg·(g·h)-1, 313.28 mg·L-1和1.32.Ni(Ⅱ)对ANAMMOX动力学的抑制是反竞争性抑制.
(5) Ni(Ⅱ)长期作用于ANAMMOX系统会严重抑制ANAMMOX的脱氮性能, ANAMMOX对1~5 mg·L-1的Ni(Ⅱ)具有一定的耐受性, Ni(Ⅱ)对ANAMMOX的长期抑制阈值为15 mg·L-1.
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