2020, Vol. 41
2. 中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室, 北京 100085;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 环能科技股份有限公司, 北京 100085
, ZHENG Li-bing1,2 , WEI Yuan-song1,2,3
, WANG Zhe-xiao4 , ZHANG He-qing4 , HUANG Guang-hua4 , JIAO Yun-yi1,2 , WU Zhen-jun4
2. Department of Water Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. Huanneng Technology Co., Ltd., Beijing 100085, China
城市污水处理厂是抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)赋存和传播的重要场所之一[1-3], 例如, 污水处理厂每天可向环境排放1016~1018 copies的ARGs[4, 5], 且出水中有一定量的病原菌与ARGs共存.污水厂排水进入环境将造成抗性污染的传播, 抗性基因可通过病原微生物影响人类健康[6].抗性基因一旦传播到人致病菌上将引发恶性、突发性公共健康事件[2].例如, 2011年欧洲暴发的“毒黄瓜”事件短期内造成33人死亡, 3 000多人感染.造成此事件的O104 :H4血清型肠出血性大肠杆菌携带有氨基糖苷类、大环内酯类和磺胺类等多种抗生素的抗性基因, 导致多种抗生素治疗无效.联合国环境署将抗生素抗性问题列为2017年全球环境的新兴问题[6].因此, 寻找有效地抗性基因控制策略和方法正受到人们的广泛关注.
自然环境中抗生素的存在并非是抗性基因发生和传播的唯一选择压力和影响因子.有研究表明, 在从未使用过抗生素的水产养殖环境中也检测出大量ARGs, 同时在鱼体内分离出耐药菌[7].因此, 由可移动遗传元件包含整合子、转座子和质粒等介导的水平基因转移是环境中ARGs传播的主要驱动因子[8].除此之外, 重金属和抗生素对细菌产生抗生素及重金属抗性产生协同、交叉等机制, 加剧了抗性基因污染[6].在重金属污染地区, 细菌不仅对多种抗生素具有抗性, 对重金属也产生抗性, 且ARGs常与铜、汞、铁、镁、锰和锌等抗性基因共同发生[7].因此, 抗生素和重金属耐药基因的共存可能对降低抗性风险提供新的思路.
混凝是传统的污水预处理技术, 可用于污水的一级处理或深度处理.结果表明, 采用不同类型混凝(FeCl3、聚合氯化铁、聚合氯化铝PAC和聚合硫酸铁PFS)处理格栅出水和二级出水, 出水中ARGs绝对含量可降低(0.5~3.1) log[3].混凝处理城市生活污水易受到混凝剂投加量的影响, 当投加量高于200 mg ·L-1时, PAC和PFS对16S rDNA的去除效率反而降低[9].
磁混凝是在传统混凝过程中加入磁粉, 磁粉作为絮体生长的核心, 形成密实度更高的磁絮体, 在外加磁场作用下实现快速固液分离, 并通过磁鼓实现磁种回收与污染物分离[10].磁混凝技术已广泛应用于水处理领域, 例如, 市政污水、工业废水、餐饮废水、养殖废水和城市黑臭水体, 但磁混凝的抗性基因去除效果尚未有研究报道.同时, 在去除过程中, ARGs丰度的降低是否与MRGs丰度的减少存在一定的相关性还不得而知.因此, 为了更好地了解磁混凝对市政污水中抗性基因的处理效果及其潜在的影响因素.本研究以7种抗生素抗性基因(四环素类：tetA、tetM和tetO；磺胺类：sul2; 大环内酯类：ermB、ermF；β-内酰胺类：blaTEM)和4种重金属抗性基因(耐铜基因：pcoA；耐锌基因：czcA；耐砷基因：arsC；耐汞基因：merA2)为研究对象, 对比分析磁混凝对抗生素抗性基因和重金属抗性基因的削减效果, 监测处理过程中3种可移动遗传元件(int1、int2和Tn916/1545e)和16S rDNA的变化趋势, 考察磁混凝过程中微生物含量变化及抗性基因迁移转化特征, 并分析抗性基因绝对含量与常规污染物之间的相关性, 以期为抗性基因污染控制提供支撑.
1 材料与方法 1.1 样品采集水样采自北京市某市政污水应急治理工程, 处理规模为20 000 m3 ·d-1.该工程采用磁混凝工艺, 污水依次通过提升泵、格栅渠、调节池、混凝反应和超磁分离设备, 处理后的出水排放.主要运行参数为：一级搅拌约1.3 min, 二、三级搅拌约1.5 min, 超磁分离停留时间约20 s.稳定运行条件下于2018年9月对该工程进行全流程采样, 如图 1所示, 共采集8个样品分别用1~8代表样品采集点, 包括进水点1个(1), 一级搅拌池、二级搅拌池、三级搅拌池各1个(2~4)、磁种混合池1个(5)、超磁分离池1个(6)、出水点1个(7)以及污泥池1个(8).其中, 一级搅拌池分别加入磁种和聚合氯化铝(PAC), 二级搅拌池加入聚丙烯酰胺(PAM), 三级搅拌池进行混凝处理, 随后进行超磁分离.样品采集后冷藏保存并迅速转移至实验室, 4℃保存水样, 测定总氮(TN)、NH4+-N、COD、总磷(TP)、PO43--P、pH值和浊度.每个样品重复3次, 进水水质如表 1所示.
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1~8表示采样点位置 图 1 磁混凝工艺流程示意及采样点 Fig. 1 Diagram of magnetic coagulation and sampling points |
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表 1 磁混凝工艺进出水水质 Table 1 Water quality of influent and effluent in magnetic coagulation treatment |
1.2 DNA提取及PCR检测
取20 mL水样经过0.45 μm滤膜真空过滤, 将滤膜剪碎, 通过MP bio土壤基因组DNA提取试剂盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA)提取DNA.提取后样品储存于-20℃保存, 待下一步定量PCR检测.
采用PCR(Bio-Rad, C 1000 Touch, USA)筛选目标抗性基因.PCR体系为20 μL：0.5 μL上下游引物, 10 μL 2Taq PCR Master Mix [0.1 U Taq聚合酶, 0.5 mmol ·L-1 dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP), 3 mmol ·L-1MgCl2, 100 mmol ·L-1 KCl, 20 mmol ·L-1 Tris-HCl, pH 8.3], 2 μL DNA模板, 剩余体积用灭菌水补齐.同时, 设置未添加DNA模板的PCR混合体系作为阴性对照和含有氨苄青霉素抗性的质粒作为阳性对照.本实验使用的引物及PCR运行程序参照文献[11].PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶进行检测.
1.3 抗性基因荧光定量PCR检测荧光定量PCR(qPCR)测试均采用ABI荧光定量PCR检测仪(ABI StepOneplus, USA).阳性对照中所使用的目标基因[包含3类抗生素抗性基因(四环素类：tetA、tetM和tetO；磺胺类：sul2; 大环内酯类：ermB, ermF；β-内酰胺类：blaTEM)和4种重金属抗性基因(pcoA、czcA、arsC和merA2)、3种可移动遗传元件(int1、int2和Tn916/1545e)]均从环境样品中获得, 将抗性片段TA克隆连接转化到含有氨苄青霉素抗性的E.coli DH5中(pEASY-T1 Simple Cloning Kit, Transgene, China), 并进行测序检验.将质粒梯度稀释后定量检测各基因并绘制标准曲线, 各基因的相关系数(R2)均大于0.999, 扩增效率在85.4% ~99.5%之间, 说明定量PCR测试结果具有可靠性.qPCR混合体系使用SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒(T LiRnaseH Plus, TAKARA).
磁混凝处理各单元目标基因均进行荧光定量PCR检测, 目标基因相对于进水的去除率取初始基因浓度与相对应单元处理后基因浓度比值的对数, 结果以符号“log”表示, 即通过下式进行计算[10]：
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式中, i代表特定的目标基因；C0i为目标基因i在进水中的基因拷贝数(copies ·mL-1); Cni为目标基因i经过磁混凝处理单元n的基因拷贝数(copies ·mL-1).
1.4 数据处理与分析平均值和标准偏差采用Origin 8.0计算和制图.显著性分析采用SPSS 19.0对不同类型ARGs的绝对拷贝数含量与COD、TP、STP和NTU等常规指标, MRGs和可移动遗传元件绝对含量进行Pearson相关性分析.
2 结果与讨论 2.1 磁混凝过程中抗性基因含量的变化 2.1.1 原水中抗生素抗性基因和重金属抗性基因的分布7种ARGs(blaTEM、ermB、ermF、sul2、tetA、tetM和tetO)在磁混凝处理进水中均有检出, 各ARGs绝对含量分别为7.51×108、4.05×109、2.35×109、7.64×109、1.22×109、1.29×109、9.14×108 copies ·mL-1, 以ermB、ermF和sul2为优势抗生素抗性基因.该调查结果与早期城市污水处理厂ARGs研究结果相一致, 进水中抗生素抗性基因的绝对含量大约在106~108 copies ·mL-1[12, 13], 且磺胺类抗性基因浓度较高[14].
分析结果表明, 进水中4种重金属抗性基因均有检出, 依据绝对含量大小分别为pcoA(2.90×109 copies ·mL-1)>merA2(1.55×109 copies ·mL-1)>czcA(8.75×108 copies ·mL-1)>arsC(7.10×106 copies ·mL-1), 耐铜抗性基因(pcoA)绝对含量最高.这可能是由于铜广泛应用于电子业、农业、养殖业和工业, 甚至被应用于抗菌剂的开发, 是环境中较为普遍的重金属污染来源[15].总体来说, 进水中抗生素抗性基因和重金属抗性基因的绝对含量相近.
2.1.2 磁混凝对抗生素抗性基因丰度的影响如图 2(a)所示, 一级和二级快速搅拌池中ARGs绝对含量均降低, 但一级搅拌池的ARGs去除效果优于二级搅拌池, 其中一级搅拌池中ARGs绝对含量分别降低了0.56、0.82、0.10、0.24、0.25、0.49和0.32 log(分别对应blaTEM、ermB、ermF、sul2、tetA、tetM和tetO).在磁混凝过程中仅加入磁粉时, 溶液中磁粉呈颗粒随机分散, 无明显絮体生成；当同时加入磁粉和PAC时, 出现明显絮体且体积较小；当加入PAM时形成较大的絮团[16].因此, 一级搅拌池中形成了体积较小的絮体且磁分具有较高比表面积, 增加了吸附含有ARGs的抗性菌的活性吸附位点；而PAM属于长链结构的高分子助凝剂, 使胶体携带负电荷, 与ARGs及细菌表面的静电排斥作用增强, 进而削弱了与负电荷表面细菌或微生物的结合能力.磁混凝过程中同一种抗生素的不同抗性基因类型在各处理环节去除效率不同, 如一级和二级搅拌池中ermB去除率比ermF去除率分别高66.9%和75.5%, 这可能是由于ermF广泛存在于大多数细菌体内, 造成ermF较难去除及去除效率较低[12, 13, 17, 18].这一结果也说明环境中微生物多样性可能是影响抗性基因去除效果的主要因素之一[6, 19].监测结果表明, 出水中ARGs绝对含量的变化不同, 仅ermB绝对含量降低了0.52 log, 其余ARGs绝对含量均呈增加趋势, ARGs去除效果低于早期研究报道的PAC和PFS混凝对ARGs的去除效果[9, 20], 这可能是实际处理过程受到更多的环境因素干扰, 如悬浮物、pH、混凝剂投加量、处理规模等, 例如, 本研究中混凝剂投加量(~20 mg ·L-1 PAC和~0.2 mg ·L-1 PAM)显著低于早期研究报道的投加量(400 mg ·L-1)[9].
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图 2 各处理单元ARGs和MRGs绝对含量及相对丰度 Fig. 2 Absolute and relative abundance of antibiotic and heavy metal resistance genes in each unit |
磁絮凝混合体(5)和回收磁种(6)中ARGs绝对含量的分析结果表明, 磁种表面及磁絮凝混合体中ARGs绝对含量在109~1010 copies ·mL-1之间, 高于出水中ARGs绝对含量, 这说明磁种可通过较高的吸附性能从环境中吸附抗性菌及ARGs.磁混凝各单元处理过程中pH维持在7.0~8.0之间(表 1), 远高于抗性菌零点电位(pH 2.0~5.0)和胞外游离ARGs零点电位(pH 2.0~5.0)[21], 因此磁混凝过程中耐药菌和胞外游离ARGs保持负电性.磁混凝的磁种主要成分为Fe3O4, 其零点电位为pH 8.0~9.0, 在处理过程中表现为正电性的磁性胶体或无定形铁氢氧化物为主的活性物质.因此, 磁种与ARGs之间的双电层压缩(EDL)和电中和作用可能是磁混凝处理过程主要的ARGs去除机制.
从ARGs相对丰度来看, 出水中ARGs相对丰度与其绝对含量变化趋势相同[图 2(b)], 仅ermB相对丰度显著下降(P < 0.05), 下降了约78.9%, 其余ARGs平均相对丰度呈现增加趋势, 相对丰度为4.01×10-3~2.83×10-2.ermB、ermF、sul2、tetA和tetM在一级和二级搅拌池中的相对丰度均显著降低(P < 0.05), 分别在2.54×10-3~4.18×10-2和3.32×10-3~4.20×10-2, 这说明磁混凝削减了污水中16S rDNA绝对含量或微生物数量, 进而降低了ARGs绝对含量.可移动遗传元件分析结果表明(图 3), 一级搅拌池和二级搅拌池中int1、int2和Tn916/1545e的绝对含量均显著减少, 分别降低了0.27、0.78、0.97 log和0.20、0.78、0.83 log, 这说明磁混凝降低了可移动遗传元件浓度, 进而可能对降低ARGs绝对含量产生影响.但在三级搅拌池和出水中int1绝对含量显著增多, 升高到9.98×109 copies ·mL-1和2.00×1010 copies ·mL-1, 这可能是三级搅拌池中, 磁种及磁絮体经过连续搅拌后, 污染物占据了磁种表面活性位点及超磁分离过程导致了利于ARGs迁移转化的可移动遗传元件以较高含量存在.因此, 出水中仍有较多种类ARGs检出以及ARGs绝对含量升高.
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图 3 各处理单元中可移动遗传元件绝对含量 Fig. 3 Absolute abundance of mobile genetic elements in each unit |
经过一级搅拌池和二级搅拌池处理后, pcoA、merA2、czcA和arsC绝对含量分别降低了1.09、0.68、0.46、1.07 log和1.27、072、0.43、1.10 log[图 2(c)].不同于ARGs, 经过三级搅拌池处理, 4种重金属抗性基因绝对含量均降低, 去除率在0.10~1.27 log之间, 其中arsC和pcoA的去除效果明显高于merA2和czcA.郑春丽[22]的研究发现, 重金属抗性基因不仅受到微生物群落的影响, 还与环境中的SO42-、金属离子等存在耦合作用机制.在适宜的pH值条件下, 与磁种结合的Al、Fe和Ca等沉淀物受到静电吸引作用更易被絮凝去除[10].出水中arsC和pcoA绝对含量下降, 分别为7.11×106 copies ·mL-1和2.90×109 copies ·mL-1, 而merA2和czcA浓度分别升高55.75%和13.77%, 这可能是由于arsC和pcoA这两种基因广泛位于高效的可移动遗传元件上而较难去除[23].重金属抗性基因相对丰度在各处理池间的变化趋势与绝对含量趋势相同, 仅有merA2相对丰度持续降低[图 2(d)].综上所述, 磁混凝对arsC和pcoA的去除效果较为显著, 而对merA2和czcA基因可能仍然存在累积风险.
2.2 脱水污泥中抗性基因丰度的变化脱水污泥样品中目标抗生素抗性基因、重金属抗性基因类型及可移动遗传元件均有检出, 不同抗性基因在污泥中的绝对含量如图 4所示.磺胺类抗性基因绝对含量最高(9.00×109 copies ·g-1, 以干土计, 下同), 其次依次为四环素类(2.01×108~3.11×109 copies ·g-1)、大环内酯类(1.26×108~2.27×108copies ·g-1)和β-内酰胺类抗性基因(9.65×107copies ·g-1).这可能是由于污水处理厂中接受大量来自医院或家庭的污水, 其中包含了大量的抗生素来源[24], 而四环素和大环内酯是人类肠道中发现的主要抗生素成分组成[25].
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图 4 脱水污泥中各种抗性基因及可移动遗传元件类型及绝对含量分布 Fig. 4 Absolute abundance of antibiotic resistance genes, heavy metals resistance genes, and mobile genetic elements in sludge |
脱水污泥中pcoA含量最高(3.84×109 copies ·g-1), arsC含量最低(仅有6.03×106 copies ·g-1), 这说明污泥中含有更多的pcoA宿主菌, 且其对环境的耐受能力比arsC宿主菌更强[26]. 3种可移动遗传元件(int1、int2和Tn916/1545e)在污泥中均有检出, 其绝对含量依次分别为2.03×109、1.45×109和8.84×108copies ·g-1.整合子可从环境中捕捉ARGs, 然后通过位点特异重组将ARGs整合到自身的基因盒中从而进行基因水平转移.int1是各种环境中检测频率最高的整合子[26].Ma等[27]认为int1与ARGs丰度具有高相关性(r=0.852), int1可作为环境中ARGs去除和削减的一个重要指标.因此, 遗传元件的相关分析结果表明, ARGs、MRGs以及相关的细菌类群在处理过程存在增殖潜力[28, 29].
2.3 ARGs与MRGs、MGTs及常规污染物相关性分析Luo等[30]的研究表明, 有机物、氮和磷等常规污染物影响微生物群落组成进而影响ARGs的削减效率.Wang等[21]的研究发现, 混凝处理城市污水过程中DOC的去除效率与ARGs及Ⅰ类整合子的去除效率显著相关(R2=0.723, P < 0.01).因此, 城市污水中常规污染物浓度可能对ARGs去除具有重要指示作用.网络分析结果发现, 不同ARGs、MRGs与水平转移元件之间显著相关(P < 0.05).如图 5所示, 可将网络分析结果分为3组：①组包含ermB、arsC和pcoA.磁混凝过程中3种抗性基因削减效率高于其他抗性基因, 出水中绝对含量显著降低. 3种抗性基因与二类整合子(int2)和转座子(Tn916/1545e)呈显著正相关(P < 0.05)；②组包含tetO、tetA、ermF、blaTEM和czcA.其在一级搅拌池中削减效率较低且出水中检测浓度较高, 这可能是由于这几种抗性基因与int1显著相关(P < 0.05), 更易于在环境中迁移转化发生快速传播[12]；③组包含sul2和merA2.磺胺类抗生素抗性基因常与铜、汞、铁、镁、锰和锌等抗性基因共同发生, 其中, sul2常与砷、汞和金等抗性基因共生[28].同时, 网络分析结果还表明城市污水中常规污染物去除效率与抗性基因去除效率显著相关(P < 0.05).上述①组中抗性基因与不同形态的磷(总磷TP、溶解性磷酸盐PO43--P、溶解性总磷STP)和TCOD显著相关.有研究表明, 磁混凝的絮体结构密实, Zeta电位更趋近于零, 停留时间短、除磷效果较明显[10].磁混凝过程中磁种通过静电吸引作用与含磷物质结合形成沉淀达到除磷的目的.因此, 磁混凝可通过磁种表面直接吸附抗性基因, 或磁混凝除磷过程中间接去除抗性基因.含铁类絮凝剂可通过铁单质体表面的双电层压缩和电性中和作用去除ARGs, 同时还以聚合铁形式吸附、电性中和以及网捕作用去除ARGs, 可能是铁基絮凝剂去除ARGs过程中的主要去除机制[21].上述②组中抗性基因与浊度和SCOD显著相关(P < 0.05).早期研究报道, 加入磁粉可提高混凝处理煤制油废水效果, COD和浊度的去除率分别可达56.9%和99.7%[10].因此, ARGs去除可能与磁混凝去除污水中悬浮颗粒及胶体有关, 其作用机制还需进一步研究.一方面, 氮、磷等常规污染物是微生物生长繁殖的必需营养元素, 其浓度变化可影响微生物生长, 进而影响抗性基因的种类及丰度；另一方面, ARGs可能吸附于污水悬浮物中, 进而在磁混凝处理过程中与COD、TP和NTU协同去除.
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ARGs代表字母：A表示tetO; B表示tetM; C表示tetA; D表示sul2; E表示ermB; F表示ermF; G表示blaTEM; MRGs代表字母：H表示arsC; I表示merA2; J表示czcA; K表示pcoA; MGTs代表字母：L表示int1; M表示int2; N表示 Tn916/1545e; 常规污染物指标代表字母：R表示P; S表示PO43--P; T表示STP; U表示TCOD; V表示SCOD; W表示NTU 图 5 抗性基因与常规污染物去除效率相关性网络分析 Fig. 5 Correlation between reduction of resistance genes and common pollutants by network analysis |
PCA提取的主成分反映了城市污水中常规污染物去除综合效应对抗性基因消减效果的影响.在P < 0.05显著性水平下, 经过KMO和巴特利特球形检验进行主成分分析, 提取了2个主成分, 如图 6所示(其中分别将2个主成分用黑色虚线标出), 其方差解释特征值分别为3.840和1.028.其中, 第一主成分主要反映了NTU、SCOD、TP、STP和PO43--P的影响, 其累积方差贡献率为76.80%；第二主成分主要为TCOD和int1对抗性基因去除的主要影响, 累积方差贡献率为20.55%.各处理单元的常规污染物浓度载荷分布特征表明, 磁混凝过程中常规污染物如悬浮物、磷和COD等是影响抗性基因去除效率的重要因子.除此之外, 三级搅拌及超磁分离过程中较高的可转移遗传元件浓度可能是导致出水中依然含有较高水平ARGs的重要影响因子.因此应当关注出水可能造成的受纳水体的抗性污染, 例如在出水前增加相应地消毒措施.
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图 6 磁混凝过程中ARGs、MRGs、MGTs及常规污染物指标的主成分分析 Fig. 6 PCA analysis for cluster distribution of ARGs, MRGs, MGTs, and other water quality parameters during magnetic coagulation |
(1) 进水中目标7种ARGs、4种MRGs和3种可移动遗传元件均被检出, 其中磺胺类抗性基因(sul2)、大环内酯类抗性基因(ermB、ermF)和金属铜抗性基因(pcoA)为主要的优势抗性基因, int1为主要的水平转移元件.一级搅拌和二级搅拌池中, 目标抗性基因绝对含量均降低, 去除率分别在0.32~1.08 log和0.24~1.27 log范围之内.除ermB、proA和arsC抗性基因绝对含量降低之外, 出水中其余抗性基因绝对含量呈增加趋势.
(2) 脱水污泥中有106~109 copies ·g-1的抗性基因检出.因此, 若未对剩余污泥进行妥善处理, 从污水中转移到污泥中的ARGs以及在污泥中大量的可移动遗传元件的检出, 使其依然可能具有较高的环境风险性.因此, 应当对污泥进行完善的后续处理, 如焚烧或厌氧消化等.
(3) 磁混凝过程中抗性基因的去除效果不仅受到微生物群落的影响, 而且污水中悬浮物、磷及COD显著影响抗性基因的去除效率.处理过程中int1绝对含量的增加可能将会导致磁混凝出水中抗性基因绝对含量的提高而增加受纳水体抗性污染风险.
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