2020, Vol. 41
, SUN Yue , YUE Ge-cheng , ZHANG Hang , WANG Zhou-qiang , LIU Shi-chong , PENG Rui-zhe , YUAN Shi-chao , LI Zai-xing , CUI Jian-sheng
20世纪80年代, Robertson等[1]首次从废水脱硫和反硝化系统中分离出1株好氧反硝化菌(Thiosphaera pantotropha).相比于传统生物脱氮, 好氧反硝化具有如下优势[2]: ①可在同一反应系统中实现硝化与反硝化过程, 降低生物脱氮的操作难度, 大大降低投资和运行成本；②硝化反应的产物可以直接作为反硝化反应的底物, 避免硝酸态氮的积累对硝化反应过程的抑制, 加速脱氮的进程；③反硝化反应产生的碱可以部分中和硝化过程产生的酸, 能够使整个系统的pH值相对稳定.鉴于好氧反硝化菌的独特优势, 近年来研究者从土壤生态系统[3]、活性污泥系统[4]、污水处理厂[5, 6]、湖泊[7, 8]以及水库[2, 9]等系统, 分离了大量高效的好氧反硝化菌, 并在污废水[6]、养殖废水[10]和河道底泥修复[11, 12]等方面的研究越来越多.
由于天然水体独特的水质特征, 目前针对天然水体应用好氧反硝化菌进行生物修复的应用鲜有报道.随着在自然界环境中好氧反硝化现象的发现[13, 14], 使天然水体在好氧条件下实现氮素削减提供了新的可能.比如, Liu等[15]通过藻-菌生物膜法对改善富营养化水体水质进行了研究；Wen等[16]研究了不同分子量的天然有机物和藻类有机物对好氧反硝化菌株脱氮特性的影响规律和作用机制；Zhou等[17, 18]利用扬水曝气技术对周村水库土著异养硝化-好氧反硝化菌进行原位强化, 实现了水体氮素的高效去除.然而, 目前关于好氧反硝化菌的研究主要集中于高效菌株的分离以及在配水环境的脱氮特性研究, 关于自然环境中好氧反硝化菌的分布特征以及影响因素的研究鲜见报道.由于自然环境下好氧反硝化菌群的分布特征以及环境驱动机制, 直接影响高效好氧反硝化菌的定向筛选以及高效菌的环境适应机制的研究, 因此, 基于napA功能基因进行生物标记物, 开展天然环境中好氧反硝化菌群的分布特征以及影响因素的研究变得十分必要.
白洋淀作为华北地区最大的淡水湖泊, 随着雄安新区的设立, 被定义为“新三湖”, 其生态系统健康与否直接关乎新区的建设.历史上, 白洋淀的水体环境一直受到上游外源输入和淀区生活、养殖以及旅游的综合影响, 造成淀区水体水质恶化和污染严重. 2016~2018年夏秋季河北省监测白洋淀淀区及入淀河流水质为劣Ⅴ类, 重度污染, 特别是营养盐超标导致富营养化程度加剧.白洋淀水体氮素和高锰酸盐指数超标严重, 且氮素主要为氨氮和硝酸盐氮.保持白洋淀水体生态系统的健康, 首先要恢复水体的自然复氧功能, 使水体呈现好氧状态.因此, 如何在好氧环境下实现“定向-精准-高效”的氮素削减是白洋淀水体自我修复功能恢复的关键.白洋淀存在冬季冰封期, 为了分离适应低温的高效好氧反硝化菌进行水体氮素削减；本文在该时期选取白洋淀典型区域(入淀河口区、自然区、旅游区、养殖区以及生活区)的水体样品, 通过好氧反硝化菌功能基因(napA)的高通量测序来研究该时期水体好氧反硝化菌群分布特征；并结合网络分析等手段研究该时期好氧反硝化菌群分布的环境驱动因素, 以期将来制定适应白洋淀不同典型区域水体特征的低温好氧反硝化菌的高效定向筛选策略提供必要的技术支持.
1 材料与方法 1.1 研究区域与样品采集结合前期研究[19]和现场调研, 白洋淀划分为5个典型区域, 分别为入淀河口区、自然区、旅游区、养殖区以及生活区.本文选取瀑河和府河两个采样点代表入淀河口区、藻苲淀采样点代表自然区、文化苑采样点代表旅游区、端村采样点代表养殖区以及捞王淀和北田庄采样点代表生活区, 于2019年1月采集水样分析水体好氧反硝化菌群特征以及环境驱动因素, 具体采样点如图 1所示.应用水质多功能测定仪DS5现场测定各采样点水体的温度(T)、溶解氧(DO)、pH、氧化还原电位(ORP)、电导率(EC)、叶绿素(Chl-a)；水样中硝氮(nitrate, NO3-)、氨氮(ammonia, NH4+)、溶解性总氮(dissolved total nitrogen, TDN)、总氮(total nitrogen, TN)、总磷(total phosphorus, TDP)、高锰酸盐指数、总铁(Fe)和总锰(Mn)依据文献[20]测定.
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图 1 白洋淀冰封期采样点示意 Fig. 1 Distribution of the sampling sites in Baiyangdian Lake |
各个采样点用0.22 μm的醋酸纤维滤膜过滤2 L水体样品, 收集水体微生物, 并通过E.Z.N.A.Ⓡ Water DNA Kit(OMEGA, 美国)提取滤膜上的总DNA, 用NanoDrop ND 2000(NanoDrop Technologies, 美国)测定DNA的浓度, 将提取的DNA样品置于-80℃保存, 以备高通量测序.前期研究表明, 可以以napA功能基因为生物标记物来研究其群落特征[21].因此, 本文利用提取的水体总DNA样本利用引物V66F: 5′-TAYTTYYTNHSNAA RATHATGTAYGG-3′和V67R: 5′-DATNGGRTGCAT YTCNGCCATRTT-3′)[22, 23]对水体的napA基因进行PCR扩增, 进而分析好氧反硝化菌微生物群落分布特征(上海美吉生物科技有限公司利用MiSeq进行高通量测序). 20 μL PCR反应体系[23]为: 5×FastPfu Buffer 4 μL, 2.5 mmol ·L-1 dNTPs 2 μL, Forward Primer(5 μmol ·L-1) 0.8 μL, Reverse Primer(5 μmol ·L-1) 0.8 μL, FastPfu Polymerase 0.4 μL, BSA 0.2 μL, Template DNA 10 ng, ddH2 O 11.8 mL.反应程序[23]为:预变性温度95℃ 3.0 min; 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 循环40次；72℃保温10 min.
1.3 微生物生信分析利用R语言分析微生物群落的α多样性以及β多样性分析(http://www.r-project.org/).具体包括：基于R语言的vegan包计算Chao1指数、ACE指数和Richness指数来评估菌群丰度[24], 采用香农指数(Shannon指数)、辛普森指数(Simpson指数)和Pielou指数来表征菌群的多样性[25], 用覆盖率指数(coverage)来表征测序深度[26]；基于R语言的vegan包完成Venn图分析, 来研究不同采样点好氧反硝化菌微生物群落的差异.基于方差膨胀因子(variance inflation factor, VIF)分析筛选影响因子[27], 并通过冗余分析(redundancy analysis, RDA)得到环境因子与微生物群落之间的相关性[28]；采用Mantel test分析来探讨环境因子对微生物群落的影响程度[29].
1.4 网络分析通过MENA分析和R分析进行微生物网络的构建, 利用Gephi软件进行微生物群落的网络可视化[30], 并依据“度(degree)>5”以及“中介中心值(betweenness centrality value) < 1000”的准则来筛选节点作为关键物种[31], 并基于Mantel test分析以及斯皮尔曼相关性分析探讨环境因子对网络模块的影响[32, 33].网络分析中对网络中节点进行如下分类[34]:模块核心(Zi≥2.5, Pi≤0.62), 网络核心(Zi≥2.5, Pi>0.62), 外围节点(普通节点)(Zi < 2.5, Pi≤0.62), 连接点(Zi < 2.5, Pi>0.62).有研究表明[35, 36], 除普通节点外均为网络中的关键节点, 关键节点在模块内、模块间、全网络与其他节点的连接中发挥重要作用.
1.5 数据分析方法本文中绘图所需的软件由R和Origin完成, 数据统计分析由SPSS 23完成.其中P值< 0.05表示存在显著差异, 0.001 < P值< 0.01表示存在极显著差异, P值< 0.001表示存在极其显著差异.
2 结果与讨论 2.1 水体水质分析该时期各个采样点水体的环境因子和水质如表 1和图 2所示, 其中表 1为各采样点的温度、溶解氧、pH、氧化还原电位、电导率、铁和锰的变化情况；图 2为水体氮磷以及有机物的变化情况.该时期各个采样点的水体温度变化范围为1.69~5.86℃, 不同样点间存在差异, 与该区域的水深以及入淀河流有关；溶解氧变化范围为0.78~9.96mg ·L-1, 特别是捞王淀、北田庄以及府河采样点的溶解氧较低, 可能与该地区冰封阻止水体大气复氧和沉积物的高耗氧有关；pH变化范围不大维持在9.65~9.98, 偏碱性；氧化还原电位维持在115~366 mV；府河采样点的电导率最高, 为10 198 μS ·cm-1；自然区的藻苲淀采样点总铁含量最高为0.092mg ·L-1, 生活区的北田庄采样点总铁含量最低为0.027mg ·L-1；入淀河口区的瀑河采样点总锰含量最高为0.072mg ·L-1, 生活区的北田庄采样点总铁含量最低为0.032mg ·L-1.
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表 1 白洋淀冬季冰封期采样点的环境参数 Table 1 Environmental parameters at the sampling sites in Baiyangdian Lake |
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图 2 白洋淀冬季冰封期采样点水质的变化特征 Fig. 2 Changes in water quality of sampling sites in Baiyangdian Lake |
入淀河口区的瀑河和府河采样点的硝氮浓度最高, 达到4.97mg ·L-1和5.76mg ·L-1, 生活区的捞王淀和北田庄采样点的硝氮浓度最低, 为0.70mg ·L-1和0.46mg ·L-1；表明入淀河流是该时期硝氮的主要来源, 同时治理外源输入也是重中之重.府河采样点的氨氮浓度最高, 达到0.45mg ·L-1, 与府河包含保定市区生活污水有关.总氮的变化情况和硝氮一致, 入淀河口区的瀑河和府河采样点的浓度最高, 达到6.52mg ·L-1和8.13mg ·L-1, 远高于地表水环境质量标准Ⅴ类水总氮的限制(2 mg ·L-1).总磷也是入淀河口区采样点最高, 达到1.62mg ·L-1和0.41mg ·L-1, 远高于地表水环境质量标准Ⅴ类水总氮的限制(0.2mg ·L-1).该时期高锰酸盐指数变化范围为5.56~7.82mg ·L-1, 除府河外其他采样点均高于地表水环境质量标准Ⅲ类水限制(6.0mg ·L-1).综上分析, 不同区域采样点的环境参数和水质指标存在较大差异, 基于该环境的好氧反硝化菌群是否会存在差异需要进一步研究.
2.2 微生物α多样性分析如表 2所示, ACE和Chao1指数反映微生物群落的丰富度, 对于ACE指数而言:自然区的藻苲淀以及自然区的入淀河流瀑河采样点最小, 为106.54和136.03；其他采样点的ACE指数较高为300.11~363.27, 旅游区的文化苑最高.Chao1指数与ACE指数的变化特征相一致(R=1.000, P < 0.001), 也是藻苲淀最小, 文化苑最高.Richness指数也是用来评估样本中被检查到的OTU量, 本研究中Richness指数呈现自然区的藻苲淀以及自然区的入淀河流瀑河采样点最小的特征.各个采样点间覆盖率指数维持在0.995 8~0.999 1之间, 表明测序深度能够很好地覆盖物种信息.各个采样点的Shannon、Simpson以及Pielou指数中, 生活区捞王淀和北田庄采样点、养殖区端村采样点以及旅游区的文化苑采样点最高, 明显高于自然区和入淀河口区的采样点；最高的为生活区北田庄采样点, Shannon、Simpson以及Pielou指数达到5.63、0.95和0.69；最低的为瀑河采样点, Shannon、Simpson以及Pielou指数达到0.53、0.10和0.08.综上, 无论是在菌群丰富度还是菌群多样性, 白洋淀冬季冰封期不同采样点间好氧反硝化菌群α多样性存在差异.
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表 2 白洋淀冬季冰封期好氧反硝化菌群生物多样性指数 Table 2 Microbial community diversity of aerobic denitrification bacteria in Baiyangdian Lake |
2.3 细菌群落组成及β多样性分析
将异养硝化-好氧反硝化菌富集驯化过程中的样本进行数据库比对, 同时分析在各个水平上的菌群结构.结果显示属于5个门类78个属, 13 983~23 980个OTU, 具体结果如图 3所示.该时期各个采样点的好氧反硝化菌群主要属于3个门类(图 3), 分别是变形菌门(Protebacterice)、未分类(unclassified_Bacteria)和其他少数细菌门类, 其中变形菌门为第一大门类, 占比为72.77% ~99.41%；未分类菌在文化苑、端村以及北田庄采样点占比较高, 达到22.54% ~27.12%.有研究表明在氮素的微生物代谢过程中变形菌门一直扮演重要的角色[37].在纲水平上, α-Proteobacteria是最大的纲, 其中在入淀河口区和自然区采样点中占比高达81.37% ~97.31%, 在氮磷的代谢过程中发挥重要作用[38]；而β-Proteobacteria为第二大纲, 在旅游区、养殖区以及生活区占比为17.42% ~54.40%, 并且因发现其大多具有脱氮特征[39], 广泛存在于各种污废水的处理系统中[40].γ-Proteobacteria为第三大纲, 在养殖区以及生活区占比为10.08% ~33.92%, 并且被发现在含盐废水反硝化过程中发挥关键作用[41].综上, 在纲水平上各个采样点的差异性逐渐显现, 不同样点间好氧反硝化菌群存在差异.
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图 3 白洋淀冬季冰封期好氧反硝化菌群组成分析 Fig. 3 Community composition of aerobic denitrification bacteria in Baiyangdian Lake |
在属水平上, Leisingera是第一大属, 占比范围为13.49% ~97.04%, 入淀河口区和自然区最多(80.61% ~97.04%), 而且研究表明Leisingera daeponensis DSM23529具有napA基因, 能够进行反硝化脱氮[42]；Thauera和Azoarcus在捞王淀占比最大, 达到26.71%和1.53%, 能够利用芳烃作为碳源进行反硝化[21, 43]；Shewanella在端村和北田庄占比最大, 达到23.60%和8.13%, 研究中发现Shewanella baltica OS678具有好氧反硝化特性[44], 并且许多模式菌株包括Shewanella algae、Shewanella putrefaciens 200以及Shewanella violacea DSS12具有napA基因；Aeromonas在端村、捞王淀以及北田庄采样点的丰度较高, 占比为4.43% ~11.64%, 能够利用各种碳水化合物为碳源进行反硝化脱氮[45], 在水库中被发现为主要的好氧反硝化菌[23], 而且研究发现Aeromonas sp. VNT是一个典型的耐低温高效异养硝化-好氧反硝化菌[46]；Leptothrix_Burkholderiales菌在北田庄采样点的占比最高为9.11%；Bordetella菌端村、捞王淀以及北田庄采样点的丰度较高, 占比为3.50% ~6.29%；Paraburkholderia菌在捞王淀中最高, 为4.51%；Pseudomonas菌在旅游区和生活区采样点的占比较大, 达到1.36% ~2.58%, 作为典型好氧反硝化菌广泛分布于污废水系统[6, 47]和自然环境[48], 同时研究发现Pseudomonas sp. VNT是一个具有耐低温特性的好氧反硝化菌[46]；Janthinobacterium菌在端村和北田庄采样点的丰度最大, 达到1.90% ~2.43%, 与此同时, 研究者从松花江分离了一株耐低温的异养硝化-好氧反硝化菌Janthinobacterium sp. M-11, 能够在2℃下实现硝氮89%的去除[49].综上分析, 白洋淀冬季冰封期自然区的藻苲淀及其入淀河流瀑河群落组成较相似, 其他各采样点间水体好氧反硝化菌群呈现显著差异.
与此同时, 本文通过RDA分析以及韦恩图分析来研究冬季冰封期不同区域采样点水体好氧反硝化菌群的差异.RDA分析结果显示RDA1和RDA2共同解释了总体变化的73.66%, 其中RDA1为46.90%是决定菌群分布的主要因素；硝氮、氧化还原电位、氨氮、溶解氧以及溶解性总磷与RDA1的相关性为-0.53~-1.00, 对采样点藻苲淀、瀑河、府河以及文化苑的排序影响大；温度与RDA1的相关性为0.88, 对采样点捞王淀、北田庄以及端村的排序影响大[图 4(a)].韦恩图分析显示7个采样点间的OTU种类存在显著差异, 共有的OTU种类为13个, 府河、瀑河、藻苲淀、文化苑、端村、捞王淀以及北田庄独有的OTU种类为98个、19个、11个、98个、56个、92个以及82个；入淀河口区瀑河与府河共有的OTU种类为54个, 瀑河与藻苲淀共有的OTU种类为38个, 生活区捞王淀与北田庄共有的OTU种类为129个；其中瀑河与藻苲淀存在不少的共有OTU种类, 与都位于同一区域有关；文化苑具有最高的OTU种类(330个), 自然区的藻苲淀具有最低的OTU种类(88个).显而易见, 该时期不同区域采样点的好氧反硝化菌群存在显著差异[图 4(b)].
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图 4 白洋淀冬季冰封期水体好氧反硝化菌群差异分析 Fig. 4 Bacterial community difference in aerobic denitrification bacteria in Baiyangdian Lake |
基于丰度前100的OTU, 利用R完成物种间的相关性分析, 选取物种(OTU水平)间的斯皮尔曼相关性|r|>0.8, 显著性P < 0.05的物种, 利用Gephi软件来构建白洋淀冬季冰封期水体好氧反硝化菌的微生物网络(图 5).图 5中节点大小与网络节点的度成比例, 节点间边的颜色显示物种间的相关关系：红色为正向关系、绿色为负向关系, 边的宽度与相关系数|r|成比例.有研究发现[36]:网络中的正负相关可以用于推断微生物之间的相互关系, 正相关代表着生态位一致或共生关系, 负相关代表着竞争或捕食关系.
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图 5 白洋淀冬季冰封期水体好氧反硝化菌群微生物网络 Fig. 5 Network of aerobic denitrification bacteria in Baiyangdian Lake |
微生物OTU-OTU网络结果表明:网络分析共得到98个节点579条边, 正向边占比为92.92%, 负向相关的边所占比例为7.08%, 表明该时期水体好氧反硝化菌群物种间合作关系大于竞争关系[图 5(a)]；网络的平均度为11.82、网络直径为7、图密度为0.122、平均加权度为12.19、平均聚类系数为0.65, 模块性为0.48>0.4、表明网络具有模块结构[50]；划分成8个模块, 模块0占比10.20%, 模块1占比24.49%, 模块2占比10.20%, 模块3占比6.12%, 模块4占比14.29%, 模块5占比16.33%, 模块6占比13.27%, 模块7占比5.10%.有关节点的物种分类[图 5(b)], 该网络分为5个模块, 其中Unclassified_Bacteria占比为34.69%、β-Proteobacteria占比为28.57%、γ-Proteobacteria占比为25.51%、α-Proteobacteria占比为10.20%、ε-Proteobacteria占比为1.03%；β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria为主要的物种类别；结合模块分析, 模块1中主要为未分类菌、β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria, 模块5主要为β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria.与此同时, 网络分析共得到67个关键物种OTU, 隶属于α-Proteobacteria的占比为10.45%、β-Proteobacteria的占比为26.87%、γ-Proteobacteria的占比为29.85%以及Unclassified_Bacteria的占比为29.85%, 隶属于模块0占比13.43%、模块1占比35.82%、模块2占比2.99%、模块3占比2.99%、模块4占比19.40%、模块5占比8.96%、模块6占比16.70%, 主要为Aeromonas、Azospira、Bordetella、Pseudomonas、Janthinobacterium、Leisingera、Shewanella、Sulfuritalea、Thauera等20个属.
网络分析依据各节点Zi值和Pi值将所有节点划分为模块核心, 网络核心, 外围节点(普通节点)和连接点四类.如图 6所示, 本网络中仅包括普通节点和连接点.其中, 本网络中共包括32个关键节点(表 3), 隶属于α-Proteobacteria的节点占比为18.75%、β-Proteobacteria占比为28.13%、γ-Proteobacteria占比为12.50%和Unclassified占比为4.62%.结合关键物种的68个OTU, 同时属于关键节点和关键物种的OTU共有11个, 主要为Aeromonas、Azospira、Janthinobacterium、Leisingera、Lysobacter、Paraburkholderia、Rhodopseudomonas以及Shewanella属, 其中除OTU422外, 大多数的OTU丰度较低.
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图 6 白洋淀冬季冰封期水体好氧反硝化菌群分子生态网络节点分布 Fig. 6 Distribution of nodes of molecular ecological network of aerobic denitrification bacteria in Baiyangdian Lake |
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表 3 白洋淀冬季冰封期好氧反硝化菌群关键节点信息 Table 3 Information on key connectors of aerobic denitrification bacteria in Baiyangdian Lake |
2.5 环境因子与微生物群落的关系
与此同时, 本研究基于Mantel test分析环境因子对冬季好氧反硝化菌群落的影响.模块0~3以及模块4~7的物种群落与环境因子的关系分别如图 7所示.其中显示环境因子温度(T)、溶解氧(DO)、硝氮(NO3-)、氨氮(NH4+)和总铁(Fe)是影响模块0物种群落的主要因素, 其中T、DO、NO3-、NH4+和Fe与物种群落的相关系数为0.60(P < 0.001)、0.37(P=0.07)、0.31(P=0.09)、0.32(P=0.09)和0.48(P < 0.05)；氧化还原电位(ORP)、水体蓝绿藻(PCY)、总铁以及总锰(Mn)是影响模块1物种群落的主要因素, 其与物种群落的相关系数为0.48(P < 0.05)、0.40(P=0.07)、0.31(P=0.11)和0.61(P < 0.01)；NO3-、亚硝氮(NO2-)、总氮(TN)、总磷(TP)、高锰酸盐指数(COD)和溶解性总氮(TDN)是影响模块2物种群落的主要因素, 其与物种群落的相关系数为0.59(P < 0.05)、0.63(P < 0.01)、0.58(P < 0.05)、0.42(P < 0.05)、0.34(P=0.06)和0.57(P < 0.05)；溶解性总磷(TDP)是影响模块3物种群落的主要因素, 其与物种群落的相关系数为0.48(P=0.06)；Mn是影响模块4物种群落的主要因素, 其与物种群落的相关系数为0.41(P < 0.05)；电导率(EC)、盐度(Sal)以及总溶解性固体(TDS)是影响模块5物种群落的主要因素, 其与物种群落的相关系数为0.45(P < 0.05)、0.44(P < 0.05)和0.46(P < 0.05)；ORP以及Mn是影响模块6物种群落的主要因素, 其与物种群落的相关系数为0.24(P < 0.05)和0.71(P < 0.05)；TDP是影响模块7物种群落的主要因素, 其与物种群落的相关系数为0.31(P=0.07).综上, 该时期的主要环境驱动因素为温度、氧化还原电位、硝氮、氨氮、溶解性总磷以及铁锰.不同区域采样点水质环境的不同造成了好氧反硝化菌群组成的差异, 因此以后需针对各自区域水质特征, 选取主要环境驱动因子定向筛选高效好氧反硝化脱氮菌株.
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图 7 白洋淀冬季冰封期水体好氧反硝化菌群环境驱动因子分析 Fig. 7 Environmental drivers of aerobic denitrification bacteria in Baiyangdian Lake |
(1) 冬季冰封期水体水质不同区域间存在显著差异, 其中入淀河口区的水体硝氮和总氮最高.冬季冰封期好氧反硝化菌群的α多样性存在显著差异, 其中藻苲淀以及瀑河的菌群丰富度以及多样性最小.
(2) 水体好氧反硝化菌共分为5个门类78个属, 各个采样点的菌群组成存在显著差异；硝氮、氧化还原电位、氨氮、溶解氧、溶解性总磷以及温度是影响菌群分布的主要环境因子.并且物种间以正相关关系为主, 温度、氧化还原电位、硝氮、溶解性总磷以及铁锰是影响微生物不同模块群落的主要环境驱动因素.
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