超微型浮游藻类[picophytoplaknton, ≤3 μm, 超微藻(PPP)], 是浮游生态系统的重要组成部分, 在水体物质循环和能量流动中起着重要作用.超微藻细胞微小, 具有更高的CO₂固定效率, 其对水体初级生产力的贡献量最高可达90%^[1~4].不同于大型藻类, 超微藻所固定的碳主要通过微食物环被异养微生物代谢分解, 微食物环中呼吸量高, 可供更高营养级别生物利用或输出的有机物很少；已有研究表明, 水体总浮游生物的生产力和呼吸比与超微藻对总生产力的贡献量呈显著负相关关系^[5].因此, 它们在推动水体生态系统的物质循环和能量流动, 维持系统平衡等方面起着非常重要的作用^{[6, 7]}, 了解湖泊中超微藻生物量及其主要的影响因子对深入研究整个湖泊生态学功能具有重要作用和意义.

根据细胞结构, 超微藻可分为超微蓝藻(picocyanobacteria, PCY)和真核超微藻(Photosynthetic picoeukaryotes, PPEs).不同类型超微藻所含特异性色素不同：PCY除含有叶绿素(Chlorophyll a, Chla)外, 还含有藻胆蛋白^[8]；根据其所含藻胆蛋白的不同可将其分为富含藻蓝素(phycocyanin, PC)和富含藻红素(phycoerythrin, PE)的细胞^[7]；而PPEs主要富含叶绿素.由于不同色素所发出的特异性荧光不同, 根据这种特性, 利用流式细胞仪即可快速区分出不同类型超微藻；相对于传统显微镜计数法, 流式细胞仪不仅分析速度快, 而且具有更高的准确性和精确度, 样品预处理也更简单^{[9, 10]}.

目前有关超微藻的研究都主要集中在海洋和寡营养湖泊生态系统^{[11, 12]}, 直到近十年来, 关注内陆中、富营养水体超微藻的研究才开始逐渐增加^[13].国内有关内陆淡水超微藻的研究主要集中在长江中下游地区, 如武汉东湖^[14]、太湖^[15]以及巢湖^[16]等, 这些湖泊大都为半封闭型稳定水体；而有关通江湖泊和河流等流动型水体超微藻的研究则鲜见, 这些水体水动力条件十分复杂, 环境因子波动频繁, 显著区别于其他稳态湖泊.已有研究表明, 在通江湖泊鄱阳湖中, 营养条件并非影响浮游藻类时空分布的关键因素, 而水体透明度的影响更为重要^[17].因此, 对这些水体中超微藻进行研究能更好地揭示不同水体中超微藻的分布和演替规律.

洞庭湖是我国第二大淡水湖, 是承纳湘、资、沅、澧“四水”和吞吐长江的过水性洪道型湖泊, 丰、枯水期水位波动大, 江湖关系十分复杂^[18].本研究聚焦于洞庭湖泊群中最大、保存最完好的主体湖盆东洞庭湖, 通过在丰水期(5~8月)逐月采样调查, 结合流式细胞计数技术, 明确大型通江湖泊洞庭湖超微藻生物量和丰度的时空分布特征及其关键影响因子, 本研究结果将有助于深入认识超微藻在不同生境类型水体中维持机制及生态意义.

本研究在东洞庭湖区共设置14个采样点(图 1), 其中1和10~12号点位于东洞庭湖东部湖区湘江行洪道上; 2~5和13~14号点位于东洞庭湖北部湖区；6~9号点位于东洞庭湖南部湖区.洞庭湖为典型的过水性洪道型湖泊, 受水位影响, 不同季节水深变化明显；于2019年5月~2019年8月丰水期每月采集东洞庭湖水样, 对超微型浮游藻类展开研究.采样通过GPS系统定位, 利用采水器采集0~1.2 m范围内的表层水样, 混合均匀后, 装入无菌塑料瓶, 冷藏运回实验室进行分析.现场采用多参数水质分析仪(Aquaread AP-2000, UK)原位测定水温(T)、pH、溶解氧(DO)、浊度(NTU)、氧化还原电位(ORP)和电导率(EC)等指标；并利用塞氏黑白盘法测定水体透明度(SD)；利用便携式水深探测仪(Speedtech SM-5A, Unionville, VA, USA)测定水深(depth).用采样当日洞庭湖城陵矶站水位表示水位(WL)变化.

图 1

Fig. 1

图 1 东洞庭湖位置及采样点位示意 Fig. 1 Location of East Lake Dongting and distribution of the sampling sites

总氮(TN)、总磷(TP)及高锰酸盐指数通过硫酸盐氧化法测定^[19].水样通过GF/C玻璃纤维滤膜(0.8 μm孔径, Whatman)过滤后滤液用于硝氮(NO₃^--N)、氨氮(NH₄⁺-N)、磷酸盐(PO₄^3--P)和溶解性有机碳(DOC)测定.利用Skalar自动分析系统测定NO₃^--N、NH₄⁺-N和PO₄^3--P浓度, 采用高温氧化法利用Shimadzu TOC分析仪(Model 5000, Tokyo, Japan)测定DOC浓度.水样通过GF/C滤膜过滤后滤膜用于藻蓝素(PC, 表征蓝藻含量)测定, 采用Tris-HCl提取法, 利用荧光分光光度计测定^[20].

利用藻类叶绿素(Chla)浓度表征其生物量.采用分级过滤法, 分别测定超微藻和其他浮游藻类Chla浓度.取部分水样首先用3 μm孔径的聚碳酸酯滤膜(Merck Millipore Ltd., Tullagreen, Carrigtwohill Co. Cork, IRL)过滤, 滤液再通过0.2 μm孔径的Isopore^TM滤膜过滤.滤膜用90%丙酮提取, 于暗处-4℃静置提取至少12 h, 离心取上清液, 再用90%丙酮定容, 利用荧光分光光度计(RF-5301)测定Chla含量^[20]. 0.2 μm和3 μm滤膜代表超微藻Chla(pico-Chla)和非超微藻浮游藻类Chla浓度, 二者之和即为总浮游藻类Chla浓度.

利用流式细胞仪(FACSJazz^se, Becton Dickinson, USA)分析水体中超微型浮游藻类丰度.水样经300目绢筛过滤去除大颗粒及杂质以防止其堵塞流式细胞仪喷嘴.利用3 μm标准小球(SPHERO, URFP-30-2, 3.0 μm, Spherotech, CA, USA)作为内标, 根据前向散射光信号(FSC)筛选出3 μm以下超微型颗粒；再根据超微真核藻和超微蓝藻所含特异性色素发出的自发荧光信号区进行区分不同超微藻并分别计数和分选.利用Chla荧光信号设定阈值.样品混合均匀后, 通过流式细胞仪计数60 s, 同时用已知浓度的标准计数小球通过流式细胞仪计数相同时间计算超微藻细胞浓度, 计算公式如下：

式中, c_i为超微藻细胞浓度, N_i为计数时间内超微藻细胞总数；c_s和N_s分别为标准计数小球浓度及相同计数时间内其计数数量.

通过双因素方差分析Two-way ANOVAs对洞庭湖环境因子及超微藻生物量和丰度的时空分布进行差异显著性分析.利用Pearson相关系数分析超微生物量和丰度与主要水环境因子的相关性.通过多元逐步回归分析影响PPEs和PCY丰度组成变化的关键环境因子, 利用方差膨胀因子(VIF)检验变量之间的自相关性, 当VIF>10时, 则认为存在共线性问题；利用矫正R²判定系数表征回归模型中环境因子变异对超微藻丰度变异的解释率.所有统计分析均在R (version 3.5.3, http://cran.r-project.org)环境下完成, 利用ArcGIS 10.2软件分析超微藻丰度空间变化特征.

洞庭湖丰水期平均水位12.5 m (11.02~13.51 m), 从5~8月每月平均水温不断增加, 由22.0℃增加到31.5℃；水体pH值与温度呈现相似的增加趋势, 但东部行洪道pH值显著低于北部和南部湖区(P < 0.05).总体上, 东部行洪道水体理化性质与北部和南部湖区差异明显, 东部行洪道水深最深, 但水体透明度、溶解氧和电导率等显著低于(P < 0.05)其他湖区, 而浊度和氧化还原电位均稍高于其他湖区(图 2).东洞庭湖丰水期水体TN和TP均值分别为1.37 mg ·L^-1和0.14 mg ·L^-1, 已经达到发生富营养化条件(TN>0.5 mg ·L^-1, TP>0.05 mg ·L^-1)^[21].从北部湖区、南部湖区到东部湖区TN和NO₃^--N逐渐升高, 但不同湖区NH₄⁺-N、磷营养盐及氮磷比均无显著差异, 其中水体NH₄⁺-N、PO₄^3--P和氮磷比分别在0.01~0.55 mg ·L^-1、0.01~0.15 mg ·L^-1和1.2~63.0范围内波动, 均值分别为0.20 mg ·L^-1、0.04 mg ·L^-1和16(图 2).

图 2

Fig. 2

图 2 东洞庭湖主要水环境因子时空差异 Fig. 2 Temporal and spatial variations of the main physiochemical parameters in East Lake Dongting

东洞庭湖丰水期超微藻Chla的平均浓度为8.52 μg ·L^-1, 变化范围为0.58~38.99 μg ·L^-1, 时空分布差异明显.从5~8月, 随着水温的增加, 超微藻Chla浓度不断增加, 尤其是东洞庭湖北部湖区和南部湖区[图 3(a)].东部行洪道超微藻Chla浓度最低, 显著低于北部湖区和南部湖区(P < 0.05).整个丰水期东洞庭湖超微藻对总浮游藻类Chla的贡献率平均为41.6%, 变化范围为23.73% ~67.91%.时间上, 7~8月超微藻对总浮游藻类Chla的贡献率显著高于5~6月；空间上, 南部湖区超微藻对总浮游藻类Chla的贡献率最高, 东部和北部湖区超微藻对总浮游藻类Chla的贡献率无显著性差异[图 3(b)].

图 3

Fig. 3

图 3 丰水期东洞庭湖不同湖区超微藻Chla浓度及其对总浮游藻类贡献量的变化趋势 Fig. 3 Variation of picophytoplankton chlorophyll a concentration and its contribution to total phytoplankton during the wet season

通过流式分析发现, 丰水期东洞庭湖超微藻主要为超微真核藻(PPEs)和富含PC的超微蓝藻(PCY), 并未检测到富含PE的超微蓝藻；其中PPEs和PCY的平均丰度(cells ·μL^-1)分别为25.90 (1.30~117.09)和108.39 (1.92~551.07), 均表现出显著的时空变化差异(P < 0.05).从5~8月, PPEs和PCY丰度均表现属先增加后降低的时间变化特征, 尤其是部分湖区PCY丰度在6、7月剧烈升高, 最高达到551.07 cells ·μL^-1, 到8月重新恢复到5月水平甚至更低(表 1).此外, PPEs和PCY丰度在丰水期还表现出明显的空间演变特征(图 4). 5月PPEs主要集中在北部湖区, 6月开始逐渐向南部湖区迁移, 7月南部湖区PPEs丰度达到峰值, 到8月南部湖区PPEs丰度降低, 并显著低于东部行洪道和东北部.而PCY表现出与PPEs相似的空间演变特征, 从5~7月由北部湖区向南部湖区逐渐迁移, 但到8月重新迁移到北湖湖区, 东部行洪道PCY丰度始终显著低于其他湖区.通过比较发现, 丰水期超微藻主要以PCY为主, PCY:PPEs平均比值为3.4, 最高为12.8(表 1).

表 1 (Table 1)

表 1 丰水期每月不同类群超微藻丰度均值比较 Table 1 Comparison of the monthly means of picophytoplankton groups during the wet season 项目 5月 6月 7月 8月 PPEs/cells·μL-1 22.53±19.22 33.65±20.17 43.18±34.63 4.25±3.44 PCY/cells·μL-1 35.00±47.29 165.18±149.58 228.76±150.57 4.60±2.04 PCY:PPEs 1.32±0.68 4.72±2.78 5.91±2.71 1.44±0.60

表 1 丰水期每月不同类群超微藻丰度均值比较 Table 1 Comparison of the monthly means of picophytoplankton groups during the wet season

图 4

Fig. 4

图 4 东洞庭湖丰水期(5~8月)超微型真核藻和原核藻丰度空间变化 Fig. 4 Spatial variations of concentrations in East Lake Dongting

相关分析表明(图 5), 超微藻Chla浓度与NO₃^--N和PO₄^3--P显著负相关, 而与水温(T)、pH、EC、DO、PC和Chla等显著正相关(P < 0.05)；超微藻对总浮游藻类的贡献量则与T、DO、PC、Chla、TN、N:P比和ORP等显著正相关, 而与NO₃^--N显著负相关(P < 0.05).东洞庭湖丰水期PPEs丰度与N:P比、WL、SD显著正相关, 与PC显著负相关(P < 0.05)；而PCY丰度也与N:P比、WL、SD显著正相关, 但与PO₄^3--P显著负相关.

图 5

Fig. 5

***表示P < 0.001；**表示P < 0.01；*表示P < 0.001; C表示高锰酸盐指数 图 5 不同类群超微藻丰度、超微藻Chla生物量及其贡献量与环境因子相关性 Fig. 5 Pearson correlations of the abundances of different picophytoplankton groups, picophytoplankton Chla biomass, and their contributions with environmental parameters

为进一步分析对PPEs和PCY超微藻丰度组成解释度最高的关键环境因子, 运用多元逐步回归分析得到关于PCY:PPEs比值的回归模型.最终进入模型的因子为TN、N:P、T和WL, 它们对PCY:PPEs的解释率为62.7% (P < 0.001)；通过因子相对重要性分析发现, WL对PCY:PPEs比值变化的解释率权重最高, 占比51.0%, 其次为N:P, 占比27.5%(图 6).

图 6

Fig. 6

图 6 PCY:PPEs逐步回归模型中各变量相对权重柱状图 Fig. 6 Bar plots of relative weights of the factors retained after stepwise regression analyses for PCY:PPEs values

超微藻是粒径最小的浮游藻类, 相对于细胞较大的微型和小型藻类, 其比表面积大, 具有更高的营养吸收和利用率, 因此, 在寡营养水体中更具生长优势^{[22, 23]}.洞庭湖为典型的过水性洪道型湖泊, 湖水流速、年净流量较大, 湖泊水循环周期短(<20 d)^[24], 自净能力较强, 具有较大的水环境容量, 这种独特的水文情势导致湖水氮、磷滞留系数较小, 营养物质不易沉降^[25], 富营养化程度相对其他半封闭型大型浅水湖泊(如太湖、巢湖等)较低.本研究结果发现, 丰水期东洞庭湖超微藻对总浮游藻类Chla的贡献率平均为42%, 与同为通江湖泊的鄱阳湖(46%)相当^[26], 均显著高于富营养化的太湖和巢湖(<20%)^[16].另一方面, 由于通江湖泊水动力条件十分复杂, 导致水环境条件(尤其是营养盐)波动频繁, 这进一步增加了具有高营养吸收速率超微藻的竞争优势^[27].因此, 超微藻在通江湖泊中具有更重要的生态地位.

通过调查发现, 东洞庭湖东部行洪道湖区超微藻丰度和Chla浓度以及总浮游藻类Chla浓度均显著低于北部和南部湖区, 这与东部行洪道独特的水环境条件紧密相关；其水体理化性质显著区别于北部和南部湖区, 水质最差, 具有更高的氮营养盐浓度、NTU和ORP, 而水体透明度、DO、EC等均显著低于其他湖区(图 1)；这可能是由于东洞庭湖东部行洪道紧邻岳阳市主城区, 同时承载主航道功能, 受到来自于城市、船舶生活污水污染严重, 且污染物成分复杂, 因此不适于藻类生长.而北部和南部湖区距离主城区较远, 主要污染源为周边种植业面源污染, 因此更适于藻类生长.此外, 洞庭湖超微藻丰度主要由富含藻蓝素的超微蓝藻(PCY)为主, PCY:PPEs比值最高达到12.8, 这与在其他低营养水平淡水湖泊和海洋中的研究结果一致^[28~37], 这主要是由于PPEs细胞粒径更大, 其丰度通常比细胞更小的PCY低一个数量级.但是在富营养化严重的太湖和巢湖的调查发现, 超微藻丰度却主要以PPEs细胞为主；有研究表明, PPEs细胞对营养盐的响应与其他较大藻类细胞的响应相似, 通过营养盐的添加可以显著促进PPEs的生长^[38], 因此, 在富营养化湖泊中PPEs更具竞争优势^[16].

整个丰水期间洞庭湖超微藻表现了显著的时空迁移特征, 而且PPEs和PCY具有相似时空迁移特征, 但是迁移速度和幅度差异明显.例如, 7、8月间东洞庭湖PCY丰度显著增加, 平均上升一个数量级；而PPEs增加幅度不明显；同时, 在空间上, PPEs丰度峰值向南迁移的速度慢于PCY.以上结果均表明PPEs和PCY对环境因子具有相似的响应特征, 但响应能力不同.相关分析结果也表明, PPEs和PCY丰度具有相似的环境因子相关性, 均与SD、N:P比和水位WL显著正相关.值得注意的是, 东洞庭湖超微藻丰度与水体TN、TP等主要营养指标相关性均不显著；在另一通江湖泊鄱阳湖中也发现了相似的规律^[39]；相反, 在半封闭型湖泊太湖、巢湖中的研究均发现营养盐是驱动超微藻(尤其是超微蓝藻)丰度变化的关键影响因子^[16].这可能与通江湖泊复杂的水文动力条件紧密相关, 相关分析发现, 洞庭湖各营养盐浓度与水位和水深等均显著相关(图 5), 表明水体营养盐浓度受水动力条件变化影响显著.逐步回归分析结果表明, 东洞庭湖中水位变化是影响PPEs和PCY丰度组成变化最重要的因子, 水位和N:P比越高PCY优势度越大；高TN:TP比暗示着潜在磷限制的可能性^[40], 表明PCY在P限制水体中比PPEs更具竞争优势.此外, 温度、光照条件等也是影响超微藻生长的重要因子^{[41, 42]}, 四季温度变化及水位波动引起的溶解氧、水体透明度和浊度等变化都会对浮游藻类的生长产生重要影响.

(1) 东洞庭湖东部行洪道区水环境因子显著区别于北部和南部湖区, 其超微藻生物量和丰度均最低.

(2) 丰水期超微藻占东洞庭湖总浮游藻类生物量的比例平均为41.6%, 其中南部湖区显著高于北部和东部湖区.

(3) 洞庭湖超微藻主要以PCY为主, 其丰度平均是PPEs的3.4倍；PCY和PPEs丰度表现出相似的时空分布规律, 但PCY丰度变化幅度显著高于PPEs.

(4) 逐步回归分析结果表明, 水位是影响东洞庭湖PCY和PPEs浓度组成比例最重要的因子, 其次为N:P.