2020, Vol. 41
全程自养脱氮(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite, CANON)新型工艺, 即短程硝化和厌氧氨氧化的结合, 相对于传统生物脱氮技术可以节省60%的曝气量、且几乎不需要有机碳源[1], 同时污泥产量相对较低, 因此可降低运行费用.应用自养脱氮工艺需要解决以下关键问题：首先, ANAMMOX菌生长速率缓慢, 倍增时间长达11 d[2], 且对温度[3]、溶解氧(dissolved oxygen, DO)[4]、碱度[5]、pH以及有机物[6]较为敏感, 难以形成竞争优势; 同时, 反应全过程建立在短程硝化稳定的基础之上, 由于氨氧化菌(ammonium oxidizing bacteria, AOB)可为亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB)提供NO2--N, 需要对反应条件精确控制, 防止NOB过量增殖, 破坏短程硝化.
有学者指出, 维持适量游离氨(free ammonia, FA)浓度有利于NOB活性的抑制[7, 8], 这也是实现短程硝化的重要控制手段之一.然而NOB可对FA逐渐适应, 在较高FA浓度环境下NOB的活性可逐渐恢复, 从而导致硝酸盐产量增加[9].很多研究者已利用FA实现了稳定的短程硝化效果, 但对于NOB对FA产生适应性后短程硝化恢复过程的研究较少.为研究在此条件下NOB的活性抑制策略, 本试验以150L的MBBR型CANON反应器为研究对象, 其菌群中的NOB经过长时间的运行已对FA产生了适应性, 此时采用间歇曝气法尝试对NOB活性加以抑制, 结合抑制效果讨论NOB活性变化规律.同时结合高通量测序, 对微生物群落结构进行分析, 对不同运行环境下相关功能菌丰度变化规律进行讨论, 以期为研究者提供参考.
1 材料与方法 1.1 试验装置本试验装置为柱状MBBR型有机玻璃反应器, 如图 1(a)所示.其直径为30 cm, 高度2.5 m, 有效容积为150 L, 反应器外用锡箔纸遮盖避光.反应器当中投加填料, 填充比为50%.反应器中心设置挡板, 在顶部以及底部留有空隙以循环填料; 采用空气泵压缩曝气, 玻璃转子流量计控制气量, 曝气头位于挡板一侧, 填料可在曝气一侧随曝气向上流动, 达到最高点后, 填料在不曝气一侧随水流往下流动, 形成内循环; 设置三相分离器以强化絮状污泥的持留性能.通过加热棒维持水温为(28±3)℃, 并利用便携式水质监测仪监测DO以及pH变化.对MBBR反应器中的絮状污泥进行研究时, 本试验同时采用序批式反应器(sequencing batch reactor, SBR), 其直径与高度分别为20 cm和27 cm, 有效容积为5 L, 如图 1(b)所示.其运行周期时长240 min, 其中进水10 min, 反应200 min, 沉淀20 min, 排水10 min, 排水比为50%, 每日运行6个周期, 通过加热棒维持水温为(28±1)℃.
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1.进水箱; 2.进水泵; 3.空气泵; 4.曝气头; 5.加热棒; 6.三相分离器; 7.搅拌桨; 8.出水阀; 9.电机 图 1 MBBR和SBR反应器 Fig. 1 Experimental apparatus of MBBR and SBR |
本试验全部采用人工配制的无机废水, 水质参数如表 1所示.采用NaHCO3调节碱度.同时添加微量元素, 体积分数为1 mL ·L-1[10].MBBR反应器选用课题组已有的CANON工艺生物膜[11], SBR反应器采用运行稳定后的MBBR中的絮状污泥接种, 进行NOB活性抑制试验.
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表 1 MBBR与SBR反应器的进水水质/mg·L-1 Table 1 Influent water quality of MBBR and SBR/mg·L-1 |
1.3 水质监测方法
NH4+-N：纳氏试剂比色法[12]; NO2--N：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[12]; NO3--N：紫外分光光度法[12]; pH值：采用梅特勒-托利多F2型pH计; 溶解氧：采用Multi 3620 WTW型DO仪; TN＝NH4+-N+NO2--N+NO3--N; 氨氧化速率(ammonia uptake rate, AUR)与亚硝酸盐氧化速率(nitrite uptake rate, NUR)：氧吸收速率法[13]; FA与FNA的计算方法如式(1)和式(2)所示[14]：
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(1) |
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(2) |
式中, [NH4+-N]指混合液NH4+-N浓度(mg ·L-1); [NO2--N]指混合液NO2--N浓度(mg ·L-1); t指混合液温度(℃).
亚硝酸盐积累率(nitrite accumulating rate, NAR)的计算方法如式(3)所示：
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(3) |
式中, δNO2--N指进出水NO2--N浓度差(mg ·L-1); δNO3--N指进出水NO3--N浓度差(mg ·L-1).
1.4 高通量测序将所提取的污泥样品进行高通量测序.高通量测序PCR所用的扩增引物V3-V4区域融合了MiSeq测序平台的通用引物, 避免了后续的建库流程, 采用Nobar_341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和Nobar_805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)[15].PCR体系按照如下进行：10 ng的DNA模板, 5 μL的10×Buffer, 0.5 μL的dNTPs(10 mmol ·L-1), 0.5 μL的正向引物和反向引物(50 μmol ·L-1), 0.5 μL的Plantium Taq(5 U ·μL-1), 无菌水补至50 μL.
2 结果与分析 2.1 MBBR的启动与运行MBBR反应器共运行441 d, 结果如图 2所示.
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图 2 MBBR反应器运行参数及脱氮性能 Fig. 2 Operating parameters and nitrogen removal performance of the MBBR reactor |
(1) 1~130 d
在1~4 d期间, 维持HRT为8 h, TN去除率平均为59.3%, 如图 2(a)所示, TN去除率1 d时最高, 达到70.5%.由于运行初期并未安装三相分离器, 随着反应器的运行, 其中的ANAMMOX污泥不断流失, TN去除率随之下降, 第58 d时, TN去除率仅为9.4%.第90 d增设三相分离器后, TN去除率最低值提高至93 d时的25.3%, 说明ANAMMOX污泥持留性能得到一定改善, 但TN去除率难于进一步提高.在运行期间, TN去除率很不稳定, 介于9.4% ~78.8%之间波动, TN去除负荷平均为0.32 kg ·(m3 ·d)-1.
由图 2(c)中可以看出, 本阶段TN去除率低的主要原因在于, 出水中经常存在大量NH4+-N, 出水浓度最高为350.7 mg ·L-1, NH4+-N去除率平均为47.4%.由于出水NH4+-N浓度不稳定, 混合液中FA浓度间歇性维持在较高水平, 图 2(b)显示, 在此期间FA最高值为37.4mg ·L-1, 最低为0.3 mg ·L-1.研究显示, FA浓度高于0.85mg ·L-1, 可观察到NOB活性受到抑制[16].鉴于此, 本阶段δNO3--N/TN值为0.151, 该值与理论值0.127[17]较为接近, 说明除去ANAMMOX反应伴有硝酸盐生成, 经NOB氧化生成的硝酸盐量低, 短程硝化较为稳定.
(2) 131~204 d
为降低出水NH4+-N浓度, 且进一步强化ANAMMOX菌的持留性能, 反应器于146~204 d将进水泵流量调整为上一阶段的三分之二, 即HRT由上一阶段的8 h调整为本阶段的12 h.此时TN去除率更加稳定, 平均为42.2%, TN去除负荷基本维持不变.然而, 较长的HRT并未明显改善反应器的TN去除率, 反之解除了NOB活性抑制, 导致出水NO3--N浓度升高, δNO3--N/TN值处于0.219~0.541范围内, 严重偏离理论值, 短程硝化被破坏, 成为了制约CANON工艺脱氮性能的重要因素.作者曾采用片状海绵作为填料, 得出了与本试验相似的结论, 即HRT的延长不利于短程硝化的稳定[18].作者注意到, 提高DO浓度虽可以提高NH4+-N与TN去除率, 但δNO3--N/TN值也随之上升.由图 2(d)中可看出, 在133 d与139 d时分别将DO浓度由平均值0.58 mg ·L-1提升至1.22和0.91 mg ·L-1, 此时NH4+-N去除率增至99.5%和98.7%, TN去除率增至64.7%和69.5%, 而δNO3--N/TN值分别增至0.477和0.387, 为防止NOB活性进一步增强, DO在该水平下仅维持1 d, 之后继续维持于平均值.
由于ANAMMOX菌适宜在厌氧环境下生长, 其更多地生长在生物膜里层, 而AOB和NOB等好氧菌则倾向于生物膜表层, 或以絮体形式存在于混合液中, 以对DO充分利用.且在中温环境下, AOB的比增长速率相对NOB有优势, 因此在较短水力停留时间下, NOB更易被淘洗出反应器.此阶段过程中, FA浓度处于0.13~7.97mg ·L-1范围内, 平均值为4.89mg ·L-1.说明FA在此浓度时, 其对NOB活性的抑制效果无法弥补HRT由8 h延长至12 h带来的负面影响.
(3) 205~398 d
为重建短程硝化, 系统205~398 d采用间歇式曝气, 曝气与停曝时间均为1 h, 曝气期间维持DO平均浓度为0.74mg ·L-1.虽然反应器调整为间歇曝气, 但并未对NOB活性产生明显抑制效果, δNO3--N/TN值平均为0.347, NH4+-N去除率与TN去除率平均为54.3%和39.3%.
(4) 399~441 d
本阶段将HRT由12 h降低至6 h, δNO3--N/TN值下降至0.146, 逐渐向理论值恢复, 且TN去除率仍保持稳定.此阶段FA平均浓度为3.35 mg ·L-1, 并未显著增加, 而本阶段DO平均浓度增长至2.13 mg ·L-1, NH4+-N去除率与TN去除率与上一阶段相比无显著变化, 平均为51.6%和42.4%.DO浓度的增加并未大幅提升NH4+-N去除率, 说明系统内AOB活性较低, 同时在DO浓度增加时, 通过降低HRT仍可逐渐恢复短程硝化.
整体而言, 出水NO2--N浓度平均为7.20 mg ·L-1, 并未产生亚硝酸盐积累现象, 这表明ANAMMOX菌以及少量NOB具有较高的活性.而NH4+-N平均去除率仅为52.2%, 甚至在运行末期增加DO浓度时仍未有明显改善, 严重制约了反应器整体脱氮性能.因此, 针对AOB活性进行强化也是CANON工艺不可忽略的重要部分.
2.2 SBR反应器絮状污泥研究为进一步研究NOB已适应FA时的短程硝化恢复过程, 于MBBR反应器运行至第250 d时, 取MBBR反应器中的絮状污泥至SBR反应器进行短程硝化恢复研究.
SBR反应器的整体运行过程可分为2个阶段：其中1~34 d为适应阶段, 此时采用连续曝气, 反应器内DO维持在1.00~1.20 mg ·L-1; 之后35~57 d的NO2--N积累阶段则改为间歇曝气, 控制曝气与停曝时间分别为30 min和20 min, 曝气期间DO浓度控制在0.50~0.60 mg ·L-1.同时, pH全程控制在8.50±0.10.试验结果如图 3所示.
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图 3 SBR反应器运行参数及脱氮性能 Fig. 3 Operating parameters and nitrogen removal performance of the SBR reactor |
图 3(a)反映了运行过程中NH4+-N的去除性能, 在适应阶段, 1~7 d进水NH4+-N浓度平均为99.7 mg ·L-1, 出水NH4+-N浓度平均为1.0 mg ·L-1.然而在图 3(b)中可以看出, 反应产物NO2--N被NOB迅速利用, 出水NO3--N平均为65.9 mg ·L-1, 亚硝酸盐积累率为零, 说明有NOB处于絮状污泥当中, 且具有较高的活性.
9~34 d, 初始NH4+-N浓度提高至149.9~182.0mg ·L-1, 初始FA浓度平均提高至28.8 mg ·L-1, 尝试以高FA浓度达到NOB活性的抑制效果.相较1~7 d时而言, 9~21 d的TN去除率基本不变, 平均值为15.1%, 而22~34 d时, TN平均去除率下降至6.83%.TN去除率出现下降, 可能是ANAMMOX菌活性下降导致的.分析其原因可能是, ANAMMOX菌竞争NO2--N的能力较NOB弱, 以及在高浓度FA的影响下, 其活性受到抑制.Jaroszynski等[19]的研究结果也表明, 当FA浓度大于2 mg ·L-1时, 会对ANAMMOX菌的活性存在一定的抑制作用.在此过程中, 虽然NH4+-N去除率下降至67.6%, 但NH4+-N去除负荷仍维持在0.03 kg ·(m3 ·d)-1, AOB活性保持稳定.同时, NAR仍接近于零, 虽然本阶段初始FA浓度相对升高, 但随着反应的进行NH4+-N被逐渐消耗, 因此FA的效果也逐渐下降, 未能对NOB活性起到充分的抑制作用.另一方面, 说明NOB已对FA产生了适应性, 这也与MBBR反应器的运行结果相吻合.
35~57 d, 反应器由连续曝气改为间歇曝气, 并将曝气量下调至50%, 即曝气过程中DO浓度由1.0~1.2 mg ·L-1下降至0.5~0.6 mg ·L-1.调整后10 d内, 出水NO2--N浓度由0平均增长至189.7 mg ·L-1, NAR由0平均增长至82.0%.同时, NO3--N的浓度增长量由35 d时的36.2 mg ·L-1降低至45 d时的2.6 mg ·L-1, 反应器出现亚硝酸盐积累现象, NOB活性逐渐降低.此后12 d内, NAR稳定于99.2%, 这表明NOB活性得到了有效抑制, 反应器由最初的全程硝化转变为短程硝化.
TN去除率的变化过程如图 3(c)所示, 1~21 d过程中, TN去除率平均为14.8%, 而在22~57 d过程中, TN去除率逐渐下降, 平均降至4.4%.说明由22 d起, ANAMMOX菌活性逐步下降, 反应器运行环境不利于ANAMMOX菌生长.
3 讨论 3.1 MBBR反应器短程硝化不佳原因分析MBBR在整个反应器启动与运行过程中, 短程硝化与TN去除率总是处于互相矛盾之中, 亚硝酸盐是ANAMMOX菌的电子受体, 因此短程硝化是实现自养脱氮的必备条件.为了实现短程硝化, 在试验中, 尽管系统维持了非常好的短程硝化控制条件, 例如中温, 高游离氨, 低DO等, 尤其是高浓度的游离氨, 最高可达到21.9 mg ·L-1, 但是系统始终没有能够完全抑制住NOB的生长.不仅如此, 为了维持短程硝化, 系统牺牲了NH4+-N与TN的去除率, 运行全过程中, TN去除率平均仅为38.6%.且中试MBBR反应器总是处于要么TN去除率不理想, 要么短程硝化不理想的循环之中.中试MBBR反应器污泥源自课题组已有的小试MBBR反应器, 小试期间TN去除率平均为87.9%, 去除负荷平均为0.53 kg ·(m3 ·d)-1[11], 而在反应器从小试放大至中试反应器过程中, 并没有实现较好的自养脱氮功能.
事实上, 有研究表明, DO浓度由0.27 mg ·L-1降低至0.17 mg ·L-1后, 每g污泥中Nitrospira的量由2.61×108升高至1.67×1010个[20].由于不同的NOB菌属对DO的亲和性具有差异, 当DO长期维持在低浓度下时, 会针对性地富集出氧亲和性较好的NOB菌属, 如新加坡樟宜回用水厂将DO浓度从1.7 mg ·L-1降低至1.0 mg ·L-1, 历经2 a运行之后, NAR平均下降47%, 且NOB优势菌属由Nitrobacter转变为Nitrospira[21].本试验维持HRT为12 h的过程中, DO平均浓度为0.6 mg ·L-1, 在此条件下运行70 d后, 仍具备NOB过量增殖的可能性.且低DO环境可能引发丝状菌过量生长, 污泥沉降性能恶化, 这将不利于ANAMMOX菌在系统中维持稳定的丰度.
3.2 SBR污泥短程硝化良好原因在SBR反应器当中, 尽管NOB已对FA形成适应性, 最终却得以实现稳定的亚硝酸盐积累, 通过监测并计算氨氧化速率与亚硝酸盐氧化速率, 得到结果如图 4所示.
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图 4 SBR反应器AOB及NOB活性变化 Fig. 4 AOB and NOB activity of the SBR reactor |
本试验过程中, AUR由98.6 mg ·(g ·h)-1降低至94.6 mg ·(g ·h)-1, NUR则从24.8 mg ·(g ·h)-1降至0, 说明采用SBR反应器, 采用间歇曝气形式, 结合FA与DO的控制, 可以实现稳定的短程硝化.由图 2(d)可见, 在运行过程中, 由于氨氧化过程消耗碱度, pH值随着反应的进行不断下降, FNA浓度逐渐升高, 在40~57 d由于亚硝酸盐稳定积累, 反应末FNA浓度平均为0.82 mg ·L-1, 杨宏等[22]的研究结果表明, FNA浓度为0.7 mg ·L-1时, 可逐渐将NOB的活性完全抑制住, AOB则仍可维持56%以上的活性, 说明在SBR反应器中, FNA可能也发挥了作用.此外, 1 d时反应器TN去除率为13%, 而运行至57 d时, TN去除率下降至3%, 其原因是ANAMMOX菌丰度不足, 无法及时利用NO2--N, 受到基质性抑制[23].
3.3 微生物分析为研究MBBR反应器以及SBR反应器运行过程中微生物群落结构变化, 于第210 d取MBBR反应器中的絮状污泥以及生物膜分别进行高通量测序, 结果如图 5所示.
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图 5 高通量测序结果 Fig. 5 High-throughput sequencing results |
其中, Candidatus Kuenenia为主要的ANAMMOX菌属, 在絮状污泥以及生物膜当中, 分别占比7.91%及17.38%, 不难看出生物膜更适合ANAMMOX菌的成长.生物膜当中存在DO浓度梯度, 多数ANAMMOX菌生长于其内层的缺氧区[24], 同时外层生物膜也可针对持留性能加以强化, 因此生物膜中ANAMMOX菌丰度高于絮状污泥.同时, 反应器中存在少量Candidatus Brocadia, 在絮状污泥以及生物膜中分别占比0.87%及0.62%.有研究认为Candidatus Kuenenia易于在人工配水环境下生存, 而Candidatus Brocadia倾向生长于自然环境中[25], 且亦有试验表明, 由侧流改为主流后, Candidatus Kuenenia取代成为优势[26].Candidatus Kuenenia底物亲和性能相对较强, NO2--N半速率系数为0.2~3 μmol ·L-1[27], Candidatus Brocadia则为5 μmol ·L-1[28], 由于MBBR反应器为一体式, 短程硝化及厌氧氨氧化于同一反应器内全部完成, 反应生成的NO2--N被ANAMMOX菌以及少量的NOB即时利用, 亚硝酸盐积累率较低, 驯化过程中检测到的NO2--N浓度平均低于2mg ·L-1, 说明Candidatus Kuenenia具有在较低NO2--N浓度环境下生存的能力.
本试验中, 主要的AOB菌属为Nitrosomonas, 分别在絮状污泥以及生物膜中占比27.43%以及2.55%, AOB与不同污泥性状之中的丰度具有较大差异, 说明絮状污泥与生物膜于MBBR反应器中各司其职, 强化絮状污泥的持留性能可以将系统中AOB维持在较高的丰度, 提高氨氧化效率.同时, Nitrospira为主要的NOB菌属, 占比分别为0.30%以及0.28%.不论是絮状污泥或是生物膜中, NOB丰度均低于AOB, 这与部分学者的研究结果, 即CANON工艺中, 微生物絮体当中NOB丰度相对较高具有差异[29].同时, 也说明MBBR反应器中NOB活性较高, 虽然系统当中NOB丰度较为有限, 且运行过程中FA与DO的平均浓度分别为5.7 mg ·L-1和1.0 mg ·L-1, 但仅存的NOB仍可导致δNO3--N/TN值失衡, 破坏短程硝化稳定.
SBR反应器运行至第60 d时, 取其中絮状污泥进行高通量测序, 结果如图 5所示.试验建立并维持稳定的短程硝化后, 相较于试验初期, 絮状污泥当中AOB的丰度由最初27.43%降低至1.18%, 同时NH4+-N去除率由1 d时的97.5%降至57 d时的43.7%; ANAMMOX菌的相对丰度则由1 d时的7.91%降至57 d时的0.01%, TN去除率对应地由13%降至3%, 说明在短程硝化恢复过程当中, AOB以及ANAMMOX菌丰度下降导致了系统NH4+-N以及TN去除率下降.Nitrospira仍是NOB中的优势菌属, 且其相对丰度由1 d时的0.3%升高至57 d时的1.39%.试验过程中, DO均保持在较低水平, 以及试验过程中较高浓度的初始FA, 均会对AOB活性产生一定的影响.同时, 每周期末高浓度的FNA也会一定程度上降低ANAMMOX菌活性[30].尽管在试验过程中NOB逐渐失去活性, 但由于各周期末NO2--N浓度相对较高, 充足的底物浓度为其在不利条件下生存提供了可能性.同时也说明了在短程硝化稳定的反应器中, NOB仍有机会进行增殖, 其在此条件下的生命活动规律仍需进一步研究.
虽然通过高通量测序表明, SBR反应器的短程硝化效果历经55 d的恢复后, AOB的丰度明显下降, 但是AUR的测定结果显示, 短程硝化建立后, AUR由1 d时98.6 mg ·(g ·h)-1降至55 d时94.6 mg ·(g ·h)-1, NUR则由1 d时24.8 mg ·(g ·h)-1降至0, 但NOB丰度从0.3%增至1.39%.不论是AOB还是NOB, 其高通量测序结果均与活性测定试验结果相互矛盾, 说明很可能有未知的AOB、NOB菌群未被高通量检出, 或是二者在不同环境条件下有截然不同的代谢方式.
比较MBBR反应器与SBR反应器, 中试MBBR反应器难以获得稳定并高效的短程硝化的原因有：首先, 反应器从小至大, 加大了控制难度; 其次, 在MBBR反应器中, NOB容易获得隐蔽的空间, 而SBR的活性污泥中, 由于近乎均质的基质浓度, 使得控制条件一旦不利于NOB的生长, NOB很难获得栖息之地, 并且随着不断的冲洗, 絮状的NOB更容易被淘洗出系统, 而MBBR系统中, NOB很可能粘附中填料上并最终导致短程硝化的失败.需要说明的是, 本试验是在进水中无有机物的条件下得到的结论, 在有机物进入系统后, 其对于短程硝化与厌氧氨氧化都将产生影响, 其进行短程硝化的控制还需要进一步研究.
4 结论(1) 采用150 L的MBBR反应器启动CANON工艺, 维持温度于(28±3)℃, DO平均为1.04 mg ·L-1, 进水NH4+-N浓度平均为400 mg ·L-1, HRT平均为12 h时, 短程硝化与TN去除率互相制约, TN去除率平均为38.2%, δNO3--N/TN值平均为0.274, 反应器未实现良好的短程硝化效果.当HRT降至6 h后, δNO3--N/TN值由0.347下降至0.146, 短程硝化逐渐恢复.
(2) 采用SBR反应器, 分别维持曝气与停曝时间为30 min与20 min, 好氧过程中DO浓度为0.5~0.6 mg ·L-1, 且每周期末FNA浓度高于0.18 mg ·L-1时, 12 d后NAR由0升至99.2%.TN去除率则由13%降至3%.
(3) 高通量测序显示, MBBR反应器中, ANAMMOX菌主要存在于生物膜中, 优势菌属为Candidatus Kuenenia; AOB则于絮状污泥中占有较高的丰度, 优势菌属为Nitrosomonas; NOB的优势菌属为Nitrospira, 于此两种污泥形态中的丰度无明显差异.
(4) SBR反应器恢复短程硝化后, AOB活性保持稳定的同时其丰度显著下降; NOB虽检测不到活性, 但其相对丰度呈上升趋势.
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