2020, Vol. 41
2. 中-塞环境与能源"一带一路"联合实验室, 成都 610225
, XIN Xin1,2
, LU Hang1 , ZHANG Ping-ping1 , WANG Lu-rong1 , ZOU Chang-wu1 , GUO Jun-yuan1
2. China-Serbia"the Belt and Road"Joint Laboratory on Environment and Energy, Chengdu 610225, China
随着我国肉类食品需求量的增加, 生猪养殖在各种肉类养殖业中占据主导地位, 随之带来的环境问题也越来越突出[1].养猪场在养殖中会产生大量废水, 其中富含有机物、氨氮和磷等物质, 若不经有效处理, 会严重污染地表水和地下水, 危害人体健康[2].目前, 许多规模化猪场多采用厌氧-好氧工艺处理该类废水[3].猪场废水经厌氧发酵后, 含碳有机物得到初步降解和去除, 虽然有机态氮转化为无机态氮, 但氮素含量并没有减少, 氨氮浓度仍然很高, 这就造成了低碳高氨氮猪场沼液的产生[4, 5].尽管传统的好氧工艺处理猪场沼液已经发展成熟, 可是出现了由于碳源不足导致其脱氮性能差等实际问题[6].
SNAD工艺(simultaneous partial nitrification, ANAMMOX, and denitrification)是一种高效、低能耗的脱氮除碳新工艺, 适合低C/N废水的处理.该工艺首先通过氨氧化菌、(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)的作用, 把废水中的NH4+-N部分转化为NO2--N[式(1)], 接着厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidation bacteria, AnAOB)将NO2--N和部分剩余的NH4+-N转化为N2[式(2)], 最终, 反硝化菌则在有机物存在的情况下, 将自养脱氮产生的少量NO3--N还原为N2[式(3)][7].
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李冬等[8]采用序批式活性污泥反应器(SBR), 通过人工配水, 启动了SNAD颗粒污泥工艺.范强等[9]通过人工模拟配水考察了SNAD系统各种细菌丰度的变化, 对主要脱氮菌群进行qPCR分析, 得出了AOB和ANAMMOX菌是系统中的优势菌群.Li等[10]在氧化沟工艺中, 通过人工配水在连续流态下成功启动SNAD工艺, 并在处理实际生活污水时, NH4+-N和TN的最大去除率达到了85.6%和76.1%.但是目前关于SNAD工艺的研究多集中于实验室模拟配水且进水NH4+-N浓度较低(多在200mg·L-1以下), 并常用序批式反应器启动, 鲜有关于连续流反应器处理实际猪场沼液和启动过程中微生物种群结构演变的研究.
本研究以低碳高氨氮的实际猪场沼液作为处理对象, 连续流状态下进行SNAD工艺启动, 并通过高通量测序技术分析启动过程中微生物种群演变规律和脱氮性能, 采用qPCR对关键脱氮菌群进行定量分析, 以期为SNAD工艺处理实际猪场沼液高效脱氮提供可靠的实验依据.
1 材料与方法 1.1 实验装置SNAD反应器如图 1所示.反应器为长方体形有机玻璃容器, 其长、宽均为12 cm, 高为24 cm, 有效容积为2 L.反应器分为反应区和沉淀区, 由挡板隔开底部连通, 有效容积比为5:1.反应器通过蠕动泵连续进水, 接种污泥为本课题组实验室前期培养的厌氧氨氧化污泥和部分半硝化污泥[11]以体积比7:3的比例混合, 接种量约为300 mL, MLSS约为4 000 mg·L-1, 同时向反应器中添加PVC聚酯填料(填充率约为有效容积的40%), 填料为圆柱形, 直径约为0.9 cm, 长度约为0.9 cm.反应器底部安装有曝气盘, 通过转子流量计控制DO为(0.4±0.1)mg·L-1, 反应器运行温度为(30±1)℃, 水力停留时间(HRT)为1.5 d.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of the experimental apparatus |
本实验分为人工配水启动和实际猪场沼液替换两个阶段.第一阶段：低DO[(0.4±0.1)mg·L-1]条件下, 采用人工模拟废水, 通过逐步提高氨氮浓度来启动SNAD工艺, 以葡萄糖(106.5mg·L-1)、柠檬酸三钠(290.4mg·L-1)为碳源, NH4Cl(560mg·L-1)为氮源、KH2PO4(85mg·L-1)为磷源、NaHCO3(105mg·L-1)提供碱度, 同时添加微量元素.其中微量元素的组成为(mg·L-1)：CuCl2·6H2O 0.1、ZnSO4·7H2O 0.1、FeCl3 0.3、H3BO4 0.1、CoCl2 0.1和EDTA 0.1[12].第二阶段：采用实际沼液逐步替换阶段, 沼液采用成都市双流区某大型猪场实际沼液.其主要水质指标见表 1.
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表 1 实验进水水质 Table 1 Key water quality indicators of the influent |
1.3 分析方法
本实验中NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法；NO3--N采用紫外分光光度法；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；TN采用碱性过硫酸钾-紫外分光光度法；COD测定采用重铬酸钾法[13].DO和pH分别采用JPB-607A便携式溶解氧分析仪和pHTestr30型pH计测定.游离氨(FA)的计算方法参考Anthonisen平衡方程[14].
1.4 微生物种群组成分析分别取接种污泥(编号为S1)、SNAD工艺初次启动成功阶段污泥(编号为S2)以及沼液替换成功阶段的污泥样品(编号为S3)于离心管内-20℃冷冻保存.采用DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取[15], 并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA.对细菌16S rRNA进行PCR扩增, 引物名称和序列分别是F338(ACTCCTACGGGAGGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)[16].具体如下：95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s、72℃延伸45 s, 共27个循环, 最后72℃终延伸10 min, 每个样品的扩增均做3次重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物[17].参照电泳初步定量结果, 将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量[11]后由Illumina Miseq系统测序(上海美吉生物医药科技有限公司).应用Ⅰ-sanger生物信息云数据分析系统(http://www.i-sanger.com/)分析数据.使用UPARSE软件, 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体.为了得到每个OTU对应的物种分类信息, 采用RDP classifier对97%相似水平的OTU代表序列进行物种分类注释, 分别统计样本中phylum(门)、class(纲)和genus(属)的物种丰度[18].
1.5 qPCR分析以AOB、ANAMMOX菌、NOB和反硝化菌的目的基因为引物进行PCR扩增[19], 表 2和表 3为各功能菌引物序列和扩增程序[20].
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表 2 PCR扩增引物 Table 2 Primers of RCR |
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表 3 PCR反应程序 Table 3 Amplification program of PCR |
2 结果与讨论 2.1 SNAD反应器启动及沼液替换过程中脱氮性能 2.1.1 NH4+-N及TN的去除变化分析
SNAD反应器分为启动阶段(1~180 d)和实际沼液替换(181~326 d)两个阶段, 整个运行过程中, 反应器进出水NH4+-N、TN浓度及其去除率的变化情况如图 2和图 3所示.
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图 2 NH4+-N去除率变化 Fig. 2 Change in NH4+-N removal efficiency |
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图 3 TN去除率变化 Fig. 3 Change in TN removal efficiency |
反应器初步启动阶段(1~180 d).第1~40 d, 反应器进水NH4+-N浓度控制在(200±15)mg·L-1, 出水平均浓度为40.19mg·L-1, 平均去除率为80.08%, 对氨氮具有较好的去除；总氮的平均出水浓度为128.65mg·L-1, 平均去除率为38.82%, 略高于传统活性污泥.原因在于本实验中接种污泥取自本课题组实验室前期培养的厌氧氨氧化污泥和部分半硝化污泥, AOB和ANAMMOX菌的活性很高, 大部分能很快适应新的污水处理环境.
第41~88 d里, 提高进水氨氮浓度为(300±15)mg·L-1, 反应器对氨氮和TN的去除率有明显的下降, 平均去除率分别为38.29%和24.85%.原因在于, 随着进水中氨氮浓度的进一步升高, 其产生的游离氨浓度也越高, 当反应器中FA浓度超过8.5mg·L-1时, AOB的活性受到抑制[21, 22].郑照明等[23]通过研究不同氨氮浓度条件下厌氧氨氧化过程中NO2--N的浓度变化, 发现随着氨氮浓度的提高, SNAD工艺中的NO2--N去除速率下降, 较高的NO2--N会抑制AOB的活性, 对反应器有一定的抑制作用.但随着反应器内微生物对高氨氮环境越来越适应, AOB的活性逐渐恢复, 厌氧氨氧化过程的加强也使NO2--N浓度降低, 第74 d后, 反应器对废水NH4+-N和TN的去除率开始提升, 到第82 d时, 分别上升到59.7%和35.8%.
第90~180 d, 进一步提高进水氨氮浓度为(450±15)mg·L-1, NH4+-N平均去除率达到55.53%, 出水中的平均NH4+-N浓度为201.49mg·L-1；此时TN平均去除率达到47.41%.随着微生物对高氨氮环境的逐渐适应, 反应器的脱氮性能逐步增加.第150 d后, 反应器对NH4+-N和TN的去除率分别达到了70%和55%以上, 脱氮效果明显.可见, 本实验中控制低DO, 逐步提高进水氨氮浓度的方式有利于SNAD工艺的快速启动.陈国燕[24]等采用SBR反应器, 通过接种厌氧氨氧化菌与部分反硝化菌形成厌氧氨氧化与部分反硝化耦合处理模拟城镇污水, 在C/N为2.5, NH4+-N浓度为20~40mg·L-1, NO3--N/NH4+-N比为1.2时, 耦合效果最佳, 对NH4+-N和TN的去除率为92.85%和96.42%.本实验脱氮效率低于前者的原因在于:其一, 进水氨氮浓度在启动成功时达到了(450±15)mg·L-1, 明显高于文献[24]的报道, 氨氮浓度过高会影响某些脱氮菌群的活性, 导致脱氮性能不好；其二, 本实验中其进水C/N接近或低于1, 并且反应器是在连续流态下进行, 对污染物去除难度更高.
实际沼液替换阶段(181~326 d).在模拟废水启动SNAD工艺的基础上, 逐步采用实际猪场沼液替换.在第181~226、227~252和275~326 d, 依次用30%、70%和100%的猪场沼液替换进水.从图 2和图 3可以看出, 每一次提升进水猪场沼液比例的运行初期, 反应器对NH4+-N和TN的去除率都会有短时间的下降.由于实际猪场沼液成分复杂, 可能对反应器中的脱氮功能菌群产生一定的毒害和抑制作用, 影响了AOB、AnAOB等的活性.但是, 随着微生物对实际沼液的快速适应, 反应器对猪场沼液的脱氮性能也越来越好.第298 d后, 反应器对废水NH4+-N和TN的平均去除率分别为63.26%和55.71%.结合本文2.3节中脱氮菌群含量的结果, 表明在实际猪场沼液处理系统存在着短程硝化、厌氧氨氧化和反硝化的脱氮途径.
2.1.2 出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N在SNAD系统中, NH4+-N最终会转化成为N2和少于11%的NO3--N, 故可把硝态氮和亚硝态氮的生成量占氨氮的去除量之比(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N用于评价SNAD工艺是否启动成功及SNAD反应器的性能, 且出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N应低于0.11[25].
整个反应器运行阶段, 出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N的比值变化情况如图 4所示.在反应器启动初期(1~40 d), 出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N值较高, 为0.49；第41~90 d, 提高进水氨氮浓度, 反应器氨氮转化率降低, 而出水NO2--N浓度和积累率提高.第150 d之后出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N开始低于0.11, 说明反应器内初步形成了反硝化过程, 将厌氧氨氧化反应生成的少量硝态氮转化为气态氮, 结合反应器的脱氮效果, 表明SNAD反应器初步启动成功, 在151~180 d期间, 反应器出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N值一直稳定在0.11以下.实际猪场沼液替换阶段, 反应器出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N的比值在0.13~0.24波动, 说明实际高氨氮猪场沼液的加入, 会对反应器系统带来轻微的不良影响, 但是, 随着反应器的继续运行, 相关微生物种群能对实际沼液环境快速适应, 第298 d后, 其出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N的值均小于0.11.
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图 4 出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N的变化情况 Fig. 4 Effluent (NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N variation |
在整个启动运行期间, 反应器内接种污泥S1、模拟废水启动成功时污泥S2及猪场沼液替代成功后的污泥S3的微生物种群组成(门水平)如图 5所示. 3个污泥样品中共同菌门有：绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Armatimonadetes)、Planctomycetes、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和伊格氏杆菌门(Ignavibacteriae)等.随着反应器的运行, 绿弯菌门(Chloroflexi)的相对丰度逐渐增加, 从S1时的18.34%增加到S2时的25.21%, 到S3时占50.78%.由于绿弯菌门多为兼性厌氧生物, 常存在于污泥菌胶团絮状体内部, 能够起到充当骨架的作用[26], 本研究中, S3污泥样品中其相对丰度最大, 其形成的菌胶团能为ANAMMOX菌提供较好的生长环境.同时, 浮霉菌门(Planctomycetes)是厌氧氨氧化的重要菌群, 其相对丰度在3个污泥样品中呈上升趋势, 其相对丰度从接种污泥的1.24%上升到SNAD工艺初步启动成功的8.37%, 当沼液完全替代模拟进水后, 其相对丰度为9.26%, 可见, 采用模拟废水启动SNAD工艺, 再逐步以实际沼液替代的启动方式有利于维系SNAD工艺处理实际猪场沼液时较高数量的厌氧氨氧化菌群, 保证其良好的脱氮性能[27, 28].然而, 变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度在3个样品中相对丰度有所下降, 由接种时的42.36%逐渐下降到19.23%和13.34%, 说明进水中氨氮浓度过高可能会对变形菌门中的某些微生物种群产生抑制作用.
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图 5 污泥样品微生物菌群结构分布(门水平) Fig. 5 Distribution of bacterial community structures in three samples on the phylum level |
反应器启动运行过程中, 污泥微生物种群在纲水平的变化如图 6所示.其中, 厌氧绳菌纲(Anaerolineae)大多数为严格厌氧的细菌, 一般隐藏在污泥菌胶团絮状体内部[29], 其相对丰度增加明显, 从S1时的13.43%增加到S2时的23.59%, 到S3时占44.87%.对变形菌门在纲分类水平的分布特征进行分析可以看出, α-变形菌纲(α-Proteobacteria)的相对丰度较S1时降低, 可能是属于α-Proteobacteria[30]的多数NOB由于进水氨氮浓度的增加而逐渐失去竞争优势, 导致含量下降. 3个污泥样品中, β-变形菌纲(β-Proteobacteria)的相对丰度分别为16.87%, 9.64%和7.89%, 随着反应器的启动运行, 由于高氨氮的实际猪场沼液成分复杂, 引起其相对丰度有所下降, 但本实验中, β-变形菌纲仍是变形菌门中丰度最大的菌群.已有研究表明, 进行亚硝化反应的AOB多属于β-Proteobacteria[31], 有利于保证系统氨氮的转化和亚硝态氮的积累, 在脱氮和污染物的去除起着重要作用[32].δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)的相对丰度有所增加, 其厌氧生长, 具有去除COD的功能.再者, 浮霉菌纲(Planctomycetacia)在3个污泥样品中的相对丰度分别为1.19%、8.24%和9.13%, 本实验中Planctomycetacia作为SNAD系统中典型的厌氧氨氧化菌群[33], 其丰度的增加, 表明启动成功的反应器中明显存在厌氧氨氧化的脱氮途径.
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图 6 污泥样品微生物菌群结构分布(纲水平) Fig. 6 Distribution of bacterial community structures in three samples on the class level |
反应器在启动过程中微生物种群结构组成(属水平)变化如图 7所示.Nitrosomonas作为Proteobacteria门β-Proteobacteria纲一种典型的AOB存在于SNAD反应器中[34], 其相对丰度从S1时的1.55%增加到S2时的2.08%, 表明逐步提高模拟废水中氨氮的浓度有利于反应器内富集一定数量的AOB, 促进短程硝化的实现；随着实际沼液的替换, 而其在S3的丰度略有下降, 但其相对丰度仍有1.98%, 略高于相对于接种污泥.由于实际沼液成分复杂, 可能抑制了AOB的生长繁殖, 但Nitrosomonas仍然是SNAD工艺处理猪场沼液的优势脱氮菌群之一, 完成短程硝化过程.反应器在整个启动过程中, 属于厌氧氨氧化菌Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia的相对丰度均有较大的上升.Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia在3个污泥样品中的相对丰度分别由接种污泥S1样品中的0.01%和未检出(＜0.01%), 上升到S2样品中的5.51%和2.53%, 随着沼液的替换成功, Candidatus_Brocadia的相对丰度略下降至4.66%, 但其丰度仍然很高；而Candidatus_Kuenenia的相对丰度却由2.53%继续增加到4.18%.厌氧氨氧化菌群的明显富集, 有利于SNAD工艺高效脱氮[35].同时, 在处理猪场沼液的SNAD工艺中(S3), 反应器中出现了一些与反硝化功能密切相关的菌群.其中, 典型的反硝化菌属代表为Denitratisoma、Comamonadaceae、Thauera和Rhodobacter.Denitratisoma是红环菌科的一个新属且具有反硝化能力, 能将亚硝态氮还原为氮气[11], 丰度由启动前(S1)的未检出(＜0.01%)增加到启动初步成功(S2)的2.10%, 沼液替换成功时(S3)的丰度也达到了2.06%.Comamonadaceae是一种可将硝酸盐作为电子受体来降解COD的反硝化菌[36], S1、S2和S3时的丰度分别为0.41%、1.19%和1.92%, 在高氨氮浓度猪场沼液的处理系统内具有优势.变形菌门(Proteobacteria)的Thauera属的相对丰度由S1时的0.01%增加到S2时的0.99%, 到S3时增至为1.01%.相关研究表明, Thauera属于氢自养反硝化菌[37], 常出现在高氨氮废水中, 具有高效的反硝化能力[38].Rhodobacter可在厌氧条件下进行自养反硝化作用[39], 其在样品S1、S2和S3中的相对丰度占比分别为0.02%、1.38%和1.02%.可见, 相关反硝化功能菌属在模拟启动阶段以及实际沼液替换成功阶段的相对丰度有明显增长, 说明该类菌群能利用废水中的COD, 通过反硝化作用将多余的NO3--N还原为N2, 实现了SNAD工艺同步脱氮除碳的功能.
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图 7 污泥样品与脱氮功能相关的微生物菌群结构分布(属水平) Fig. 7 Distribution of bacterial community structures associated with denitrification in three samples on the genus level |
采用qPCR对反应器内污泥样品S1、S2和S3的AOB、ANAMMOX菌、NOB和反硝化菌进行定量分析, 结果如图 8所示.启动前污泥样品(S1)中的AOB(以DNA计, 下同)为4.29×108copies·mg-1, 启动成功(S2)和沼液替换成功(S3)分别升高为4.34×109 copies·mg-1和8.69×108copies·mg-1.ANAMMOX菌由S1中的4.54×1011copies·mg-1分别增加到1.41×1012 copies·mg-1(S2)和9.49×1011 copies·mg-1(S3).本实验中, ANAMMOX菌的含量在相关脱氮菌中最高, 与2.2.3节中微生物属水平出现的Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia的研究结果趋势一致.NOB在反应器启动运行期间, 其含量变化不大, 在S1、S2和S3污泥样品中的含量分别为4.82×108、5.84×108和5.66×108copies·mg-1.由于反应器一直处于微曝气状态, NOB可以利用AOB产生的NO2--N进行硝化反应, 但一直处于被抑制状态, 导致其含量比ANAMMOX菌低得多.与此同时, 反应器启动成功时, 反硝化菌含量明显提高, 反硝化菌由接种污泥时的5.71×1011copies·mg-1增加到1.12×1012copies·mg-1(S2)和9.17×1011 copies·mg-1(S3).
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图 8 定量PCR结果分析 Fig. 8 Results of qPCR |
由qPCR分析结果可以看出, AnAOB、反硝化菌和AOB在SNAD工艺中占据的主导地位, AnAOB的含量比AOB和反硝化菌群的数量要高, 一方面, 由于接种污泥是由30%的部分半硝化污泥和70%的厌氧氨氧化污泥混合构成, 接种污泥本身AOB相对较少；另一方面, 为了促使AnAOB的快速富集, 反应器是在黑色遮光布的蔽光状态下启动运行的.同时, qPCR结果表明, AOB对猪场沼液处理的SNAD系统敏感, 其含量在S3样品中显著下降, 但是AnAOB和反硝化菌的数量在猪场沼液替代前后的SNAD系统中变化不大.本实验, 通过高通量测序和qPCR分析手段, 得到了SNAD工艺处理低碳高氨氮废水启动过程中微生物种群的演变以及各脱氮功能菌群的定量结果, 结合反应器宏观脱氮性能的实验结果(2.1节), 可以初步对本实验中SNAD工艺处理猪场沼液的脱氮途径进行分析：AOB将废水中的NH4+-N部分转化为NO2--N, ANAMMOX菌将废水中NO2--N和剩余部分的氨氮转化为气态氮, 并产生少量NO3--N；同时反硝化细菌从废水中COD中获得电子供体将COD氧化的同时将NO3-和少部分NO2-还原成气态氮.反硝化菌通过反硝化作用对硝态氮的去除, 进一步提高了反应器对于氮素的去除效果, 同时也实现了对废水中COD的去除.可见, AOB和反硝化菌共同参与进行的厌氧氨氧化反应是SNAD系统对总氮去除的主要手段, 各脱氮功能菌不同分工和所占比重的不同, 保证了SNAD工艺高效脱氮除碳的实现.
3 结论(1) 在控制DO为(0.4±0.1)mg·L-1, 温度为(30±1)℃, HRT为1.5 d的条件下, 通过人工配水逐步提高进水氨氮浓度能实现连续流SNAD工艺的启动；然后采用猪场沼液逐步替换的方式, 在第298 d完成了SNAD工艺处理实际猪场沼液的启动, 出水(NO3--N+NO2--N)/ΔNH4+-N的值低于0.11, 此后稳定运行期间, 对NH4+-N和TN的平均去除率分别为63.26%和55.71%.
(2) SNAD工艺处理实际猪场沼液中, 优势菌种为Planctomycetacia中的Candidatus_Brocadia(4.66%)和Candidatus_Kuenenia(4.18%), 以及β-Proteobacteria中的Nitrosomonas(1.98%)和反硝化菌Denitratisoma(2.06%), 通过协同作用保证了SNAD工艺高效脱氮的实现.
(3) qPCR结果表明, 处理实际猪场沼液的AOB、ANAMMOX菌和反硝化菌含量分别为8.69×108、9.49×1011和9.17×1011 copies·mg-1, 与接种污泥相比, 均有明显增长.
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