2020, Vol. 41
2. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 西安 710055
, SUN Yue1 , ZHANG Yi-ran1 , HUANG Ting-lin2
, ZHANG Chun-hua2 , FANG Kai-kai2 , ZENG Ming-zheng2 , LI Zai-xing1 , CUI Jian-sheng1
2. School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China
水库水体作为重要的淡水水体, 近年来, 大多城市将水库作为重要的饮用水水源地.因此, 水体水质的健康与否直接关系着城市居民的用水安全.我国大多数水库存在总氮超标、不同程度富营养化的问题, 威胁城市供水安全[1].目前, 关于水源水库的研究主要着眼于特定时期水质特征[2]、富营养化[3]以及生态评价[4].反硝化作为氮素演变过程的重要阶段, 在氮素循环中扮演重要角色；然而, 针对水源水库水体反硝化微生物群落演变特征及其环境驱动机制的研究还鲜见报道.
春季是周村水库的一个特殊时期, 在这一时期水库水体环境(温度和溶解氧等)改变剧烈, 水体氮素存在一个降低的过程[5]；为了更好地控制氮素污染、保护水库水体, 系统性地深入分析该时期水体反硝化群落演变以及影响因素非常必要.微生物网络分析作为解析微生物群落演变以及环境驱动因子的有力工具被广泛应用.比如：Deng等[6]研究了用乳化植物油修复铀污染地下水中微生物群落应对环境扰动机制；Feng等[7]应用网络分析研究了关键功能类群基于底物资源和空间竞争对生物膜群落恢复力的影响机制；Xue等[8]研究了在水库蓝藻水华发生和消退后浮游生物群落中优势和稀有真核生物间的互作机制；Liu等[9]证实了微型真核浮游生物共存网络的模块与蓝藻生物量的关系以及生物间显著共存关系是变化而非固定的；Yu等[10]通过网络分析得到生物炭的添加可能导致由于环境扰动而产生更高的抵抗变化能力, 从而提高系统的可持续性.
因此, 本文针对周村水库春季水体氮素降低的特定时期, 基于反硝化过程中典型功能基因nirS的高通量测序和微生物网络分析对水体反硝化微生物群落结构的演变特征以及驱动因子进行分析, 通过揭示该时期微生物参与的氮元素生物地球化学循环过程的关键物种以及驱动因子, 以期为周村水库水体氮污染防治提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集及测定周村水库位于山东省枣庄市, 建于1960年、总库容8 400万m3, 是枣庄市重要的水源水库.于2019年春季3~5月的每月15日采集主库区1、2和3号采样点的表层水体(0.5 m)、中层水体(7.5 m)和底层水体(15 m), 分析该时期的水体水质和微生物群落特征, 研究区域及采样点如图 1所示.现场应用DS5(美国哈希公司)测定水体的深度、T、DO、电导率(EC)、氧化还原电位(ORP)、pH值和叶绿素(Chl-a)等环境指标；采集的水样依据文献[11]完成NO3-、NH4+、TN、TOC、高锰酸盐指数、TP、Fe和Mn的测定, 并尽快完成BOD5的测定[11].
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图 1 周村水库春季采样点分布示意 Fig. 1 Map of the sampling sites in the spring of Zhoucun Reservoir |
分别取各个采样点表中底1 L的水样, 并用0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤截留水体微生物, 将滤膜寄送到上海美吉生物公司进行DNA提取；采用引物(Cd3Af/R3cd)反硝化细菌功能基因nirS进行PCR扩增[12], PCR反应体系以及PCR反应参数设置同文献[13].
1.3 测序数据处理及分析 1.3.1 测序数据处理采用QIIME对原始数据进行拼接、过滤和去除嵌合体, 得到有效数据[14].将有效序列按照97%的一致性聚类成为OTU[14], 并采用SILVA数据库对OTU进行注释[15].
1.3.2 α多样性分析α多样性分析[16]采用Chao指数和ACE指数作为菌群丰度估计量(community richness)、Shannon指数和Simpson指数来表征菌群的多样性, 用覆盖率指数来表征测序深度.
1.3.3 β多样性分析采用R语言进行PCoA (principal co-ordinates analysis)分析, 来研究样本群落组成的相似性和差异性[17]；利用置换多因素方差分析(Adonis分析)研究不同分组间在统计学上的差异[18].
1.3.4 指示物种分析采用indicspecies包在R3.4.3中(http://www.r-project.org/)分析春季水体反硝化群落中的指示物种, 并基于RDA和mantel test分析环境因子的影响程度.
1.3.5 物种与环境因子关系分析结合方差膨胀因子分析(variance inflation factor, VIF < 10)和前向选择(R软件中adespatial包)[19], 来筛选主要环境因子；通过RDA分析来研究物种和环境因子间的关系[20].采用R语言进行mantel test分析, 来检验微生物群落与环境因子两个矩阵的相关性, 从而分析环境因子对微生物群落的影响程度[21].
1.4 网络分析利用Cephi软件进行网络可视化分析[22], 选择“度(degree)>5”以及“中介中心值(betweenness centrality value) < 1000”的节点作为关键物种[23].分析水源水库在该时期反硝化群落以及关键物种演变特征；并基于RDA和mantel test分析环境因子对物种以及网络模块的影响.参照前人的研究[22, 24], 本文以各个模块群落主坐标分析的第一主成分来代表各个模块；然后通过计算各模块第一主成分与环境因子的斯皮尔曼相关性来分析微生物网络模块和环境因子的关系.
1.5 统计分析本文中绘图和数据统计分析所需的软件为SPSS、R和Origin完成.其中P＜0.05表示存在显著差异, 0.001＜P＜0.01表示存在极显著差异, P＜0.001表示存在极其显著差异.
2 结果与讨论 2.1 春季水体水质特征周村水库春季水体的水质如图 2所示, 该时期水体T从3月的(6.09±0.70)℃上升到5月的(16.24±4.01)℃；DO从3月的(11.48±0.59) mg·L-1下降到5月的(4.51±6.05) mg·L-1；ORP维持在114~226 mV；TOC、BOD5以及高锰酸盐指数都有个升高的变化, 分别从3月的(3.30±0.20)、(2.91±0.16)和(3.35±0.44)mg·L-1, 上升到5月的(4.74±0.35)、(6.06±0.97)和(4.44±0.58)mg·L-1；NO3-有一个明显地下降过程, 从3月的(0.92±0.05)mg·L-1下降到5月的(0.08±0.03)mg·L-1；NH4+维持在(0.1~0.3)mg·L-1；TN的变化过程与NO3-类似, 从3月的(1.25±0.16)mg·L-1下降到5月的(0.66±0.10)mg·L-1；TP从3月的(0.02±0.01)mg·L-1上升到5月的(0.08±0.02)mg·L-1；Fe有个先上升后下降的变化过程；Mn从3月的(0.06±0.05)mg·L-1上升到5月的(0.16±0.07)mg·L-1.通过单因素方差分析, 可知各个水质指标(除ORP外)在春季3~5月存在显著的差异(P＜0.01)；各个月份间也大多存在显著差异(P＜0.01).与此同时, 随着水体分层的形成, 各个水质指标在水库垂向间差异逐渐增大.
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图 2 周村水库春季水体水质情况 Fig. 2 Changes in the environmental factors in the spring of Zhoucun Reservoir |
如图 3所示, 菌群丰度估计量参数ACE指数和Chao指数呈现了先上升后下降的过程, 从3月的1 044.76±139.68和1 060.78±140.47上升到4月的1 299.10±343.79和1 272.83±257.20, 下降到5月的984.27±168.23和993.67±165.87.表征菌群多样性的Shannon指数呈现下降过程, 从3月的5.48±0.40下降到5月的4.53±0.62, 表明反硝化细菌的多样性减小；Simpson指数在春季没有显著差异(P>0.05), 维持在0.02~0.06；春季菌群覆盖率指数为0.99±0.01, 足以满足测序深度要求.与此同时, α多样性分析除Simpson指数外都呈现显著差异(P＜0.05).
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图 3 周村水库春季水体反硝化细菌群落多样性指数 Fig. 3 Denitrifying bacteria community diversity index in the spring of Zhoucun Reservoir |
通过物种注释, 春季水库水体共得到8703个OTU.分为3个主要的门类, 主要为变形菌门(Proteobacteria), 其余为未分类细菌(unclassified_Bacteria)和环境样本(environmental_samples).其中, 变形菌门为第一大门类, 所占比例为45.27%~78.90%, 从3月的(68.86±9.71)%下降到5月的(58.78±11.48)%；未分类细菌为第二大门类, 所占比例为18.46%~53.81%, 从3月的(28.24±10.32)%上升到5月的(37.35±10.59)%.
而在属水平上(图 4), 图 4中1、2、3表示3个采样点, S、M、B表示表层水体、中层水体以及底层水体；春季水体的微生物群落组成出现了很大差异.主要的属为：unclassified_Bacteria、unclassified_Proteobacteria、unclassified_β-Proteobacteria、Dechloromonas、unclassified_Rhodocyclaceae、unclassified_Burkholderiales和environmental_samples.其中未分类的占主体, 所占比例高达78.27%~97.60%, 可能与关于水源水库环境的反硝化菌研究较少有关.Dechloromonas是水库春季水体的主要反硝化菌, 从3月的(10.90±3.33)%先上升到4月的(13.31±4.42)%, 再下降到5月的(4.42±2.77)%；unclassified_Rhodocyclaceae从3月的(5.05±1.45)%先上升到5月的(8.52±7.90)%；unclassified_Burkholderiales从3月的(3.20±5.05)%先上升到5月的(5.62±14.91)%.有研究表明Dechloromonas能促进有机质和氮磷的去除[25, 26]；与此同时, Dechloromonas作为主要反硝化菌广泛存在于湿地[27]、反硝化反应器[28]和水库[29].另外, Zhang等[30]的研究发现Rhodocyclaceae是在处理低C/N污水的连续反硝化反应器中除氮的关键物种；Zhang等[31]的研究发现Burkholderiales是反硝化生物膜反应器中主要的反硝化菌株.
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图 4 周村水库春季水体反硝化细菌属水平上的群落结构组成 Fig. 4 Microbial community composition of different genus samples in the spring of Zhoucun Reservoir |
图 5(a)为春季水库水体反硝化群落的分布情况.结果表明, PCoA1和PCoA2共解释了整体变化的32%；PCoA显示不同月份的采样点分布较分散, 随着水体分层的形成同一时期的样品点变得更分散, 表明水体反硝化菌群落结构存在差异.与此同时, 基于Adonis分析不同月份反硝化群落结构的差异性, 结果P＜0.001, 表明春季不同月份水体反硝化群落结构存在显著差异.
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Mar1_B表示3月1号采样点底层水体样本, 以此类推，下同 图 5 周村水库春季水体反硝化细菌群落主坐标分析和冗余分析 Fig. 5 PCoA and RDA for the denitrifying bacterial populations in the spring of Zhoucun Reservoir |
通过对春季水体反硝化群落进行分析, 得到62个指示OTU, 隶属于Dechloromonas (7个OTU)、environmental_samples (4个OTU)、Pseudomonas (1个OTU)、unclassified_β-Proteobacteria (6个OTU)、unclassified_Rhodocyclaceae (3个OTU)、unclassified_Burkholderiales (2个OTU)、unclassified_Bacteria (27个OTU)和unclassified_Proteobacteria (12个OTU).与此同时, 通过对指示物种的群落结构进行主坐标分析(图 6), 结果显示：PCoA1和PCoA2共解释了整体变化的43.85%; 3、4以及5月的样本分布在图 6中不同区域, 3月样本分布在第四象限、4月样本分布在第一象限、5月样本主要分布在PCoA的负半轴；并且5月样本分布较分散与该时期水体分层相一致.与此同时, 基于Adonis分析不同月份反硝化菌指示物种群落结构的差异性, 结果P＜0.001, 表明春季不同月份水体反硝化菌指示物种群落结构存在显著差异.
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图 6 周村水库春季水体反硝化细菌指示物种群落主坐标分析 Fig. 6 PCoA for the indicator denitrifying bacterial population in the spring of Zhoucun Reservoir |
为了研究春季水体反硝化菌与环境因子的关系, 本研究基于反硝化菌与环境因子进行了RDA分析[图 5(b)].通过前向选择, 本研究得到3个主要的环境因子为NO3- (VIF=2.41, P＜0.001)、DO(VIF=1.59, P＜0.001)以及TOC(VIF=1.70, P＜0.001), 分别解释了总体变化的16.63%、8.05%和7.92%.RDA分析得到前两个轴分别解释了总体的16.85%和8.21%, 总共解释了25.06%；NO3-与RDA1的相关性为-0.99(P＜0.001)、DO与RDA1的相关性为-0.62(P＜0.001)、TOC与RDA1的相关性为0.87(P＜0.001)；NO3-和TOC是驱动反硝化菌演变的主要因素.
与此同时, 本研究基于Mantel test分析环境因子对春季水体反硝化群落的影响.如图 7所示, 分别为全部物种群落[图 7(a)]、指示物种群落[图 7(b)]以及关键物种群落[图 7(c)]与环境因子的关系.图 7(a)中显示环境因子T、EC、DO、NO3-、TN、TOC、BOD5、TP和Mn是影响全部反硝化物种群落的主要因素.其中T、NO3-、TN、TOC、BOD5以及TP与物种群落的相关系数为0.49(P＜0.001)、0.57(P＜0.001)、0.41(P＜0.001)、0.45(P＜0.001)、0.42(P＜0.001)和0.42(P＜0.001).图 7(b)中显示环境因子T、EC、DO、NO3-、TN、TOC、BOD5、TP和Mn是影响指示反硝化物种群落的主要因素.其与指示物种群落的相关系数为0.40(P＜0.001)、0.29(P＜0.05)、0.22(P＜0.01)、0.43(P＜0.001)、0.33(P＜0.001)、0.30(P＜0.01)、0.30(P＜0.01)、0.39(P＜0.001)和0.21(P＜0.05).与此同时, 物种群落结构的演变与该时期水体水质演变过程相一致, 该时期水体T与NO3-、TN、TOC、BOD5以及TP呈现显著相关.综上可知, T、DO、NO3-、TN、TOC、BOD5和TP是影响群落演变的关键因素.
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PI为高锰酸盐指数, 下同 图 7 周村水库春季水体反硝化细菌群落环境驱动因子分析 Fig. 7 Environmental drivers of the denitrifying bacterial populations in the spring of Zhoucun Reservoir |
选取物种(OTU水平)间的斯皮尔曼相关性|r|>0.8, 显著性P＜0.001的物种；以及物种与环境因子的斯皮尔曼相关性|r|>0.6, 显著性P＜0.01的物种-环境因子；来构建微生物OTU-OTU网络和OTU-环境因子网络, 研究春季水体反硝化菌物种间[图 8(a)]以及物种与环境因子的关系[图 8(b)].图中节点大小与网络节点的度成比例, 节点间边的颜色显示物种间的相关关系、红色为正向关系、绿色为负向关系, 边的宽度与相关系数|r|成比例.
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(a)和(b)中数字为对应的OTU 图 8 周村水库春季水体反硝化细菌群落的网络分析 Fig. 8 Network analysis for the denitrifying bacterial populations in the spring of Zhoucun Reservoir |
微生物OTU-OTU网络结果表明：该网络共得到131个节点316个边, 正向相关的边所占比例高达95.25%、负向相关的边所占比例为4.75%；网络的平均度为4.824、网络直径为10、图密度为0.037、平均加权度为8.118、平均聚类系数为0.559和模块性为0.499>0.4、表明网络具有模块结构[32]；得到26个模块, 表示微生物网络中共有26个功能相近的关系紧密的一组微生物[33], 其中模块1占比20.61%、模块2占比15.27%、模块3占比9.92%、模块4占比9.16%、模块5占比6.11%、模块6占比4.58%、模块7占比4.58%和模块8~26占比29.77%.基于节点度大于6和中介中心值小于1 000的标准, 得到28个关键物种OTU, 分布在模块1中的有17个OTU、分布在模块2中的有9个OTU、分布在模块3中的有13个OTU[图 8(d)].关键物种OTU如下：1 011、1 214、1 248、1 256、1 514、1 529、1 537、1 601、2 201、2 398、2 428、2 524、2 616、2 617、2 666、2 694、2 848、3 128、3 510、4 166、4 756、4 929、5 854、6 597、6 845、7 339、746和806.
微生物OTU-环境因子网络结果表明：该网络共得到140个节点329个边, 正向相关的边所占比例高达51.98%、负向相关的边所占比例为48.02%；网络的平均度为4.7, 网络直径为6, 图密度为0.034, 平均加权度为3.327, 模块性为0.345; 5个模块中模块1占比47.86%, 模块2占比19.29%, 模块3占比18.57%, 模块4占比9.29%, 模块5占比4.99%；模块1中的物种与环境因子NO3-、TN、NH4+和TP有关, 模块2中的物种与环境因子TOC和BOD5有关, 模块3中的物种与环境因子EC、pH和DO有关, 模块4中的物种与环境因子T和高锰酸盐指数有关, 模块5中的物种与环境因子Fe有关.特别地, 与NO3-有关的OTU有61个, 具体如下：1 011、1 214、1 243、1 248、1 256、1 283、1 307、1 514、1 529、1 537、1 574、1 601、1 605、2 201、2 242、2 377、2 390、2 398、2 428、2 524、2 616、2 617、2 633、2 666、2 694、2 702、2 736、2 848、2 876、2 979、3 050、3 092、3 128、322、3 336、3 339、3 510、4 022、4 111、4 148、4 166、434、4 405、4 756、4 929、495、4 950、5 033、5 657、5 854、5 904、6 471、6 538、6 596、6 597、6 845、7 339、746、7 473、806和851.
2.3.2 网络模块与环境因子相关分析为了进一步研究环境因子对春季水体反硝化菌以及群落结构演变地影响, 本文分析了环境因子对微生物模块的相关性[图 8(c)]和关键物种OTU的相关性[图 8(d)].参照前人的研究[22, 24], 本文计算了各个模块的第一主成分来代表各个模块；然后通过计算各模块第一主成分与环境因子的斯皮尔曼相关性来分析微生物网络模块和环境因子的关系.如图 8(c)可知, NO3-对模块1、模块2、模块3以及模块4呈现显著负相关, 相关系数为-0.72(P＜0.001)、-0.74(P＜0.001)、-0.77(P＜0.001)和-0.64(P＜0.001), 表明NO3-对该反硝化菌模块群落演变呈负向作用；TN也与模块1、模块2、模块3以及模块4呈现显著负相关, 相关系数为-0.75(P＜0.001)、-0.72(P＜0.001)、-0.71(P＜0.001)和-0.54(P＜0.001)；T和TP对模块1、模块2、模块3以及模块4呈现显著正相关, 相关系数为0.59和0.57(P＜0.001)、0.62和0.73(P＜0.001)、0.7和0.7(P＜0.001)以及0.73和0.66(P＜0.001), 表明T和TP对这些反硝化菌模块群落演变呈正向作用；环境因子BOD5、高锰酸盐指数、T以及TP对其他模块呈显著负相关, EC、NO3-以及TN对其他模块呈显著正相关.
关键物种OTU与环境因子的相关性如图[图 8(d)]所示, 结果显示：关键物种OTU3510以及OTU4166与NO3-和TN呈现显著负相关, 相关性系数为-0.86(P＜0.001)和-0.83(P＜0.001)以及-0.81(P＜0.001)和-0.73(P＜0.001)；OTU3510以及OTU4166与BOD5、高锰酸盐指数、Mn、T、TOC和TP呈现显著正相关, 相关性系数为0.65(P＜0.01)和0.74(P＜0.001)、0.59(P＜0.01)和0.48(P＜0.05)、0.51(P＜0.05)和0.62(P＜0.01)、0.79(P＜0.001)和0.66(P＜0.001)、0.58(P＜0.01)和0.82(P＜0.001)、0.78(P＜0.001)和0.72(P＜0.001)；大多数关键物种OTU与NO3-和TN呈显著正相关, 相关系数为0.60~0.88(P＜0.001), 与BOD5、高锰酸盐指数、NH4+、T和TP呈显著负相关, 相关系数为0.43~0.83(P＜0.05).与此同时, 基于关键物种的反硝化群落与环境因子的mantel test分析可知, T、EC、DO、NO3-、TN、TOC、BOD5、TP和Mn是影响关键物种反硝化物种群落的主要因素.其与物种群落的相关系数为0.43(P＜0.001)、0.24(P＜0.05)、0.41(P＜0.001)、0.71(P＜0.001)、0.42(P＜0.001)、0.66(P＜0.001)、0.55(P＜0.001)、0.40(P＜0.001)和0.32(P＜0.01).表明, 春季水库水体的环境因子T、DO、NO3-、TN、TOC、BOD5、和TP是驱动该时期水体反硝化菌群落结构以及关键反硝化物种演变的主要因素.
3 结论(1) 春季水体水质T、DO、NO3-、TN、TOC、BOD5、高锰酸盐指数、TP、Fe以及Mn呈现显著差异, 其中NO3-和TN呈现明显的下降过程.
(2) 反硝化细菌主要隶属于变形菌(Proteobacteria), 所占比例为45.27%~78.90%；Adonis分析显示3~5月间水体反硝化群落呈现显著差异(P＜0.001).
(3) 网络分析显示该时期水体反硝化群落物种主体呈正向作用关系, Mantel test、RDA以及相关性分析得出T、DO、NO3-、TN、TOC、BOD5和TP是驱动该时期水体反硝化菌群落结构以及关键反硝化物种演变的因素.
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