2020, Vol. 41
2. 中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110016
, LI Yu-shuang1
, WEI Jian-bing1 , SONG Xue-ying1 , SHI Rong-jiu2 , HOU Yong-xia1 , LIU Si-yao1
2. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China
伴随着经济的快速发展, 我国正经历着大规模的城市化过程.土地利用方式及地表覆被状况不断发生变化, 人为扰动强度增加.旱田和水田等农业用地更替为城市绿化用地或天然林地更替为农业用地, 意味着作物种植和收获的年周期与相当长的森林周期相互取代[1].植被类型、植物源养分(凋落物、根系分泌物)的输入以及养分的分解、转化和积累等物质循环过程的差异在很大程度上会对土壤理化性质及生态过程产生影响[2, 3], 进一步导致土壤微生物的多样性与特异性分布.
相比土壤质量的相对稳定性, 土壤生物学特性则可以更加敏感地表示出土壤内外环境的变化.土壤细菌是土壤微生物的主要组成部分, 探究其群落结构及分布特征是了解其生态功能的关键, 也是标记土壤质量变化, 合理利用土地资源, 促进区域土壤生态系统可持续发展的有效切入点[4].有研究表明, 植物残体(凋落物和根系)在造林过程中发生了变化, 进而影响土壤生物活性及微生物生物量[5].蔡进军等[6]的研究发现, 不同土地利用方式对土壤微生物功能多样性变化的影响较大, 总体趋势为林地>天然草地>耕地, 土壤全氮、有机质、速效磷和速效氮对土壤微生物功能多样性具有显著影响.近年来, 高通量测序技术的飞速发展为人们研究土壤中的微生物及其群落结构提供了技术手段, 但由于微生物之间存在复杂的相互作用, 主要研究内容集中在土壤微生物的多样性水平, 微生物在不同分类学水平上的分布特征及其与环境因子的相关性等方面.生态网络分析技术是基于随机矩阵原理来研究生态系统内作用关系的一种方法, 有助于进一步了解微生物种间的交互作用关系、微生物群落结构变化引起的生态系统功能演变及生态系统的稳定性[7, 8].该方法广泛用于土壤、沉积物等环境中微生物分子生态网络的构建, 具有良好的降噪能力和稳定性[9, 10].赵慧慧等[11]通过构建分子生态网络, 表明石油污染导致土壤微生物网络的拓扑结构发生变化, 负相互作用比例增加, 微生物功能群落间的竞争关系加强.胡晓婧等[12]比较了东北黑土区不同纬度农田土壤的真菌分子生态网络, 发现北部地区真菌网络更加复杂且物种之间存在更多竞争关系, 南部地区真菌网络更不稳定, 易受外界环境扰动.
然而, 针对城市扩张区不同利用类型土地中细菌生态网络的互作分析还鲜有报道.沈阳市沈北新区是“国家可持续发展试验区”, 近年来城市化发展迅速, 大量农业用地转变为城建用地, 是我国城市扩张的典型区域.本文以沈阳市沈北新区全境为研究区域, 采用16S rDNA基因Illumina MiSeq高通量测序技术结合分子生态网络方法, 通过测定土壤细菌群落组成, 揭示了不同利用类型土地的细菌组成特征、网络结构以及土壤理化性质对细菌群落结构的影响, 以期为深入了解城市化对土壤环境质量的影响提供了理论基础和科学依据.
1 材料与方法 1.1 供试土壤分布及样品采集采用均匀网格布点法在沈阳市沈北新区全境设置101个采样点(图 1), 经纬度范围为：123°16′44.45″E~123°42′44.27″E, 41°52′47.04″N~42°10′4.33″N.采样时间为2015年9月15日~2015年10月6日, 期间以晴和多云天气为主.采样点按土地利用类型分为旱田(HT)、城市绿地(LD)、天然林地(TL)和水田(ST).其中, 旱田采样点47个, 种植作物以玉米(34个, 已收割)为主、其它为萝卜、胡萝卜、西红柿和黄瓜等蔬菜(成熟期)及苜蓿; 城市绿地采样点17个, 植被种类主要为杨树、山毛桃、火炬树、灌丛、草坪草及杂草; 天然林地采样点15个, 植被包括油松、榆树、槭树、蒙古栎和杨树; 水田采样点22个, 种植作物为水稻.在每个样点设置200 m×200 m的区域, 采用梅花布点法采集5个位置(区域内中心点及4个顶点)土壤表层(0~20 cm)的土壤样品, 除去动植物残体及石块, 混合均匀带回实验室, 一部分于-20℃冷冻保存用于土壤细菌高通量测序, 另一部分于4℃条件下保存用于土壤理化性质测定.
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图 1 沈北新区土壤采样点分布示意 Fig. 1 Location of sampling sites in Shenyang North New Area |
采用激光粒度仪测定土壤机械组成[13], 分别测定土壤组分中0.01~2 μm粒径(黏粒)、2~20 μm粒径(粉粒)和20~200 μm粒径(砂粒)的含量; 环刀法测定土壤容重; 烘干法测定土壤含水量; 玻璃电极法测定土壤pH(土:水=1:2.5);重铬酸钾-外加热法测定土壤有机质(TOC)含量; 重铬酸钾-硫酸消化法测定总氮(TN); 高氯酸和硫酸-钼锑抗比色法测定总磷(TP)[14].每个样品3次重复.
1.3 高通量测序及分析选用Powersoil DNA Isolation Kit (MoBio, USA)试剂盒提取土壤基因组DNA, 利用Nanodrop 2000(Thermo, UAS)测定DNA浓度及纯度, 通过扩增(引物序列515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′和909 R：5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)、纯化、质控后, 建立Illumina测序文库, 采用Illumina MiSeq平台进行Paired-end 250 bp测序, 测序工作委托中国科学院成都生物研究所完成.测序结果(.fastq)经拼接并去除低质量序列和嵌合体后, 以最少的序列数为标准进行样品序列的重取样.然后生成OTU表(采用序列相似度阈值97%), 与细菌16S rRNA基因序列数据库Greengenes进行比对, 获得各个OTU的物种分类信息.
1.4 网络构建及分析对高通量测序获得的样品的OTU数据进行lg标准化处理, 在Molecular Ecological Network Analyses Pipeline(MENA)网站上传数据后, 构建Pearson相关性矩阵, 基于随机矩阵理论(random matrix theory, RMT)通过设置合适的阈值, 构建4种利用类型土地的细菌分子生态网络(pMENs, phylogenentic molecular ecology networks), 获取并下载网络性质参数文件[9, 15].利用Cytoscape 3.7.1软件对细菌网络进行可视化处理, 得到网络结构.
节点即群落中的物种; 节点之间的连线即物种之间的相互关系, 包括正相关和负相关; 路径长度即两个节点之间的最短距离; 连通度即某个节点与其它节点之间连线的数量; 聚类系数即表示一个节点与其它节点之间连通程度的好坏; 模块性即表征分子生态网络中的模块化特性, 一个生态网络被分成多个模块, 每个模块是生物系统的一个功能单元, 节点的作用由模块间连通度(Pi)和模块内连通度(Zi)表征[12, 16].
1.5 统计分析利用ArcGIS 10.2绘制采样点位; 采用SPSS 19软件进行样地间土壤理化性质和细菌丰度数据的单因素方差分析, 采用LSD进行差异显著性分析; 利用Origin 8.5绘制4种利用类型土地的细菌网络的拓扑角色分布及关键菌群在门水平上的分布.
2 结果与分析 2.1 不同土地利用类型土壤理化性质沈北新区不同利用类型土地理化性质如表 1所示, 除城市绿地土壤pH呈中性外, 旱田、天然林地和水田土壤pH均呈弱酸性, 其中旱田和天然林地土壤pH显著低于水田; 旱田、城市绿地和天然林地含水量相近, 显著低于水田; 水田土壤容重最大, 显著高于旱田和天然林地; 水田土壤黏粒和粉粒含量显著高于其他3种土地利用类型, 而砂粒含量最低; 天然林地有机质和总氮含量最高; 旱田土壤总磷含量显著高于天然林地和城市绿地; 旱田土壤的碳氮比(C/N)显著低于天然林地和城市绿地的; 天然林地的碳磷比(C/P)和氮磷比(N/P)显著高于城市绿地, 旱田和水田则显著低于城市绿地.
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表 1 沈北新区4种不同利用类型土地理化性质1) Table 1 Soil physical and chemical properties offour utilization types of land in Shenyang North New Area |
2.2 细菌在门水平的群落结构及分布特征
如图 2所示，沈北新区4种不同利用类型土地中共有的优势菌群(相对丰度>5%)有：变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi), 其中变形菌门在4类土壤中的相对丰度均较高(27.39%~29.60%), 差异不显著; 酸杆菌门在天然林地中的相对丰度(22.06%)较高, 在城市绿地(15.82%)和旱田(14.78%)中次之, 而在水田(6.36%)中较低; 拟杆菌门在旱田(14.96%)、城市绿地(14.02%)和水田(11.25%)中的相对丰度显著高于天然林地(6.47%)(P＜0.05);绿弯菌门在水田(25.76%)中的相对丰度显著高于城市绿地(6.92%)、旱田(6.18%)和天然林地(5.29%)(P＜0.05).放线菌门(Actinobacteria 13.06%~15.07%)和浮霉菌门(Planctomycetes 5.30%~6.20%)是天然林地、城市绿地和旱田中的优势微生物; 疣微菌门(Verrucomicrobia)是天然林地中(6.59%)的优势微生物.另外, 土壤中部分菌群的相对丰度小于5%而大于1%, 也属于主要菌群：蓝藻菌门(Cyanobacteria)在天然林地、水田和旱田中占优势(2.46%~3.92%); 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)在天然林地、城市绿地和旱田中占优势(1.91%~2.68%); 厚壁菌门(Firmicutes)在天然林地、水田和旱地中占优势(1.21%~2.13%); 硝化螺旋菌门(Nitrospirae 1.87%)和绿菌门(Chlorobi 1.70%)在水田中占优势, 显著高于其他3种利用类型土壤(P＜0.05).上述优势菌群和主要菌群在4类土壤中的相对丰度之和达到了土壤细菌总相对丰度的89.22%~93.20%, 是本研究区域土壤细菌的主体.
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图 2 土壤细菌在门水平上的群落结构及分布情况 Fig. 2 Bacterial community structure and distribution of the soil samples at phylum level |
分别基于4种利用类型土地中细菌的测序结果构建分子生态网络(图 3), 网络特征参数见表 2, 4个网络的节点连通度分布均符合幂定律(Power Law), 阈值自动被确定为0.96、0.87、0.89和0.71, R2分别为0.88、0.92、0.91和0.89, 且平均路径长度、平均聚集系数和模块性均大于随机网络的相应数值, 说明本文构建的细菌分子生态网络复合无标度、小世界、模块化等基本网络特征, 可用于进一步分析[7].
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图 3 沈北新区4类土壤样品中细菌菌群间的网络相互作用 Fig. 3 Network interaction of bacterial flora in four soil samples in Shenyang North New Area |
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表 2 细菌分子生态网络特征参数 Table 2 Characteristic parameters of the molecular ecological network of soil bacteria |
在分子生态网络中, 节点代表群落中的物种, 连接代表物种之间的关系[17, 18].网络节点数、连接数及平均连通度用来指示网络的规模和复杂程度, 平均连通度越大表明网络节点之间具有更为复杂的联系[8].城市绿地、水田和旱田的节点数较高, 天然林地的节点数最低, 其中旱田的连接数和平均连通度最高, 城市绿地和水田次之, 天然林地最低, 表明旱田土壤细菌网络规模更大, 物种间关系更加复杂.网络中物种间的相互关系可描述为正相关和负相关, 正相关表示物种的生态位相同或具有共生关系, 负相关代表着竞争或捕食关系[19].本研究构建的4个网络均以正相关关系占优, 表明了不同利用类型土地中的细菌之间均以协同合作关系为主, 竞争关系较弱, 竞争关系比例大小为TL＞LD＞HT＞ST, 相比其它利用类型土地, 天然林地土壤细菌之间存在更强的竞争作用.
网络平均路径越短意味着物种间传递物质、能量和信息的效率越高[9].在本研究所构建的4个细菌分子生态网络中, 水田和旱田的平均网络路径和模块性较小, 而平均连通度和聚类系数较高, 表明其土壤细菌对外界环境最敏感, 响应迅速, 群落结构更易发生变化; 天然林地和城市绿地土壤细菌响应速度较慢, 环境因子的扰动并不会在短时间内影响整个细菌生态网络, 群落结构更加稳定.
2.4 细菌分子生态网络关键节点特征分析在细菌分子生态网络中, 可以利用节点的模块内连通度(Zi)和模块间连通度(Pi)确定关键物种, 分析土地利用方式对不同节点的拓扑学性质的影响(图 4), 进一步揭示细菌在分子生态网络中的连接作用[8].
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图 4 4类样地土壤细菌网络的拓扑角色分布 Fig. 4 Topological role distribution map of bacterial networks in four types of soil |
网络节点包括：①外围节点(Zi≤2.5, Pi≤0.62), 主要与模块内的节点相连, 连接数很少; ②模块枢纽(Zi＞2.5, Pi ≤0.62), 与模块内的节点高度连接; ③连接器(Zi≤2.5, Pi＞0.62), 与其它模块高度相连; ④网络枢纽(Zi＞2.5, Pi＞0.62), 兼具模块枢纽和连接器的作用[9].一般将Zi≥2.5或Pi≥0.62的节点定为关键节点, 在各自的模块内和模块间与其他节点的连接中具有重要作用[15].
本研究所构建的4个分子生态网络中, 共有节点500个(不含重复), 大部分节点(84.47%~98.52%)是外围节点(图 4), 只有37.6%的节点出现在2个及以上的网络中(图 5), 说明不同分子生态网络的节点组成的差异性较高.天然林地共有18个关键节点, 其中有1个网络枢纽、2个模块枢纽和15个连接器; 城市绿地共有32个关键节点包括1个网络枢纽、5个模块枢纽和26个连接器; 水田共有26个关键节点包括3个网络枢纽、4个模块枢纽和19个连接器; 旱田共有3个关键节点均为连接器.在所识别的关键节点中, 仅有3个OTU作为关键节点分别在天然林地和城市绿地网络间重复出现, 分别为B78(p_Acidobacteria; c_iii1-8)、B661(p_Firmicutes; g_Alicyclobacillus)和B1332(p_Proteobacteria; g_Legionella), 显示出酸杆菌门、厚壁菌门和变形菌门中的部分菌群在本研究区域的土壤细菌网络中起着重要的连接作用, 其中B1332 OTU在2个网络中出现的位置不同, 说明该类细菌在不同利用类型土地中发挥的连接作用具有差异, 而B78 OTU和B661 OTU在天然林地和城市绿地土壤细菌网络中发挥着相似的作用.不同细菌分子生态网络间的关键节点OTU所属分类不同, 模块枢纽OTU、网络枢纽OTU和连接器OTU几乎没有重叠, 表明不同土地利用方式导致细菌种间的交互作用发生转变, 存在物种角色转化现象[11].
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图 5 节点分布韦恩图 Fig. 5 Node distribution Venn diagram |
根据4种不同利用类型土地中的关键菌群在门水平上的分布情况(图 6), 天然林地土壤中的关键菌群分别属于9个菌门, 变形菌门和酸杆菌门所占比例最大, 均达到23.53%;城市绿地土壤中的关键菌群分别属于10个菌门, 以变形菌门和放线菌门为主, 特有的菌门为蓝藻菌门和Elusimicrobia; 水田土壤含有11个门的关键菌群, 主要包括变形菌门、放线菌门、疣微菌门和绿弯菌门, 特有的菌门较多, 分别为Chlamydiae、GN02、硝化螺旋菌门和疣微菌门; 旱田土壤中的关键菌群仅属于3个菌门, 分别为绿弯菌门、变形菌门和WPS-2, 各菌门所占比例一致, 特有的菌门为WPS-2.其中, Armatimonadetes、Elusimicrobia、Chlamydiae、GN02和WPS-2均不属于本研究区域的主体菌门.
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图 6 关键菌群在门水平上的分布情况 Fig. 6 Distribution of key flora at phylum level |
基于RDA分析对土壤理化性质与细菌群落进行解析(图 7), 环境因子对细菌群落的总解释量为39.4%, 轴一和轴二的解释量分别为31.40%和3.34%, 旱田土壤菌群主要受TP影响; 水田土壤菌群主要受黏粒、粉粒和含水量的影响; 天然林地和城市绿地土壤菌群主要受N/P、C/P、TOC、TN和C/N的影响.其中, 含水量(20.6%, F=25.6, P < 0.01)、粉粒(7.3%, F=9.9, P < 0.01)、黏粒(2.7%, F=3.8, P < 0.01)、TP(2.2%, F=3.2, P < 0.01)和C/N(1.5%, F=2.1, P＜0.05)对细菌群落结构影响显著, 而N/P、C/P、TN和TOC的作用不显著.
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图 7 不同土地利用类型土壤整体细菌群落与土壤理化性质的RDA分析 Fig. 7 RDA analysis of soil bacterial community and soil physical and chemicalproperties in different land-use types |
土壤细菌是土壤生态系统的主要组成部分, 其群落结构及分布情况在一定程度上反映了土壤环境的质量状况.在自然环境中, 物种通过形成复杂的网络系统在物质循环、能量流动、环境污染指示和净化过程中发挥着重要作用[20, 21].本文通过构建细菌分子生态网络, 在可视化水平上揭示了不同利用类型土地中的细菌的网络结构.网络节点的拓扑学特征分析表明, 不同利用类型土地中的细菌交互模式有差异, 在整体网络中起着关键作用的OTU(如模块枢纽OTU、网络枢纽OTU和连接器OTU)在各利用类型土地中的丰富度和多样性也不相同.
水田和旱田的节点数、连接数和平均连通度高于天然林地和城市绿地, 表明其土壤中的细菌网络规模更大, 物种间关系更为复杂.城市化过程中, 不同利用方式的土地由于管理措施和覆被状况的差异可能导致土壤理化性质发生变化, 进而影响土壤中的细菌群落结构的独特性和多样性.微生物量、群落结构与功能的演变与土壤C、N和P元素的含量息息相关, 且其中一个元素可能限制微生物对其它元素的吸收利用[8].本研究中, 旱田土壤中的TP含量较高, 与北方旱地作物需磷较多而导致的人类长期的施肥活动相关, 从而影响了细菌的群落结构[22].土壤碳、氮含量的变化受到有机物输入量的影响[23, 24].土壤覆被状况不同会导致土壤细菌群落结构发生变化.地上植物多样性的变化能够通过改变凋落物和根系分泌物直接或间接地促进或抑制土壤微生物的生长, 刺激土壤微生物群落间的物种特异性转变[25, 26].相比水田和旱田, 天然林地和城市绿地植被的物种多样性和群落结构较为复杂, 具有更高的凋落物量、根系生物量及根系分泌物量, 从而促进了碳和氮的积累, 为土壤微生物提供了丰富的养分, 有利于维持其群落的结构和功能.有研究表明, 林地、草地和农田有机物的输入量分别为242.5、28.0和20.1 t·hm-2, 且不同土层中SOC和TN的高低与根系生物量的分布基本一致[27, 28].此外, 林地和草地土壤C/N高于农田, 也与有机物的性质及碳和氮元素的累积速度有关[29].林地和草地根系的木质素含量要高于农作物.同时, SOC的累积速率快于TN, 土壤C/N随时间升高[30, 31].而农田系统是向外输出能量的系统, 尤其是旱田土壤频繁的干湿交替促进了土壤有机碳的分解, 导致C/N表现出降低的趋势[32, 33].土壤含水量对土壤细菌群落结构的多样性有重要影响[34].稻田淹水能增加土壤微生物对底物的利用能力, 加快土壤碳素的周转速度, 促进微生物生长[35].耕作活动有利于促进水和肥相协调, 也是提高农业用地土壤复杂化的重要因素.
在4种不同利用类型土地的细菌网络结构中并未发现共有节点, 仅天然林地和城市绿地之间存在3个共有节点, 进一步说明4类样地土壤细菌网络之间存在很大的差异.另外, 水田和旱田土壤的平均网络路径和模块性较小而平均连通度和聚类系数较大, 表明其土壤细菌的敏感性强, 当外界环境发生变化时, 环境因子的扰动会在短时间内影响整个细菌生态网络, 网络结构的不稳定性增加[36]; 而天然林地和城市绿地土壤细菌的响应速度较慢, 群落结构更加稳定.
4种利用类型土地的细菌群落中, 变形菌门的相对丰度最高, 细菌网络中也发现该菌门是唯一4类土样所共有的占关键节点最多的物种, 说明变形菌门是土壤中普遍存在的重要细菌.这可能与本研究区域土壤有机质含量较高有关, 也可能由于采样期为作物成熟期、凋落物较多.有研究表明, 土壤养分如有机碳含量的差异是驱动土壤微生物生物地理分布的重要因素[37].通常认为α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes是富营养型细菌, 在含碳量丰富的环境中具有较高的生长速率[38, 39].相比其他3类土壤, 旱田土壤有机质含量较低, 且其关键节点中不含拟杆菌门和厚壁菌门, 与上述研究结论相一致.细菌在土壤中的分布也和细菌的生态幅有关[40].物种的生态幅越宽, 受环境因素的影响越小, 其占有的资源和分布范围更广泛且多度更高[41].然而, 微生物的丰度及群落分布情况无法表示它们在网络节点间起到的连接作用的强弱[11], 本研究中酸杆菌门和拟杆菌门的相对丰度在水田(11.25%、6.36%)和旱田(14.78%、15.00%)土壤中较高, 但这2个菌门的菌群在土壤细菌网络结构的关键节点中均未出现, 说明水田和旱田土壤中的酸杆菌门和拟杆菌门菌群与其它菌群的连接关系较弱.城市绿地土壤中的绿弯菌门(6.92%)和天然林地土壤中的浮霉菌门(6.20%)及疣微菌门(6.59%)也同样属于高丰度的非关键菌群.另外, 在4类样地土壤中, 细菌网络的部分关键节点所属的菌群相对丰度较低(< 1%), 并非本研究区域的主体细菌, 表明土壤中低丰度细菌在构建细菌网络中具有重要的作用.探明这些低丰度菌群在土壤物质循环和能量流动中的作用以及是否可以将其中某些菌群视作土壤生态环境质量变化的指示菌群还需要在未来综合同位素示踪、高通量测序等技术在分子水平上进一步探究.
4 结论旱田土壤菌群主要受TP显著影响; 水田土壤菌群主要受黏粒、粉粒和含水量显著影响; 天然林地和城市绿地土壤菌群主要受C/N显著影响.不同利用类型土地中的细菌均以协同合作关系为主.其中, 旱田土壤细菌网络规模更大, 物种间关系更加复杂; 天然林地土壤细菌之间存在更强的竞争作用.酸杆菌门、厚壁菌门和变形菌门中的部分菌群在本研究区域的土壤细菌网络中起着重要的连接作用.土地利用方式不同导致土壤细菌种间的交互作用发生转变, 低丰度细菌在构建细菌网络中也具有关键作用.就农业用地而言, 若将旱田或水田转变为城市绿地, 土壤细菌受环境干扰的响应速度减慢, 群落稳定性和抗干扰能力增强; 而将天然林地转变为农业用地后, 土壤细菌对环境因子波动的敏感性增加, 更易受到影响.
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