2020, Vol. 41
2. 青岛海洋科学技术国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室, 青岛 266071;
3. 海洋环境与生态教育部重点实验室, 青岛 266100;
4. 中国海洋大学海洋生命学院, 青岛 266003
2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China;
3. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China;
4. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
海洋沉积物覆盖面积占地球表面的70%, 是世界上最大的有机碳储存库, 微生物细胞丰度超过其他任何环境[1].海洋沉积物中的微生物驱动许多过程, 如碳、氮和硫的生物地球化学循环[2].一般来说, 沉积物中细菌生物量和丰富度高于对应水体[3], 在底栖-浮游界面耦合过程和元素循环中起着至关重要的作用[4].因此, 细菌群落的研究有助于在微生态层面全面了解海洋沉积物中生物地球化学循环过程.
分子生态学技术对微生物群落的研究具有重要意义, 已广泛应用于海洋沉积物中细菌群落研究[5~10].其中, 现代测序技术的应用有可能彻底改变传统的生物监测技术, 并通过生物指标扩展生态系统健康诊断能力[11, 12].大多数基于序列的沉积物微生物群落研究通过扩增从样品中提取的DNA构建文库来实现, 但是, 由于DNA的稳定性使其来源包括活细胞、休眠细胞以及死亡细胞[13], 因此, 这些提取的DNA可能来自活性细胞、无活性但存活的细胞、已分解或死亡的细胞以及裂解或降解细胞的细胞外DNA, 特别是最后一种DNA可能在沉积物中普遍存在, 因为矿物颗粒可以有效结合并保留DNA[14].因此, 基于DNA的群落结构分析很可能会获得大量冗余信息, 而这对分析沉积物中微生物正在参与的生物地化过程尤为不利, 因为人们更关注于仅占总微生物群落的一小部分直接参与底物利用和生化转化的活性微生物[15]；此外, 这一方法在探索微生物群落时可能会遗漏一些重要的功能微生物[16].为解决这一问题, 研究者把目光投向了细胞中活性较高、不易保存的RNA.人们发现基于核糖体RNA的分析更能代表活细胞, 可以更好地揭示微生物群落对环境变化的响应[17].有研究发现在特定环境中休眠细菌所占比例高达40%, 休眠体引起的活性和总微生物组成的差异, 促使研究者思考可否使用基于rRNA的方法来连接微生物群落结构与功能[18].虽然, 基于16S rRNA测序来研究活性微生物群落有许多限制, 如RNA提取和纯化过程中RNA的降解、cDNA合成效率等问题, 但是, 基于rRNA的Illumina测序仍然为活性微生物的群落结构分析提供了一种高通量且无需培养的方法, 并已经应用于评价总微生物群落和活性微生物群落[16~17, 19~22].目前, 这一研究主要集中于土壤等生态系统[17, 22], 而对海洋沉积物的研究较少.海洋沉积物环境与其他环境, 甚至与海水环境之间具有显著差异, 栖息于其中的微生物具有独特的群落特征[10].因此, 有必要针对海洋沉积物进行相关研究.
渤海是我国半封闭内海, 是重要的资源矿场、自然渔场和水上航线, 海床浅、受人为影响大.黄海是太平洋西部最大的一个边缘海, 南黄海由于黄河的汇入、冷水团现象等, 备受研究人员关注.本研究选取两个海域的代表性采样点, 以16S rRNA基因和16S rRNA为对象, 采用实时荧光定量PCR和高通量测序技术, 结合环境因子的测定, 在DNA和RNA水平上分析比较海洋沉积物中细菌群落丰度、多样性、结构和功能, 通过明确海洋沉积物总细菌群落和活性细菌群落的差异, 以期为更准确地了解海洋沉积物中细菌群落结构和功能提供依据.本研究系统地比较了沉积物中总细菌群落和活性细菌群落的差异, 以期为细菌群落的深入研究提供基础信息, 并为细菌群落与生态功能的结合指出新的可能.
1 材料与方法 1.1 样品采集依托科学考察船, 于2018年8月22日采集渤海M7(120.47°E, 39.54°N)站位表层沉积物和底层水样品, 2018年9月2日采集南黄海3300-06(123.80°E, 33.00°N)站位表层沉积物和底层水样品, 两站位水深分别为28 m和45 m(图 1).表层沉积物(1~3 cm)用箱式采泥器采集并充分混合后置于无菌封口袋内, 立即储存于-20℃冰箱, 带回实验室后于-80℃冰箱保存.底层水样品经0.7 μm玻璃纤维滤膜过滤后, 滤膜储存于-20℃冰箱以测定叶绿素a(Chla), 经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后, 水样分为两份, 一份储存于-20℃冰箱以测定氨盐(NH4+)、亚硝酸盐(NO2-)、硝酸盐(NO3-)与磷酸盐(PO43-), 另一份加入氯仿后常温保存以测定硅酸盐(SiO32-).
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图 1 渤海和南黄海海域采样站位示意 Fig. 1 Sampling sites in the Bohai Sea and South Yellow Sea |
站位底层水温度(T)、溶解氧浓度(DO)和盐度(Sal)等理化参数通过船载CTD多参数温盐深仪进行现场测定.底层水样带回实验室用Quaatro营养盐自动分析仪测定NH4+、NO2-、NO3-、PO43-和SiO32-等营养盐参数.并采用Trilogy荧光分析仪测定Chla浓度.
1.3 DNA和RNA提取沉积物样品自然解冻后, 用Power Soil DNA Isolation Kit(MOBIO, USA)提取沉积物微生物总DNA, DNA提取方法参照试剂盒说明书进行；DNA提取后使用NanoDrop(Thermo Scientific, USA)进行质量和浓度检测, 琼脂糖凝胶电泳进行完整性检验, 合格后于-80℃保存备用.用Power Soil Total RNA Isolation Kit(MOBIO, USA)提取沉积物微生物总RNA, RNA提取方法参照试剂盒说明书进行.所得RNA用DNase Max Kit(MOBIO, USA)进行纯化去除DNA；纯化后RNA同样使用NanoDrop(Thermo Scientific, USA)进行质量和浓度检测, 琼脂糖凝胶电泳进行完整性检验, 并使用引物338F/806R(表 1)扩增验证DNA是否去除成功；检测合格后通过Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, Germany)反转录为互补DNA(complementary DNA, cDNA), 所得cDNA经引物338F/806R(表 1)扩增验证反转录成功后于-80℃保存备用.
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表 1 细菌16S rRNA基因引物 Table 1 Primers for bacterial 16S rRNA genes |
1.4 16S rRNA基因丰度和表达丰度测定
使用引物(表 1)扩增细菌16S rRNA基因, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后, 切胶回收目的条带.目的条带纯化后连接到pMD 18-T载体上, 并转化到感受态细胞中, 选取阳性克隆并使用快速质粒小提试剂盒(康为, 北京)提取质粒.质粒PCR扩增并电泳确认阳性克隆后送样测序(华大基因, 北京).用Picodrop超微量紫外分光光度计(Picodrop, UK)测得重组质粒的浓度, 计算细菌16S rRNA基因重组质粒的拷贝浓度.以梯度稀释质粒标准品作为模板, 采用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System(Life Technologies, USA)进行qPCR.反应体系为：10 μL FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Germany), 0.6 μL正向引物, 0.6 μL反向引物(表 1), 2 μL模板DNA, 6.6 μL去离子水和0.2 μL mg ·mL-1牛血清蛋白.反应条件为：50℃ 2 min；95℃ 10 min；40个循环, 95℃ 15 s, 58℃ 2 min.扩增完毕后分析熔解曲线, 确保模板DNA的特异性扩增.以质粒拷贝数对数值为横坐标, 平均Ct值为纵坐标, 绘制细菌16S rRNA基因质粒标准曲线.
以沉积物中所得DNA(总微生物群落)和cDNA(活性微生物群落)为模板, qPCR测定细菌16S rRNA基因丰度和表达量丰度, 步骤与上述步骤相同, 每个样品设置3个平行, 并添加阴性对照和阳性对照.
1.5 16S rRNA基因扩增和测序以提取所得DNA(DNA水平, 总细菌群落)和合成所得cDNA(RNA水平, 活性细菌群落)为模板, 使用引物对338F/806R(表 1), 添加样本特异性Barcode序列, 对细菌16S rRNA基因V3~V4区进行PCR扩增.PCR扩增产物经电泳检测合格后, 进行目的片段切胶回收并纯化.根据回收产物荧光定量结果, 按照每个样品的测序需求量, 对各个样本相应比例进行混合.利用所得扩增产物构建测序文库, 测序文库质检合格后上机测序, 测序采用Illumina MiSeq PE250平台进行2×300 bp双端测序(派森诺, 上海).
得到高通量测序原始下机数据后, 首先, 通过控制碱基质量、序列长度和模糊碱基等对原始双端测序数据进行初步筛查.然后, 使用FLASH软件(v1.2.7)[24]对双端序列进行配对连接, 并按照引物和Barcode接头信息将序列识别分配入对应样本, 从而获得每个样本的有效序列.最后, 运用QIIME软件(v1.8.0)[25]识别疑问序列, 并调用USEARCH(v5.2.236)检查并剔除嵌合体序列, 从而获得用于后续分析的高质量序列.
使用QIIME软件, 调用UCLUST[26]对上述序列以97%相似度进行OTU划分, 并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列.采用Silva数据库比对代表序列[27], 得到每个OTU对应的分类学信息.此外, 为确保分析结果准确, 将丰度值低于所有样品测序总量0.001%的OTU去除[28].OTU精简后, 对所有样本进行均一化处理[29], 均一化后的OTU丰度矩阵用于后续分析.根据16S序列的分类注释结果, 使用原核生物功能注释(functional annotation of prokaryotic taxa, FAPROTAX)数据库预测细菌群落的生态功能[30].
1.6 数据分析使用SPSS 17.0软件进行Mann-Whitney检验, 分析DNA水平和RNA水平上OTU的注释比例的差异.韦恩图、α-多样性指数和丰度热图分别采用R v3.5.1软件中的VennDiagram、Picante和Pheatmap包进行分析, 主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)和基于加权UniFrac距离的非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)聚类则使用Vegan包进行分析.
2 结果与分析 2.1 环境因子分析底层水环境因子如表 2所示.M7站位和3300-06站位Sal没有明显差异, M7站位T高于3300-06站位, 而DO则低于3300-06站位. 3300-06站位NH4+远低于M7站位, 而其他营养盐参数和Chla都远高于M7站位.
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表 2 渤海和南黄海海域采样站位底层水理化参数 Table 2 Physicochemical parameters of bottom water at the sampling sites in the Bohai Sea and South Yellow Sea |
2.2 细菌16S rRNA基因丰度和表达丰度
以DNA和cDNA为模板, 通过qPCR测定细菌16S rRNA基因丰度(DNA水平)和表达丰度(RNA水平).渤海M7站位和南黄海3300-06站位细菌16S rRNA基因丰度平均值分别为1.17×109 copies ·g-1和7.09×108 copies ·g-1, 基因表达丰度平均值分别为9.35×108 copies ·g-1和7.56×106 copies ·g-1(图 2).M7站位细菌16S rRNA基因丰度比3300-06站位高出1个数量级, 表达丰度高2个数量级.总体来看, 细菌16S rRNA基因表达丰度比16S rRNA基因丰度低1~2个数量级, 占16S rRNA基因丰度的80.01%和1.07%.这表明地域不同, 活性微生物数量与总微生物数量的比例可能具有明显差异.
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图 2 细菌16S rRNA基因丰度和表达丰度 Fig. 2 Bacterial 16S rRNA gene abundance and transcript abundance |
渤海M7和南黄海3300-06站位沉积物DNA和cDNA样品经高通量双端测序后, 对下机数据进行拼接、质控、剔除疑问序列和去嵌合体后, 共得到130 622条高质量序列, 4个样品所得序列条数范围
为30 179~34 548条.以97%的相似性水平聚类后, 共得到54 173个OTU, 对OTU进行精简后, 得到11 966个OTU.根据OTU精简后每个样本的序列条数, 以样本最少序列条数的90%进行抽平[29], 4个样本最后共得到9178个OTU, 以最后得到的OTU丰度矩阵进行后续分析(表 3).
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表 3 不同处理阶段OTU个数 Table 3 Number of OTU in different processing stages |
M7_DNA、M7_RNA、3300-06_DNA和3300-06_RNA的OTU数分别为3 555、3 398、3 370和2 918个(图 3).M7和3300-06站位RNA水平上的OTU数均小于DNA水平, 说明活性细菌种类少于总细菌种类.M7站位DNA水平和RNA水平共有OTU数为1237个, 分别占DNA和RNA水平的34.80%和36.40%；3300-06站位DNA水平和RNA水平共有OTU数为927个, 分别占DNA和RNA水平的27.51%和31.77%. M7和3300-06站位DNA水平上共有OTU数为1196个, RNA水平上共有OTU数为889个.
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图 3 细菌群落OTUs韦恩图 Fig. 3 Veen OTUs of bacterial communities |
Good_coverage指数(92.92% ~100.00%, 表 4)和稀释曲线(图 4), 表明测序深度能够基本覆盖全部物种.Chao1和ACE指数表明DNA水平丰富度高于RNA水平；Pielou指数表明M7站位DNA水平均匀度低于RNA水平, 3300-06站位DNA水平均匀度高于RNA水平(表 4).Shannon和Simpson指数表明M7站位DNA水平和RNA水平多样性差异不大, 而3300-06站位DNA水平多样性高于RNA水平多样性.
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图 4 基于16S rRNA基因和16S rRNA的细菌群落物种数稀释曲线 Fig. 4 16S rRNA gene- and 16S rRNA-based rarefaction curves of bacterial communities |
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表 4 基于16S rRNA基因和16S rRNA的细菌群落α-多样性指数 Table 4 16S rRNA gene- and 16S rRNA-based α-diversity indices of bacterial communities |
2.4 总细菌和活性细菌群落结构和组成
对OTU水平的细菌群落组成和相对丰度进行PCoA分析和UPGMA聚类分析发现, 细菌群落在DNA水平和RNA水平具有明显差异(图 5和图 6).基于加权UniFrac距离的UPGMA聚类分析表明, DNA水平上的M7站位和3300-06站位细菌群落结构最为相近, M7站位DNA和RNA水平的细菌群落结构相似程度高于3300-06站位(图 6).
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图 5 基于Bray-Curtis距离的PCoA分析 Fig. 5 PCoA plot based on the Bray-Curtis distance |
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图 6 基于加权UniFrac距离的UPGMA聚类分析 Fig. 6 UPGMA cluster analysis based on the weighted UniFrac distance |
通过代表序列与Silva数据库进行对比, OTU物种注释和分类结果显示, 注释到门、纲、目、科、属和种的OTU平均比例分别为99.90%、95.50%、77.72%、60.24%、33.81%和1.91%, 其中, DNA水平和RNA水平上OTU的注释比例不存在明显差异(Mann-Whitney检验, P＞0.05), 海洋沉积物蕴含着大量的未知生物资源.对门水平和科水平相对丰度＞1%的优势细菌类群[31]做相对丰度图(图 7).在门分类水平上[图 7(a)], 变形菌(Proteobacteria)占绝对优势, 所占比例为48.66% ~58.93%, 随后为浮霉菌(Planctomycetes)、绿弯菌(Chloroflexi)、酸杆菌(Acidobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)和硝化螺旋菌(Nitrospirae)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes)和疣微菌(Verrucomicrobia).其中, 变形菌主要包括γ-变形菌(γ-Proteobacteria)、δ-变形菌(δ-Proteobacteria)和α-变形菌纲(α-Proteobacteria).DNA水平和RNA水平相比, 变形菌在RNA水平上的相对丰度高于DNA水平, 主要体现在γ-变形菌和α-变形菌上, 蓝细菌等也表现出相同的趋势, 而δ-变形菌、酸杆菌和放线菌等则表现出相反的规律.特别地, 蓝细菌在RNA水平上相对丰度显著高于DNA水平, 分别为3.52%和11.61%以及0.38%和0.54%.属于蓝细菌的产氧光细菌(Oxyphotobacteria)在RNA水平的相对丰度显著高于DNA水平, 特别是在3300-06站位, RNA水平相对丰度是DNA水平的20多倍, 环境因子分析表明, 3300-06站位Chla远高于M7站位.此外, 放线菌在DNA水平上相对丰度显著高于RNA水平, 分别为5.02%和11.93%以及1.24%和3.47%.M7站位和3300-06站位相比, M7站位变形菌相对丰度显著高于3300-06站位, 而放线菌门则显著低于3300-06站位；此外, 有些细菌类群在DNA水平上, M7站位相对丰度低于3300-06站位, 但是RNA水平上却较高, 例如, 浮霉菌和绿弯菌等.拟杆菌则表现出相反的规律, M7站位DNA水平相对丰度较高, 3300-06站位RNA水平相对丰度较高.
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门包括变形菌门中的纲 图 7 门和科水平细菌群落组成相对丰度 Fig. 7 Relative abundances of phylum and family levels of bacterial communities |
在科分类水平上[图 7(b)], 相对丰度最高的Woeseiaceae在RNA水平的相对丰度高于DNA水平, 在M7站位的相对丰度高于3300-06站位.Kiloniellaceae和硝化螺旋菌(Nitrospiraceae)同样在RNA水平上表现出较高的相对丰度, 虽然硝化螺旋菌在DNA水平相对丰度在3300-06站位较高, 但RNA水平相对丰度则在M7站位较高, 这可能与M7站位较高的NH4+-N浓度有关.脱硫杆菌目(Desulfobacterales)中的脱硫杆菌(Desulfobacteraceae)和脱硫球茎菌(Desulfobulbaceae)在RNA水平的相对丰度低于DNA水平, 在M7站位相对丰度高于3300-06站位.厌氧绳菌(Anaerolineaceae)和互营杆菌(Syntrophobacteraceae)等也表现出在RNA水平的相对丰度低于DNA水平, 其中厌氧绳菌虽然DNA水平相对丰度在3300-06站位较高, 但是RNA水平相对丰度却在M7站位较高, 这可能与M7站位较低的DO值有关.
在属分类水平上相对丰度最高的是沃斯菌(Woeseia), 随后是Sva 0081 sediment group、Urania- 1B-19 marine sediment group和硝化螺菌(Nitrospira)等.挑选细菌群落相对丰度最高的前50个属做属水平丰度热图(图 8).样品聚类结果显示, DNA水平和RNA水平属的相对丰度具有明显差异, M7_DNA和3300-06_DNA聚为一类, M7_RNA和3300-06_RNA聚为一类.不同属根据相对丰度的差异可聚为4组, 其中Group Ⅰ主要包括RNA水平上的相对丰度高于DNA水平, 且在3300-06站位相对丰度高于M7站位的种类, 例如Draconibacterium和嗜冷单胞菌(Psychromonas)；Group Ⅱ主要包括RNA水平上的相对丰度高于DNA水平, 但在M7站位的相对丰度高于3300-06站位的种类, 例如沃斯菌和Desulfatiglans；Group Ⅲ主要包括DNA水平的相对丰度高于RNA水平, 在3300-06站位的相对丰度高于M7站位的种类, 例如Halioglobus和Methyloceanibacter；Group Ⅳ则是在DNA水平的相对丰度高于RNA水平, 在M7站位的相对丰度高于3300-06站位的种类, 例如Sva 0081 sediment group和特吕珀菌属(Truepera).此外, 变形菌门的种类多聚集在Group Ⅰ和Ⅱ中, 拟杆菌门则多聚集在Group Ⅲ和Group Ⅳ中, 与门水平相对丰度组成图结果一致.
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图 8 细菌群落属水平丰度热图 Fig. 8 Genus abundance heatmap of bacterial communities |
DNA水平和RNA水平FAPROTAX生态功能预测结果显示(图 9, 相对丰度较高的生态功能分组), 目标站位沉积物中蕴含着活跃的硫循环过程, 例如含硫化合物呼吸作用(respiration of sulfur compounds)和硫酸盐呼吸作用(sulfate respiration).此外, 化能异养(包括chemoheterotrophy和aerobic chemoheterotrophy)、光合作用(chloroplasts)、硝化作用(nitrification)和好氧亚硝酸盐氧化作用(aerobic nitrite oxidation)功能类细菌也具有相对较高的丰度.总细菌群落和活性细菌群落反应的生态功能具有一定的差异, 例如, 在3300-06站位沉积物中, 16S rRNA基因测序结果显示硫循环过程是最主要的生态功能, 但是16S rRNA测序结果则显示化能异养和光合作用占绝对优势(图 9)；在M7和3300-06站位沉积物中, DNA水平反映的光合作用生态功能相对比例仅为1.32%和2.01%, 但是RNA水平反映的相对比例则为10.80%和25.57%.
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图 9 总细菌和活性细菌群落生态功能预测 Fig. 9 Predicted ecological functions of total and active bacterial communities |
本研究中M7和3300-06站位细菌群落丰度低于Liu等[7]对中国北部边缘海沉积物研究中的细菌群落丰度(3.90×109~1.10×1011 copies ·g-1)；M7站位高于乳山湾近海沉积物中细菌群落丰度, 3300-06站位则与之相当(4.90×108~1.12×109 copies ·g-1)[10].通常认为, 微生物群落主要受地理距离和环境变量的影响, 除地理距离外, T和NH4+-N等环境参数很可能是影响M7和3300-06微生物群落丰度差异的重要原因.渤海海域受陆源影响大且自净和交换能力差, 营养盐水平往往高于黄海海域, 南黄海海域底层每年夏季则是冷水团的鼎盛期[32].渤海M7站位和南黄海3300-06站位表层沉积物细菌丰富度高于乳山湾近海沉积物[10]和南海沉积物[33], 低于渤海、北黄海、南黄海和东海北部其他站位表层沉积物[7], 但是多样性则高于其他海域表层沉积物[7, 10, 33].细菌群落16S rRNA基因和16S rRNA序列表明, 与总细菌群落相比, 活性细菌群落表现出较低的α多样性, 结果与先前研究一致[22].
M7和3300-06站位表层沉积物中优势门与其他研究一致, 变形菌门占有绝对优势.研究表明好氧表层海洋沉积物主要的细菌类群为γ-变形菌纲和δ-变形菌纲[3, 5, 7, 10, 21], 本研究中这两种菌群在DNA和RNA水平上均占主要优势.从我国渤海、北黄海、南黄海至东海北部, 表层沉积物中δ-变形菌纲相对丰度逐渐升高、γ-变形菌纲相对丰度逐渐降低(DNA水平)[7], 但是, 本研究没有呈现出同样的规律, 渤海的M7站位γ-变形菌纲和δ-变形菌纲相对丰度均高于南黄海的3300-06站位.目标站位表层沉积物中δ-变形菌纲的大部分细菌类群为硫酸盐还原菌, 而且, 与硫酸盐还原息息相关的Thermodesulfovibrionia是硝化螺旋菌门相对丰度最高的类群, 以上结果表明研究位点具有较强的硫酸盐还原能力.本研究中硫酸杆菌目是δ-变形菌纲中相对丰度最高的目, Sva 0081 sediment group(硫酸杆菌目)是相对丰度第二高的属, 所有硫酸杆菌目都属于硫酸盐还原菌, 由于能够进行碳水化合物的厌氧代谢, 其丰度的高低往往与污染程度有很大的关系[34].因此, 硫酸杆菌目相对丰度的差异表明M7站位的污染程度高于3300-06站位.此外, 化学异养海洋沃斯菌是本研究相对丰度最高的属, 其所属Woeseiaceae科(γ-变形菌纲)是相对丰度最高的科.研究表明Woeseiaceae在海洋沉积物中丰度高且普遍存在, 执行着多种但未知的生态功能[35].硝化螺菌属是相对丰度第4高的属, 其可以将亚硝酸盐氧化成硝酸盐.最近研究发现硝化螺菌属可以进行完全硝化作用, 即同时完成氨氧化及亚硝酸氧化过程[36], 表明目标站位活跃的硝化过程.FAPROTAX生态功能预测结果也证实了硫循环过程、化能异养过程和硝化过程是M7站位和3300-06站位沉积物中主要的生态功能.
基于16S rRNA基因和16S rRNA的测序结果显示, 总细菌群落和活性细菌群落组成具有显著差异.虽然丰度较高的细菌类群在DNA和RNA水平具有一致性, 但是其相对丰度具有明显的差异, 因此, 基于16S rRNA基因的测序可能导致误判重要的功能微生物.例如, 虽然DNA水平上γ-变形菌纲在M7站位远高于3300-06站位, 但是其在RNA水平上3300-06站位却略高于M7站位, 这很可能导致对3300-06和M7站位实际生态功能的误判.γ-变形菌纲在RNA上的相对丰度远低于DNA水平, DNA水平的研究会使人们高估了硫循环生物地球过程, 生态功能预测结果也证实了这一点(图 9).在DNA水平上, 3300-06沉积物中硝化螺菌属相对丰度远高于M7站位, 但是在RNA水平上, 硝化螺菌属相对丰度却低于M7站位, 这说明, 实际上M7站位的硝化活性高于3300-06站位, 生态功能预测也证明了这一推测(图 9).Kiler等[21]在研究波罗的海表层沉积物中发现, 虽然相对丰度较高的OTUs种类在所有样品中具有一致性, 但是, 其在DNA水平和RNA水平的相对丰度具有明显差异, 因此选择以rRNA作为后续研究的基础.垃圾填埋实验表明, 甲烷氧化菌占活性微生物群落的80%, 但是仅占总微生物群落的29%, 如果仅仅基于DNA进行研究, 会对了解活性微生物实际功能产生重大误判[16].
此外, 总细菌群落中的稀有物种, 如蓝细菌门和产氧光细菌纲在总细菌群落中的相对丰度小于0.45%, 但是在活性细菌群落中相对丰度显著升高(3.52% ~11.61%), 表明总细菌群落中罕见的“稀有生物圈(rare biosphere)”可能包括关键的转录活跃者[37].Li等[22]的研究表明, 环境因素通过影响稀有生物类群来影响细菌群落.稀有生物类群种类多样, 当环境条件改变时, 可能会变成丰富类群.因此, 环境变化对总微生物群落的影响主要体现在稀有物种而不是丰富物种.本研究中, 稀有物种蓝细菌等在RNA水平上的大量占比体现了它们在地化循环中的潜在功能以及对环境条件的适应.作为光合微生物, 蓝细菌在夏季M7和3300-06站位表层沉积物的高活性体现了它们的高固氮能力.在先前的研究中也发现, 在所有的实验组中(营养强化或酸化), 水中的丰富物种总是具有较高的相对丰度[38]；长时间的氮沉降实验对微生物群落没有影响[39].然而, 在特定环境下, 一些稀有微生物在活性微生物群落中则变成丰富微生物, 以应对环境变化[38, 39].因此, 稀有物种在元素循环过程中可能发挥着重要的作用[40].
本研究表明海洋表层沉积物中总细菌群落(16S rRNA基因)和活性细菌群落(16S rRNA)结构具有明显差异.对稻田土壤根围微生物研究表明, 活性微生物和总微生物群落也具有明显差异, 活性细菌群落在不同根围部位表现出明显差异, 这表明活性微生物对于根际环境变化更为敏感, 基于16S rRNA的微生物群落更为精确[22].森林土壤中微生物RNA数据显示微生物活性具有明显的季节差异, 但是DNA水平显示的变化则较小[17].对中国南海的海水样品研究发现, 总细菌群落和活性细菌群落之间的多样性和生物地理模式差异很大, 地理距离对总细菌群落影响较小, 对活性细菌群落影响较大[20].对于珊瑚礁沉积物的研究同样发现了总细菌群落和活性细菌群落的差异[19].因此, 在16S rRNA基因测序得到了大量冗余信息的情况下, 基于16S rRNA的测序能为了解微生物群落, 特别是某些重要的功能微生物提供更加精确的信息.
细菌丰度、OTU数、α-多样性、结构、组成及功能预测均表明南黄海站位在DNA和RNA水平的差异大于渤海站位.渤海水深较浅, 受陆源环境影响较大, 其沉积环境易于发生频繁变动, 采样时获得微生物很可能就是具有高度活性的微生物；而南黄海站位水深较深, 离海岸较远, 受人为扰动小, 由于环境较稳定, 微生物不必频繁变动(对环境变化比较敏感的活性微生物[38, 39]可能不会大量增殖以适应环境变化), 因此可能会存在大量不活跃的微生物.因此, 当分析来自稳定沉积环境的微生物样品时, 基于RNA水平的研究可能更能反映真实的生态状况.
4 结论本文主要结论包括：总细菌16S rRNA基因丰度比活性细菌高1~2个数量级；研究站位具有较强的硫酸盐还原能力和硝化作用, M7站位污染程度高于3300-06站位；基于16S rRNA基因的测序在探索微生物群落时可能会误判重要的功能微生物；微生物群落中的“稀有生物圈”可能是转录活跃者, 发挥着重要的生态功能；活性微生物对环境变化更为敏感、更能体现环境的实际生态状况；对于来自稳定沉积环境的样品, 更应该以RNA为基础关注其活性微生物群落特征.
致谢: 本研究样品采集及CTD数据取自青岛海洋科学与技术试点国家实验室深远海科学考察船队共享航次, 该航次由中国科学院烟台海岸带研究所“创新一号”和中国科学院海洋研究所“科学三号”科考船实施, 在此一并致谢.感谢中国科学院海洋研究所工程技术部陈磊老师、中国科学院烟台海岸带研究所牟平海岸带环境综合试验站孙西艳老师和中国海洋大学化学化工学院李丹丹同学在环境因子分析中给予的帮助.
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