2020, Vol. 41
2. 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 北京 100097;
3. 北京正大蛋业有限公司, 北京 101206
, SUN Xing-bin1
, XIN Wen-peng3 , GAO Hao-ze2 , CHENG Shou-tao2 , GAO Min2 , WANG Xu-ming2
2. Beijing Agricultural Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China;
3. Beijing CP Egg Industry Co., Ltd., Beijing 101206, China
目前, 集约化养殖方式被广泛应用于动物养殖业.然而, 集约化养殖过程可产生高浓度的气体污染物, 如氨、硫化物[1]以及微生物等.空气中的微生物通常以颗粒物为载体, 其中含有多种微生物, 甚至包括链球菌、肠球菌和大肠杆菌等人类条件致病菌[2].在养殖动物和工人的活动、场内设备的运转、风化和腐蚀等作用下, 动物粪便, 垫料以及饲料中的微生物很容易经气溶胶化过程逸散至空气中.动物粪便被认为是养殖场空气环境中微生物的主要来源[3].
中国是世界上最大的抗生素生产国和消费国, 2013年中国抗生素消费量高达92 700 t[4], 其中约48%用于畜牧业、农业和水产养殖[5].目前, 用于治疗疾病的抗生素在动物养殖场已经得到了严格监控.而非治疗性用途的抗生素, 如促进动物生长和提高饲料转化率, 则没有得到有效监管[6].过量抗生素因无法被动物吸收而通过粪便排入到环境中[7, 8], 导致耐药菌和多重耐药细菌的产生[9].最终, 这些耐药菌中的抗生素抗性基因可能通过水平转移传播给环境中的其他微生物[10].
空气为养殖场和环境之间污染物的传播提供了有效途径[9, 11].导致养殖场空气中的抗生素耐药菌不仅危害动物和工人健康, 还会对周边空气环境造成生态风险[12].已有研究结果表明, 养殖场空气中含有浓度较高的抗生素耐药菌, 其中不乏抗生素耐药性的人类条件致病菌.例如, 北京周边肉鸡和生猪舍内空气中的红霉素和四环素耐药菌分别高达103和104 CFU·m-3[13]. 98%的养猪场舍内空气中的Staphylococcus和Streptococcus对2种以上的抗生素具有抗药性[14].其中, Staphylococcus aureus作为一种常见人畜共患条件致病性菌, 空气中该菌被检测出具有广泛的多重耐药性. 67%的猪场空气以及养殖工人鼻腔内都检出了Staphylococcus aureus[15, 16].利用抗生素选择性培养法和高通量测序技术, 研究人员掌握了鸡粪和猪粪中主要抗生素耐药菌的组成[17], 但目前并没有关于养殖空气中的抗生素耐药菌组成的研究报道, 其与动物粪便中抗生素耐药菌的关系也有待说明.
针对以上情况, 本研究对生猪、肉牛、蛋鸡和肉鸡这4种动物养殖场的颗粒物和粪便样品进行采集, 利用选择性培养基对其中的红霉素和四环素耐药菌进行筛选和富集.在此基础上系统分析了动物种类, 抗生素选择性, 粒径分布对抗生素耐药菌优势菌群以及生物多样性的影响, 以期为评估动物养殖场空气的生物质污染现状, 解析其主要来源提供研究基础.
1 材料与方法 1.1 采样地点本研究的采样时间为2017年8~10月, 地点为北京市平谷、密云和怀柔这3个区的16家养殖场, 具体包括4个猪场(存栏量：50~400头)、4个牛场(存栏量：30~400头)、4个蛋鸡场(存栏量：4000~10000只)和4个肉鸡场(存栏量：4 500~18 000只).其中, 每个养殖场采样1次, 3个生物学重复.共采集包括动物粪便, 舍内气溶胶和舍外气溶胶在内的192个样品.采用WD-35612温湿计(OAKTON, Germany)对采样时的空气温度和相对湿度进行测量, 数值范围分别为21~31℃和41%~61%.
1.2 样品收集与细菌培养采用六级撞击式采样器(辽阳, 中国)采集空气中生物粒子, 采集高度距地面1.5m.该采样器可采集6个粒径范围的生物粒子, 分别为Ⅰ级：>7.0 μm, Ⅱ级：4.7~7.0 μm, Ⅲ级：3.3~4.7 μm, Ⅳ级：2.1~3.3 μm, Ⅴ级：1.1~2.1 μm, Ⅵ级：0.65~1.1 μm.根据以往文献报道, Ⅰ~Ⅲ级收集的粒子被定义为粗颗粒, Ⅳ~Ⅵ级收集的粒子被定义为细颗粒[18].经前期优化, 总细菌和抗生素耐药菌的采样时间分别为1 min和2 min, 空气采集流量为28.3 L·min-1.每次采样前利用流量计对采样泵流量进行校准(余姚, 浙江).每个采样点采集全细菌, 四环素耐药和红霉素耐药菌这3种空气微生物, 每种微生物设置3次重复.分别使用无抗生素的LB营养琼脂培养基, 以及含有一定浓度红霉素和四环素的选择性LB营养琼脂培养基.其中, 四环素和红霉素在LB营养琼脂中的终浓度分别为16 μg·mL-1和48 μg·mL-1[19].气体样品采集完成后, 立即将培养皿密封送至实验室培养, 培养条件为28℃, 48 h.粪便样品采集依照5点法, 完成后将样品放入冰盒中迅速送至实验室.
1.3 DNA提取与PCR扩增将每个采样点的3个重复中的菌落刮下后转移至含有1.5 mL缓冲液的无菌离心管中, 振荡混匀后利用试剂盒提取DNA(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA), 并对DNA浓度进行检测(QuantiFluorTM-ST, Promega, USA).利用PCR对细菌16S rRNA的V3-V4区扩增, 引物为338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).反应条件为：98℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s(27个循环), 72℃延伸10 min.PCR产物用2%的琼脂糖进行电泳检测.
1.4 Illumina MiSeq测序与数据处理根据已有报道对Illumina MiSeq测序数据进行处理[2].序列结果上传至NCBI数据库中, 登录号为SRP 079945.OTU分析具体步骤如下：①对优化序列提取非重复序列, 便于降低分析中间过程冗余计算量(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)；②去除没有重复的单序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)；③按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类, 在聚类过程中去除嵌合体, 得到OTU的代表序列；④将所有优化序列map至OTU代表序列, 选出与代表序列相似性在97%以上的序列, 生成OTU表格.本研究中箱型图和柱形图在Origin(8.5)中生成.LEfSe(linear discriminant analysis effect size)和热图在I-Sanger(http://www.i-sanger.com/tool/index.html)中分析和构建.Procrustes analysis(基于Bray-Curtis算法)和ANOVA分析通过vegan v.2.3-0完成.P值< 0.05被认为在统计学上具有显着性.
2 结果与讨论 2.1 养殖场空气和粪便中抗生素耐药菌的生物多样性研究首先对所采集样品细菌群落的生物多样性指数(Shannon指数)进行分析, 结果如图 1所示.为了分别考察抗生素耐药性, 空气颗粒物粒径以及动物种类对生物多样性指数的影响, 对数据进行分组分析, 相应的Shannon数值和差异显著性分析结果分别如图 1所示.
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(a) LB表示总细菌；E表示红霉素耐药菌；T表示四环素耐药菌；(b) I表示舍内空气；O表示舍外空气；M表示粪便；(c) M表示粪便；C表示粗颗粒物；F表示细颗粒物；(d) L表示蛋鸡；B表示肉鸡；S表示猪；C表示牛；P < 0.05表示差异显著 图 1 不同种类样品之间生物多样性指数(Shannon指数)对比分析 Fig. 1 Difference of Shannon indices among different samples |
空气颗粒物负载总细菌, 红霉素和四环素耐药菌的生物多样性差异结果如图 1(a)所示.整体上总细菌的生物多样性显著高于红霉素耐药菌和四环素耐药细菌(P=0.000 1, ANOVA), 这是由于全部细菌中只有部分微生物对抗生素有耐药性. 2种耐药菌的对比分析结果显示, 红霉素耐药菌群的Shannon指数显著高于四环素耐药菌群(P=0.01).目前关于空气中抗生素耐药菌生物多样性的相关研究尚未见相关报道.Yang等[17]对我国鸡场和猪场粪便样品中抗生素耐药菌展开研究, 发现红霉素耐药菌的检出率最高(96.97%, 32/33), 且高于四环素耐药菌的检出率(78.79%, 26/33), 该研究结果与本文一致, 综合分析可知动物养殖环境中粪便和空气中红霉素耐药菌群的生物多样性普遍较为丰富.
对粪便, 舍内空气和舍外空气样品中Shannon指数进行对比分析[图 1(b)], 结果显示舍内和舍外空气中生物气溶胶的Shannon指数分别为2.61±0.67和2.52±0.72, 二者数值接近且无统计学差异(P>0.05).其中, 舍内空气样品的Shannon指数显著高于粪便样品(P=0.012, 2.27±0.95), 说明舍内空气微生物的多样性较粪便样品更为丰富.虽然动物粪便一直被认为是空气中微生物的主要来源[3, 17], 本研究关于生物多样性的结果显示舍内空气中抗生素耐药菌除了动物粪便以外, 可能还存在其他来源.
鉴于细颗粒物和粗颗粒物沉降在人体肺部的位置不同[20], 本研究对舍内空气中两种不同粒径颗粒物负载细菌的生物多样性进行对比分析.结果显示, 2种粒径空气样品的多样性指数均高于粪便样品(P=0.025, P=0.033), 但细颗粒和粗颗粒的Shannon指数之间并没有统计学上的差异[图 1(c)].同时, 本研究也没有检测出动物种类对空气和粪便样品(细菌以及2种抗生素耐药菌总和)的显著影响, 这与以往关于粪便中抗生素耐药菌的研究结果相似[17].
2.2 养殖场空气和粪便中抗生素耐药菌的群落结构研究基于生物多样性的研究结果, 本研究利用Procrustes进一步对比分析了不同抗生素耐药菌, 空气和粪便样品, 以及不同粒径颗粒物负载细菌群落结构在门水平和属水平上差异, 结果分别如图 2和图 3所示.
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(a) LB：总细菌, E：红霉素耐药菌, T：四环素耐药菌之间的显著相关性；(b) I：舍内气体, O：室外气体, M：粪便样品之间的显著相关性；(c) FLB：细颗粒物样品中的总细菌, CLB：粗颗粒物样品中的总细菌, FT：细颗粒物样品中的四环素耐药菌, CT：粗颗粒物样品中的四环素耐药菌, FE：细颗粒物样品中的红霉素耐药菌, CE：粗颗粒物样品中的红霉素耐药菌之间的显著相关性；其中, 表格显示Procrustes分析计算结果：N表示计算的排列组合数；m2、r和P均表示计算结果的统计学显着性程度, 下同 图 2 细菌群落在门水平上的差异分析 Fig. 2 Procrustes analysis of bacterial composition at phylum level |
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图 3 细菌群落在属水平上的差异分析 Fig. 3 Procrustes analysis of correlations in genera based on Bray-Curtis dissimilarity metrics |
由图 2结果可知总细菌与红霉素耐药菌(r=0.576, P=1e-04), 总细菌与四环素耐药菌(r=0.636, P=1e-04)以及红霉素耐药菌与四环素耐药菌(r=0.638, P=1e-04)的群落结构在细菌门水平上均显著相关.结果显示具有抗生素耐药性的细菌群落结构与总细菌的群落结构在门水平上无显著差异.分析原因, 主要是抗生素耐药菌在总细菌中所占比率较高[13, 17], 且养殖环境中抗生素耐药菌通常对多种抗生素同时具有耐药性, 即红霉素耐药菌很可能对四环素也具有耐药性.以往研究对空气中分离的Staphylococcus和Streptococcus抗生素耐药性进行分析, 结果表明养猪场舍内空气中高达98%的以上菌属对至少2种抗生素具有耐药性[14].同时, 前人对动物粪便的研究结果也显示, 18.18%抗生素耐药菌对11种抗生素耐药, 高达93.94%的耐药菌对至少5种抗生素同时具有耐药性[17].
对粪便和舍内外样品的相关性研究结果见图 2(b), 粪便中细菌群落结构(包括总细菌, 四环素和红霉素耐药菌)与舍内空气中细菌群落结构呈显著相关(r=0.682, P=1e-04), 粪便与舍外空气中细菌群落的相关性并无统计学意义(r=0.226, P=0.08).值得注意的是, 本研究在舍内外空气细菌的群落结构之间检测到了显著相关性(r=0.339, P=0.0232).综合分析, 本研究结果说明舍内空气中抗生素耐药菌部分来自于动物粪便[3, 21], 且舍内的颗粒物负载的生物(包括抗生素耐药菌)可以逸散到舍外, 污染周边空气环境.
为深入考察细颗粒物和粗颗粒物群落结构之间的差异, 本研究分别对细颗粒物和粗颗粒物负载的总细菌, 四环素以及红霉素耐药菌的群落结构之间的相关性进行分析.由图 2(c)可知, 细颗粒和粗颗粒负载的总细菌(r=0.757, P=5e-04)、红霉素耐药菌(r=0.419, P=0.0279)和四环素耐药菌(r=0.747, P=5e-04)群落结构之间均具有显著相关性.这说明虽然细颗粒物和粗颗粒物可以沉降在人体肺部的不同位置, 但2种粒径颗粒物携带的细菌和抗生素耐药菌的群落结构在门水平上均无显著差异.
样品间生物群落结构在菌属水平上的差异分析结果如图 3所示.与门水平Procrustes分析的结果相似, 本研究也没有检测到总细菌与红霉素耐药菌(r=0.667, P=1e-04), 总细菌和四环素耐药菌(r=0.754, P=1e-04)以及红霉素耐药菌和四环素耐药菌(r=0.731, P=1e-04)的生物群落结构在属水平上的显著差异.尽管动物养殖场空气中红霉素耐药菌的浓度[13]和生物多样性[图 3(a)]均高于四环素耐药菌, 但是2种抗生素耐药菌的群落结构在属水平[图 3(a)]和门水平上[图 2(a)]均无显著差异.这与以往对粪便中筛选的抗生素耐药菌群落结构分析结果一致[17].同时, 细颗粒和粗颗粒负载微生物(总细菌, 红霉素和四环素耐药菌)的群落结构在属水平上也无统计学差异[图 3(c)].以往对于不同粒径负载抗生素抗性基因和细菌的群落结构研究也有类似发现[2], 这说明养殖场空气中颗粒物粒径对抗生素耐药菌的群落结构和生物多样性影响并不显著.
图 3(b)显示了粪便样品, 舍内和舍外气体样品群落结构之间的差异关系.本研究在粪便和舍内空气样品的群落结构之间检测到了显著差异(r=0.244, P=0.163).综合生物多样性(图 1)及门水平群落结构(图 2)分析结果可知, 舍内空气和粪便中微生物在门水平上结构相似, 但在属水平上存在差异.这可能由于粪便中微生物在气溶胶化过程, 选择性地逸散至空气中.同时, 除动物粪便外, 养殖场舍内空气中生物可能还有其他来源.同样, 本研究也在舍内外空气细菌群落结构之间检测到了显著相关性(r=0.547, P=0.015), 这与蛋鸡和肉鸡舍内外空气样品中抗生素抗性基因的相关性分析结果一致[22].并进一步说明舍内的空气中抗生素耐药菌气溶胶是环境空气中抗生素耐药菌的重要来源.根据图 3(c)可知细颗粒物和粗颗粒物负载的全部细菌以及2种抗生素耐药菌群落结构在属水平上无统计学差异(r=0.761, P=1e-04；r=0.635, P=6e-04；r=0.685, P=1e-04).
2.3 动物养殖场粪便和空气中抗生素耐药菌的优势菌群本研究对动物养殖场中粪便和空气样品中总细菌、红霉素耐药菌和四环素耐药菌的微生物组成展开研究, 对比分析样品间优势门和属的相对丰度差异, 以期得到导致样品间生物多样性和群落结构差异性的关键微生物, 结果分别如图 4和5所示.
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S：猪, C：牛, L：蛋鸡, B：肉鸡 图 4 动物养殖场粪便和空气中总细菌、四环素耐药菌和红霉素耐药菌门水平物种相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of phyla in total, erythromycin-, and tetracycline-resistant bacteria in fecal and aerosol samples, as assessed by high-throughput sequencing of 16S rRNA genes |
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每张图的前4列是粪便样品, 名称的缩写由3个字母组成, 分别代表动物类型、样品类型和抗生素耐药类型, 第1个字母S、C、L和B分别代表猪、牛、蛋鸡和肉鸡, 第2个字母M和B分别代表粪便和气体, 第3个字母表示B、T和E分别代表总菌、四环素和红霉素；每张图其余12列为气体样品, 第2个字母F和C分别代表细颗粒和粗颗粒物, 第4个字母I和O分别代表舍内和舍外样品 图 5 动物养殖场粪便和空气样品中前50个优势细菌种属的相对丰度分布 Fig. 5 Relative abundance of top 50 bacteria in aerosols and manures from four types of animal farms |
不同种类动物养殖场中粪便和空气样品的优势菌群(门水平)分析结果如图 4所示, 从中可知粪便样品和舍内气体样品中优势细菌组成在门水平上存在差异.整体上, 粪便样品主要由Proteobacteria(40.73%±5.98%)、Bacteroidetes(40.08%±17.23%)和Firmicutes(16.69%±10.54%)组成, 而颗粒物负载生物样品主要由Firmicutes(39.46%±11.49%), Proteobacteria(32.98%±11.71%), Actinobacteria(16.53%±10.37%)和Bacteroidetes(10.71%±4.98%)组成.结合前部分群落结构分析结果可以发现, 虽然粪便和空气样品在门水平上的优势菌群有所不同, 但该差异并没有影响二者群落结构.以往研究利用分子生物学方法对家禽养殖场[2, 23]和猪场[12, 24]空气中微生物进行分析, 也得到了类似结果, 即Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria为优势菌门.本研究对动物粪便和养殖场空气中细菌优势菌门的相对丰度进行对比分析, 结果显示气体中检测到的Actinobacteria(P=0.023)和Firmicutes (P=0.017)的相对丰度高于粪便样品.分析原因可能是粪便中微生物的气溶胶化过程具有选择性, 而且某些菌株因其可形成孢子而在空气中存活较长时间[25].同时本研究发现空气中Bacteroidetes相对丰度低于粪便样品(P=0.001), 以往对蛋鸡和肉鸡养殖场的气溶胶的研究也发现类似情况, 其中的相对丰度分别为14.9%和4.2%[12].
利用LEfSe(linear discriminant analysis effect size), 本研究分析了驱动样品群落结构间差异的关键门.线性判别分数(linear discriminant scores)分析结果显示, Actinobacteria是决定红霉素耐药菌和其他群落差异的一个关键门.这可能是由于该菌门中包含多种具有多重耐药性或能够自身产生抗生素抗性的细菌菌属[26].Deinococcus-Thermus菌门是舍内外空气样品区别于舍内和粪便样品的关键门类.在分析粗颗粒物和细颗粒物样品群落结构的门水平差异时, Firmicutes和Actinobacteria是两个关键的菌门.
本研究通过热图对前50个优势菌属的相对丰度进行分析(图 5), 整体上抗生素耐药菌和全部细菌的优势菌属种类和相对丰度没有明显差别, 2种抗生素耐药菌之间也无显著不同, 而粪便和空气样品的优势菌属之间存在明显差异.其中, 粪便样品中以Myroides (0.32%±0.32%)、Escherichia-Shigella (0.14%±0.26%)、Kurthia (0.08%±0.17%)、Acinetobacter(0.05%±0.14%)和Alcaligenes(0.04%±0.08%)为优势菌属, 而空气颗粒物负载生物中以Staphylococcus(0.19%±0.22%)、Acinetobacter(0.13%±0.15%)、Sphingobacterium(0.08%±0.12%)、Corynebacterium(0.07%±0.09%)和Bacillus(0.06%±0.13%)为优势菌属.以往研究在养鸡场空气中同样检测到以上优势属[27], 这说明不同动物空气中的优势菌属存在相似性.
利用LEfSe对驱动不同样品群落结构差异的关键菌属进行分析, 结果显示粪便样品中Myroides (P < 0.001)、Escherichia-Shigella (P < 0.001)和Kurthia (P < 0.001)丰度较高, 其中Myroides和Escherichia-Shigella也是鸡粪和猪粪中可培养耐药菌中的优势菌属[17].Staphylococcus (P < 0.001)、Acinetobacter (P < 0.001)、Bacillus (P=0.002)和Rothia(P < 0.001)是导致空气样品与粪便样品之间差异的4个关键菌属, 他们在空气中的相对丰度显著高于粪便.值得注意的是, Staphylococcus可以通过养殖场工人鼻黏膜携带而传播, 具有很高的环境健康风险[16], 因此舍内空气中该菌属的检出需引起关注.舍外气溶胶中Brevundimonas (P < 0.05)、Planococcus (P=0.01)和Arthrobacter (P < 0.05)的相对丰度高于舍内.细颗粒物和粗颗粒物负载微生物的LEfSe结果显示, Staphylococcus是养殖场空气中粗颗粒物负载微生物的关键菌属.作为一种与人类致病菌相关的菌属, Sphingobacterium被鉴定为细颗粒负载微生物的关键属.
同时本研究还发现Staphylococcus也是四环素耐药菌区别于红霉素耐药菌和全部细菌的关键菌属.该发现证实了已有研究结果, 鸡场[20]和猪场[12]空气环境中Staphylococcus的相对丰度最高, 其中对甲氧西林具有耐药性的丰度高达41.99%[28].同时, 图 5结果显示在抗生素耐药菌中也存在其他多种与人类条件致病菌相关的菌属, 如Acinetobacter、Sphingobacterium、Corynebacterium、Bacillus、Escherichia-Shigella和 Enterococcus.综合本研究结果, 发现所调查4种动物养殖场空气中抗生素耐药菌污染严重, 并且富含大量具有抗生素耐药菌性的人类条件致病菌.
3 结论本研究对4种动物养殖场空气颗粒物和粪便中抗生素耐药细菌进行选择性培养, 对其生物多样性, 群落结构以及优势菌群的差异进行对比分析.结果表明, 红霉素耐药菌的生物多样性要高于四环素耐药菌, 但二者群落结构无显著差异.粗颗粒物和细颗粒负载抗生素耐药菌的生物多样性和群落结构均无显著差异.粪便和空气中抗生素耐药菌的优势菌群存在差异.本研究结果表明所调查4种动物养殖场的空气环境均受到抗生素耐药菌包括抗生素耐药的人类病原体的污染.不同类型样品生物特性之间的关系分析结果, 有助于人们全面理解畜禽养殖场空气中抗生素耐药菌细菌的来源.
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