2020, Vol. 41
氧化亚氮(N2O)是地球大气中仅次于二氧化碳和甲烷的第3大温室气体, 对全球变暖的直接贡献率约占6%[1].过去普遍认为, 农业和潮湿热带土是大气中N2O的主要来源[2].但近期研究表明：1992~2015年间全球森林生态系统N2O排放总量年均值已达(3.62±0.16)Tg ·a-1[3].除了已知17%的热带森林土壤对其有较大贡献外[4], 由于气温升高和大气氮沉降加剧, 高纬度森林和苔原等自然生态系统也开始大量排放N2O[5, 6].
森林土壤N2O主要来源于土壤氮素的氧化还原反应, 其中硝化和反硝化是最关键的过程[7].已有的研究表明, 硝化和反硝化作用都与N2O的释放存在显著的相关性[8, 9].它们的活性可以作为N2O的释放量的宏量指标[10].携带amoA基因的氨氧化古菌(archaeal ammonium-oxidizers, AOA)和氨氧化细菌(bacterial ammonium-oxidizers, AOB)是驱动硝化作用中限速和中心步骤-氨氧化过程的最重要微生物群[11].反硝化作用所包含的亚硝酸盐还原酶(nirS基因编码的细胞色素cd1和nirK基因编码的含铜酶)将亚硝酸盐(NO2-)还原为一氧化氮(NO), 还有氧化亚氮还原酶编码基因(nosZ)将N2O还原为N2[12~14].硝化和反硝化细菌对土壤含水量、铵态氮(NH4+)和可溶性有机碳(DOC)浓度的变化都很敏感[11].比如, 氨氧化菌生长缓慢且属于兼性营养型, 他们具有适应极端环境的能力, 特别是AOA[11, 15].相反地, 反硝化细菌多属于异养厌氧型, 它们需要高底物和含水量的生存环境[11, 16].因为硝化细菌和反硝化细菌间存在明显不同的环境偏好, 所以不同环境条件下, 支配土壤N2O释放的微生物群落同样有很大的差异.已有研究表明, 在中度湿润、寒冷和NH4+富集的北方森林土壤中, 氨氧化群落调控着土壤N2O的排放[17].与之相对, 在水分饱和、严格厌氧环境且NO3－相对富集的亚热带-热带森林土壤, 反硝化细菌主导着N2O产生的过程[18].但是对于某种森林生态系统中, 不同植被下土壤微生物调控的硝化作用和反硝化作用的变化仍不得而知.
缙云山国家森林保护区位于重庆市北部, 属典型的北亚热带温暖湿润季风气候, 该地区植物种类繁多, 素有“川东小峨眉”之称.目前, 对于该地区土壤的研究多集中于植被变化对土壤理化性质的影响[19, 20], 以及土壤微生物群落的变化[21~23].对亚热带森林土壤N2O产生的微生物学机制缺乏系统性研究.而森林植被变化对微生物调控的氮循环的影响就更知之甚少.本文运用多种分子技术(末端限制性片段多态性分析, 荧光定量PCR技术)对该区域典型植被类型(针叶林、常绿阔叶林、毛竹林、针-阔混交林、草地)表层土壤亚硝酸盐还原酶基因(nirS)、氧化亚氮还原酶基因(nosZ)还有氨氧化基因(amoA)微生物群落结构和丰度进行定性及定量的分析, 并结合其相关功能, 探究土壤功能微生物群落与N2O排放的耦合机制, 以期为亚热带森林生态系统氮循环提供基础数据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况缙云山国家森林保护区位于重庆市北碚区境内(106°17′43″~106°24′50″E, 29°41′08″~29°52′03″N；面积7 600 hm2；平均海拔951.5 m；相对高差600 m), 以下简称缙云山.属典型的北亚热带温暖湿润季风气候.年均气温13.6℃, 年均降水量1 612 mm, 年均日照1 293.9 h, 年平均蒸发量777 mm.缙云山植被类型多样, 有高等植物244科、973属和1 861种.土壤为三叠纪须家河砂岩发育的酸性黄壤(pH 4.0~4.5).
1.2 样品采集与测定方法2016年5月下旬选取马尾松针叶林(针叶林, coniferous forest)、壳斗科阔叶林(阔叶林, broadleaved-leaved forest)、马尾松针叶-壳斗科阔叶混交林(针-阔混交林, mixed broadleaf-conifer forest), 毛竹林(P. pubescen forest)以及草地(grassland)土壤为研究对象, 每种植被类型土壤选择3个取样点, 在0~20 cm土层深度取样, 按四分法进行混匀, 分别取1 kg混后土样, 得到3等份样品, 用无菌PET树脂袋封装, 放于冰盒中带回实验室.取50 g土样于-20℃冰箱保存以备分子实验分析, 其余部分用于理化性质分析.采样点的详细情况见王蓥燕等的研究[23].
理化分析土样在室温下自然风干, 然后研磨过筛(2、1和0.25 mm), 基本理化性质pH、全氮(total nitrogen, TN)、全磷(total phosphorous, TP)、全钾(total potassium, TP)、有效氮(available nitrogen, AN)、有效磷(available phosphorous, AP)、速效钾(available potassium, AK)、可溶性有机碳(dissolve organic carbon, DOC)和含水量(water content, WC)采用文献[24]的方法进行分析.土壤基本理化性质见表 1.
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表 1 土壤基本理化性质1) Table 1 Basic physical and chemical properties of soil |
1.3 硝化势和反硝化酶活的测定
土壤硝化势(nitrifying potential, NP)采用好气培养法进行测定[25].稍作修改, 具体步骤如下：预培养, 每个样品称取干土100 g(过筛2 mm), 置于培养皿中, 加入去离子水至水分含量为25%, 放入培养箱中25℃预培养7 d.使其基本恢复田间状态.培养结束后, 测定土壤含水量.培养, 称取预培养土壤15 g置于250 mL三角瓶中, 加入(NH4)2SO4调节NH4+-N的浓度到40 mg ·(100 g)-1, 按干土的质量计算, 田间持水量调节到60%, 不加(NH4)2SO4溶液的作为对照.将三角瓶放到23℃的黑暗培养箱中培养48 h.培养结束之后, 土壤NO3--N含量的测定以2 mol ·L-1 KCl溶液振荡浸提过滤, 用紫外分光光度法测定.
土壤反硝化酶活(denitrification enzyme activity, DEA)采用硝态氮剩余量法进行测定[26].稍作修改, 具体步骤如下：称取风干土1 g(过筛1 mm)置于50 mL三角瓶.加入10 mL底物溶液(100 mg ·L-1葡萄糖溶液+100 mg ·L-1硝酸钾溶液).用塑料薄膜封口, 置于37℃恒温培养箱培养48 h后, 4 000 r ·min-1离心20 min.用紫外分光光度法测量硝态氮含量(D)值.
1.4 土壤总DNA提取利用Fast DNA spin kit for soil试剂盒(MP BIO, Inc., Irvine, CA, USA)根据制造商提供的说明进行提取.洗脱后总DNA体积为50 μL.利用1%的琼脂糖凝胶电泳确认总DNA的提取质量(电泳条带的单一性), 同时用NanoDrop ND-1000微光分光光度计(Thermo Fisher Scientific, USA)测定浓度.
1.5 荧光定量PCR利用荧光定量PCR技术定量分析涉氮功能基因丰度[27], 具体步骤如下.
标准样品的制作：选用荧光定量PCR引物扩增nirS(nirSCd3aF/R3cd)[28, 29]、amoA古菌(Arch-amoAF、Arch-amoAR)[30]和nosZ(nosZF、nosZ1622)[29, 31]基因片段, 对扩增产物进行纯化(Universal DNA Purification Kit, TIANGEN)并利用克隆技术获得单克隆子.将测序成功的阳性克隆子提取菌液质粒DNA(TIANprep Mini Plasmid Kit, TIANGEN), 用NanoDrop ND-1000微光分光光度计测定质粒DNA浓度并计算拷贝数, 以10倍为间隔系列稀释成荧光定量PCR标准品.
样品测定：将样品与标准品同时进行qPCR检测, 包括阴性对照在内每个样品设3个重复.反应体系为：ABI Prower SybrGreen qPCR Master Mix (ABI, USA)10 μL, nirS、nosZ和amoA的DNA模板分别为5、5和2 μL, 引物各1、1和0.5 μL(10 pmol ·μL-1), 加ddH2 O至终体积20 μL.每个循环中荧光收集在83℃下进行.荧光定量PCR分析由ABI 7500型实时荧光定量PCR系统进行.
1.6 末端限制性片段多态性分析末端限制性片段多态性分析(terminal restriction fragment length polymorphism analysis, T-RFLP)[32]具体步骤如下.
基因片段的扩增：选用正向引物5′端带荧光物质FAM标记的引物扩增nirS(nirSCd3aF、nirSR3cd)、amoA(Arch-amoAF、Arch-amoAR)和nosZ(nosZF、nosZ1622)基因片段.扩增体系为50 μL, 后扩增产物的纯化和浓度测定同1.5节.
产物酶切：采用限制性内切酶MspI、HhaI和MspI(Thermo Fisher scientific Inc., USA)分别对nirS、amoA和nosZ基因的纯化DNA进行酶切, 根据制造商提供的说明进行酶切.随后将酶切产物送至生工生物工程有限公司(上海)进行毛细管电泳测序并输出末端限制性片段(terminal restrictions fragments, T-RFs)图谱[33].
1.7 数据分析土壤理化性质、微生物拷贝数的one-way ANOVA单因素方差分析(LSD和Duncan分析)和皮尔逊相关分析利用SPSS 21.0处理.基于T-RFLP数据, 群落结构α-多样性指数分析, 即丰富度指数(richness, S)、均匀度指数(evenness, J ′)、香农-威尔指数(shannon-weiner index, H′)以及群落结构堆积图, 均利用Excel 2016完成；利用CANOCO软件对土壤环境因子和微生物群落结构进行基于距离尺度的冗余分析(distance-based redundancy analysis, db-RDA), 并运用蒙特卡罗置换检验(Monte Carlo permutation test)去检验约束排序模型的显著性(用F值作为统计量).
2 结果与分析 2.1 不同森林植被土壤硝化势和反硝化酶活特征由图 1可知, 森林土壤反硝化酶活显著高于硝化势, 是其20~160倍, 且各森林植被土壤间涉氮酶活均呈现显著差异(P < 0.05, 图 1).草地土壤反硝化酶活最高, 阔叶林土壤硝化势最高, 而针叶林土壤中2种酶活均是最低值.皮尔逊相关分析表明：森林土壤DEA与土壤pH、DOC、WC、TP和AK呈显著正相关；而NP与土壤DOC、WC、TN、TP和AN显著正相关(P < 0.05), 其中WC和TP达极显著水平(P < 0.01), 见表 2.
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图中字母表示硝化势和反硝化酶活在不同植被土壤中的差异性(P < 0.05), 折线下方字母代表硝化势; 柱上字母代表反硝化酶活 图 1 不同森林植被下土壤硝化势和反硝化酶活的含量 Fig. 1 Nitrification potential and denitrification enzyme activity in forest soil relative to vegetation |
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表 2 硝化作用、反硝化作用与土壤理化性质的相关关系1) Table 2 Correlation between nitrification, denitrification, and soil physicochemical properties |
2.2 不同森林植被土壤产N2O功能基因群落丰度特征
不同森林植被土壤中涉氮功能基因的拷贝数变化情况如图 2.在竹林土壤中涉氮功能基因的拷贝数显著高于其他森林植被土壤(P < 0.05), 而针叶林土壤最低.除了nirS基因, amoA和nosZ基因的拷贝数在不同森林植被土壤间均表现出显著差异性(P < 0.05).涉氮功能基因与土壤理化性质的相关性, 见表 3.其中, DOC、TN、TK、AN以及AK均与3种涉氮功能基因拷贝数达到极显著水平(P < 0.01).此外, amoA基因与TP极显著正相关(P < 0.01), 与WC和AP显著正相关(P < 0.05).nosZ基因与AP同样呈现显著正相关(P < 0.05).与此同时, 涉氮功能基因的拷贝数与反硝化酶活和硝化势的相关性分析显示：amoA基因拷贝数与DEA(P < 0.05, r=0.616)和NP(P < 0.01, r=0.713)均存在显著相关性；nirS基因拷贝数与DEA呈显著正相关(P 0.05, r=0.578)；nosZ基因拷贝数与2种土壤酶活均不存在相关性.
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图中小写字母表示不同涉氮功能基因拷贝数在不同植被土壤中的差异性(P < 0.05), 大写字母表示总涉氮功能基因拷贝数在不同植被土壤中的差异性(P < 0.05) 图 2 不同森林植被下土壤涉氮功能基因拷贝数的变化 Fig. 2 Variation in the copy number of nitrogen-involved functional genes in forest soil relative to vegetation |
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表 3 涉氮功能基因拷贝数与土壤理化性质的相关关系1) Table 3 Correlation between the copy numbers of N functional genes and soil physicochemical properties |
2.3 不同植被土壤产N2O功能基因群落结构特征
基于T-RFLP的群落结构数据, 利用α-多样性的多个特征值(香农-威尔多样性指数、丰富度指数和均匀度指数)表征不同森林植被土壤涉氮功能基因群落结构多样性, 见表 4.就香农-威尔多样性指数而言, 森林土壤nirS基因数值明显高于其他2个基因；阔叶林土壤3种基因均为最高.对于丰富度指数, 森林土壤nirS基因数值明显低于其他2个基因；不同森林植被3个涉氮功能基因的丰富度指数间差异不显著.均匀度指数, nirS基因的数值同样高于其他2个基因, nirS在不同森林植被间存在一定显著差异. 3个涉氮功能基因的特征值与DEA和NP之间的相关分析显示, DEA与所有特征值均不存在相关性；NP与amoA和nosZ基因的特征值显著相关, 其中amoA基因丰富度指数和nosZ基因的香农-威尔多样性指数达到极显著水平(P < 0.01, r为0.712和0.652).
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表 4 不同森林植被土壤涉氮功能微生物的群落特征值1) Table 4 Characteristics of nitrogen-related microbial community structure in forest soil relative to vegetation |
基于T-RFs片段丰度的群落结构数据, 不同森林植被土壤中涉氮功能微生物的群落组成, 由图 3可知, 其中每一个T-RFs片段代表一种微生物种群.在3个涉氮功能微生物群落组成中, nirS微生物群落组成最为丰富, 进一步证明了其最高的香农-威尔多样性指数.阔叶林土壤中涉氮功能微生物组成最为丰富.不同森林植被下, 各涉氮功能微生物都有其独有的优势种群.
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图 3 不同森林植被土壤涉氮功能微生物群落结构的堆积 Fig. 3 Accumulation diagram of nitrogen-related microbial community structure in forest soil relative to vegetation |
由图 4可知, 在针叶林土壤中3个涉氮功能微生物的群落样点分布均与其他森林植被土壤样点相距较远, 即针叶林土壤中的涉氮微生物群落结构较为独特.就nirS和amoA微生物而言, 阔叶林与针-阔混交林的群落结构较为相似；而nosZ微生物, 针-阔混交林却与草地土壤中的群落结构相似.此外, 涉氮功能微生物的群落结构与土壤理化性质和酶活的关系, 见表 5.每个箭头代表其与群落结构的正负关系, 其长度代表对群落结构影响的大小.其中, 涉氮功能微生物群落结构均是由多个土壤理化调控, DOC、AN和WC同时调控多个涉氮功能微生物群落结构.由表 5可知, 在nirS和amoA微生物群落结构中, DOC是最主要的群落结构的环境调控因子；而nosZ微生物群落结构是AN, 此外, amoA和nosZ微生物群落结构与DEA有显著的相关性, 而与NP的相关性不够显著.
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图 4 不同森林植被土壤涉氮功能微生物群落的基于距离的冗余分析排序 Fig. 4 Distance-based redundancy analysis of the soil microbial community structure in forest soil relative to vegetation |
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表 5 不同森林植被土壤涉氮功能微生物群落结构与土壤理化性质的相关性1) Table 5 Correlation between nitrogen-related microbial community structure and soil properties in forest soil relative to vegetation |
3 讨论 3.1 不同森林植被对土壤硝化势、反硝化活性的影响
硝化作用和反硝化作用是土壤氮循环过程中微生物介导的关键过程, 它们调控着N2O从土壤中的排出量[34].本文研究显示：缙云山森林地区土壤中, 反硝化酶活显著高于硝化势, 是主导土壤N2O排放的主要过程.该结果与Zhang等[18]在亚热带森林土壤中所得研究结果一致, 因为天然亚热带森林地区多为湿润饱和土壤[35], 土壤团聚体在水体饱和的情况下, 形成微型的厌氧环境为反硝化微生物提供了最佳的生长环境[36].此外, 有研究表明水分含量影响着土壤氧化能力进而增加了反硝化活性[37].在本文中也同样证明了水含量在亚热带森林土壤中调控氮循环过程起到关键作用[38].除此之外, DOC在森林土壤氮循环过程中也起着关键作用.Xu等[39]在湿润亚热带森林土的研究表明, DOC是反硝化作用的关键因子.而Mørkved等[40]的研究也表明DOC对森林土壤硝化反应有显著影响.在不同植被类型下, 针叶林的反硝化活性和硝化势均被证明处于较低的水平[32, 41], 而阔叶林的硝化作用处在一个较高的水平[41].Huang等[42]的研究指出, 土壤表面植物残余物C/N比越高, 土壤N2O释放的通量越低.而亚热带森林里凋落的针叶的C/N远高于阔叶[44].这或许能解释为何针叶林的硝化作用和反硝化作用相比其他森林类型低.但本文未检测各森林植被落叶的C/N, 所以不能确认缙云山针叶林土壤也是因为这个原因.
3.2 不同森林植被对土壤产N2O功能微生物丰度的影响涉氮功能微生物的qPCR检测能定量某类微生物的潜在数量, 用基因拷贝数来表征[24].本文中, 调控亚硝酸盐还原酶的基因包括nirS和nirK基因, 调控氨氧化过程的amoA基因也包括氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB).但是, 本文中笔者未扩增出nirK基因和AOB.在中国亚热带森林地区已有研究显示, 未在森林土壤中检测到AOB, 但AOA的基因拷贝数却很高[44, 45].有研究表明：氨单加氧酶对氨的依赖是主要原因, 因为在低pH(< 4)土壤中氨的有效性很低[15].但是, 对于为何检测不出nirK基因, 至今没有找到合理的原因.虽然在温带森林土壤中出现过检测不出nirS基因的情况, 归因于pH过低和引物的偏好性问题[46].本文中, 针叶林植被土壤中涉氮功能基因拷贝数总量最低.对于这现象的解释可能是：针叶林的凋落分解速率较慢, 土壤可获得的营养较少, 土壤有机碳含量也较低, 造成微生物总量低进而涉氮功能微生物也低[47].在典型亚热带森林植被土壤的研究中发现：竹林的amoA拷贝数明显高于阔叶林和针叶林[48].但目前没有文献记载, 森林植被间反硝化功能基因拷贝数的差异.涉氮功能基因与土壤理化的相关性分析显示, 3个功能基因拷贝数与碳、氮和钾有明显的相关性[49, 50].此外, amoA基因拷贝数还与水分含量和磷有显著相关性, 是因为AOA对厌氧环境的敏感性强[51].
3.3 不同森林植被对土壤产N2O功能微生物群落结构的影响微生物群落结构多样性确定其在某种生态环境里的稳定性.本文研究发现：nirS反硝化菌群落结构多样性明显高于AOA和nosZ反硝化菌群落结构, 该结果与罗蓉在温带人工林中得到的结果一致.但其他生态系统中nirS反硝化菌群落结构并没有表现出明显的差异[45, 51, 52].阔叶林植被土壤涉氮微生物群落结构多样性指数均高于其他植被[48].本文中阔叶林为壳斗科阔叶林多为常绿或落叶乔木, 已有的研究表明：亚热带常绿阔叶林在水热条件搭配最佳的时段大量换叶[53], 落叶腐化分解为土壤微生物提供了大量的C、N来源以及充足的水分.同时, 从本文db-RDA分析显示出DOC、AN和WC对涉氮功能微生物群落结构显著正相关[16, 50, 51], 这就合理地解释了为何阔叶林植被土壤中涉氮功能微生物的多样性明显高于其他植被.从PCoA分析看出, 针叶林植被土壤涉氮功能微生物表现出明显的特异性.结合针叶林的土壤理化性质, 针叶林土壤是一个高酸低营养的微环境, 对微生物生存就异常严苛, 多为自养的固氮菌[54].在王蓥燕等[23]对缙云山不同林分下微生物的研究已经发现针叶林下微生物种类少, 且群落结构特异性明显, 所以在此基础上涉氮微生物表现出的特异性也是可信的.
3.4 土壤氮相关酶活与产N2O微生物之间的交互关系土壤中氮循环是一系列由涉氮功能微生物介导的酶促反应, 所以涉氮反应的酶活性与微生物的丰度和群落结构有着复杂的联系.本文显示：硝化势和反硝化酶活均与AOA的丰度相关.已有研究表明, 在中国亚热带森林地区, 相较于AOB, AOA是调控土壤硝化作用的主要菌群[44].而后, Jie等[45]研究亚热带森林土壤涉氮功能微生物得到AOA对整个氮循环有关键作用, 不止硝化作用.从已有研究可知：氨氧化过程由amoA微生物调控将NH4+转化成NO3-, 其中NO3-作为反硝化作用的初始底物被反硝化微生物利用[55], 所以AOA的丰度与硝化与反硝化过程显著相关是可信的.目前, nirS和nosZ反硝化菌的丰度与反硝化活性间的显著相关性有着迥然不同的结论[56~58], 笔者认为会出现这样的差异与特定生态环境有显著的关系.而对于亚热带森林地区反硝化作用与反硝化功能微生物群落结构的相关性仍没有具体定论.虽然, 在已有研究中发现硝化或反硝化与涉氮微生物的群落结构没有相关性[58, 59], 但本文中反硝化作用却与2个涉氮功能基因有显著相关性.从本文的群落结构堆积图中可见, 在不同的植被类型下各涉氮功能基因均有不同的优势种群, 当优势种群发生显著变化时很可能影响整个群落结构.笔者推测在植被的差异导致土壤中调控反硝化作用的优势种群变化显著, 进而造成群落结构与反硝化的显著相关性.为了进一步确认以上猜想, 在未来的工作中笔者将采用更先进的分子技术找到具体调控反硝化作用的涉氮功能微生物的种群.
4 结论缙云山亚热带森林地区, 各森林植被类型土壤中硝化势和反硝化酶活均表现出显著的差异(P < 0.05), 且反硝化酶活显著高于硝化势.此外, 土壤DOC、WC和TP是影响反硝化酶活和硝化势的主要环境因子.土壤反硝化酶活主要受nirS反硝化菌和AOA的丰度, 还有AOA和nosZ反硝化菌群落结构的影响；而硝化势主要是由AOA的丰度调控.在5种植被类型间, 针叶林土壤反硝化酶活和硝化势均最低, 3种涉氮功能微生物的丰度最低且群落结构最为独特, 或许针叶林类型是有效控制土壤N2O释放的亚热带植被类型.由上可知：亚热带森林植被类型能显著影响土壤涉氮功能微生物的丰度和群落结构, 进而改变其调控土壤氮素循环的功能.本研究可为我国亚热带森林土壤氮转化的微生物学机制提供基础数据, 对研究土壤氮动态具有重要的生态学意义.
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