2019, Vol. 40
全球土壤碳库约2.2×103~3×103 Pg[1], 是陆地生态系统最主要的碳汇, 其封存的碳比陆地植被碳库和大气碳库高3和4倍[2~5].土壤碳库在陆地碳循环中占据重要地位, 其细微变化会导致大气CO2浓度的改变, 造成全球碳平衡的变化, 从而影响全球气候变化[6].自养土壤细菌具有同化CO2的能力, 能够将大气CO2转化为其自身组分, 在土壤碳固定中发挥重要的作用[7, 8].
卡尔文(Calvin)循环是自养土壤细菌同化CO2的主要途径之一, 其固碳效率最高, 此循环的第一步和限速步骤由核酮糖- 1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose- 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RubisCO)催化完成[9].目前共发现4种类型的RubisCO(Form Ⅰ-Ⅳ)[9].与其它类型相比, Form Ⅰ型RubisCO的丰度最高, 且广泛存在于化能自养细菌及光能自养细菌中[9~11], 在多种土壤环境中占优势[12]. Form Ⅰ型RubisCO的大亚基由cbbL基因编码, 其作为生物标志物已广泛用于土壤环境中自养细菌的生态特征研究[13~16].基于cbbL基因的分子生物学研究及其与土壤环境因子的耦合分析表明土壤有机质、pH、氮和磷等是影响自养细菌活性和群落组成的主要因素[14, 17~21].同时, 土壤自养细菌对种植模式、灌溉、土地利用和耕作等环境变化和人类活动非常敏感[7, 20, 22, 23].
土地利用方式转变是人类活动的主要方式, 可以引起陆地生态系统中元素生物地球化学循环过程的变化[24].然而土地利用方式转变对主导土壤碳循环的自养细菌的影响却鲜有报道.本课题组前期研究发现, 东北丘陵区林地转型耕地后, 土壤化学性质、微生物生物量碳以及细菌和真菌的碳源代谢活性和特征均发生了显著变化[25, 26].因此, 笔者推测对环境变化敏感的土壤自养细菌同样会因土地利用方式的转变而发生变化.为了证明这种可能性, 本研究采用qPCR和高通量测序技术分析了东北丘陵区林地转型耕地后白浆土cbbL细菌群落丰度和结构组成的变化, 并耦合化学性质分析明确了影响cbbL细菌群落组成的关键因子, 探索了土壤cbbL细菌群落对土地利用方式转变的响应, 以期为东北丘陵地区土壤可持续利用及生态环境重建提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 试验地概况和土壤样品采集试验地位于吉林省四平市伊通满族自治县的北京大北农生物技术有限公司试验示范基地和西苇林场(125°20′ N, 43°15′ E), 为典型丘陵区, 土壤类型为白浆土, 是东北地区重要的土壤资源[27].该地区为中温带湿润季风气候, 年均降雨量和气温分别为627.8 mm和4.6℃.试验包括2个处理[林地(F)和耕地(A)]：分别在林地和耕地中设置15 m×15 m的样方和10 m×15 m的小区, 各3次重复.林地的典型林分为红松(Pinuskoraiensis), 林龄50年以上；耕地为农用坡耕地, 紧邻林地, 25年前出于农业生产需要由林地转型而来, 耕作制度采取玉米连作, 仅施用化肥, 近5年化肥(N :P :K=15 :15 :15复合肥)施用量平均为750 kg ·hm-2, 以基肥形式一次性施入.由于地处丘陵区, 当地玉米生产采取人工种植和收获方式, 其它田间管理措施按照当地常规操作进行.
2017年6月底使用直径3.5 cm的土壤采样器在林地和耕地中采集土壤样品, 采样深度为0~15 cm.在每个样方(小区)中依据W形多点采样法采集15个土芯, 并将其充分混合形成一份土壤样品.样品装入灭菌自封袋中于低温样品储藏箱中运送至实验室.将每份土壤样品过筛(< 2 mm)以去除根碎片和有机残骸, 然后分为两份子样品, 一份子样品于-70℃保存用于DNA提取, 另一份子样品风干后用于土壤理化性质分析.土壤理化性质见表 1[26].
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表 1 林地和耕地的土壤理化性质1) Table 1 Soil properties of forest and arable land |
1.2 土壤DNA提取和qPCR
使用PowerSoilTM Total DNA Isolation试剂盒(Mo Bio Laboratories, Solana Beach, CA, USA)按照操作说明书从0.25 g土壤提取DNA.使用NanoDrop ND- 2000分光光度计(NanoDrop Technologies, USA)测定提取DNA的浓度并评价其质量.
在Stratagene Mx3005P Real-time PCR仪上进行qPCR测定细菌16S rRNA基因和cbbL基因丰度, 扩增引物分别为515F/927R[28]和k2f/v2r[18]. 25 μL的PCR反应混合体系包括12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqTM Buffer(2×)(TaKaRa, Bio Inc., Shiga, Japan), 0.5 μL的每种引物(10 μmol ·L-1), 0.5 μL的ROX Reference Dye Ⅱ, 0.05 μL的T4 gene 32 protein(Roche, Laval, Quebec, Canada)以及1.0 μL的土壤DNA模板(cbbL和16S rRNA基因扩增前分别对DNA样品进行10倍和20倍稀释)或标准质粒.细菌16S rRNA基因的扩增程序如下：95℃变性2 min, 95℃变性15 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35个循环.细菌cbbL基因的扩增程序如下：95℃变性2 min, 95℃变性15 s, 62℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35个循环.本试验中设置空白对照, 空白对照和土壤DNA样品各3次重复.通过熔解曲线和凝胶电泳分析以证实扩增的特异性.采用pGEM®-T Easy vector(Promega, USA)构建含目的基因的标准质粒, 并通过测序予以验证, 采用10倍系列稀释的质粒绘制标准曲线.细菌16S rRNA基因和cbbL基因的扩增效率分别为103.3%和88.2%, R2分别为0.997和1.000.
1.3 Illumina高通量测序和数据分析采用Illumina MiSeq平台和上述引物获得细菌cbbL基因的PCR产物.为了区分不同土壤样品产生的扩增子, 在PCR产物末端连接上6 bp的barcode序列. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测并用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter, Inc. S. Kraemer Boulevard Brea, CA, USA)清洗.采用QubitTM ssDNA Assay Kit(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA)测定纯化PCR产物的浓度.然后将每个样品的PCR产物等量混合进行序列分析.测序由生工生物工程(上海)有限公司完成.
分析前要去除短于200 bp、含有任何模糊碱基以及平均质量值低于20的序列, 同时去除标签或引物中的任何核酸错配.采用PEAR根据PE序列之间的overlap关系, 将成对的序列拼接成一条序列, 之后按照barcode标签序列识别并区分样品得到相应样品数据.使用USEARCH去除非特异扩增和嵌合体序列, 并在97%的相似度水平上将高质量的核酸序列聚类到操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs).分析中也要排除具有单独序列的OTU以去除由于序列错误所差生的虚假OTU.在计算cbbL细菌群落的多样性指数(Chao 1、Shannon和Simpson指数)前, 采取重新抽样程序, 按照土壤样品的最低序列数抽取序列以消除不均匀的序列偏差.采用BLAST对照GenBank获得每个OTU的代表性序列, 然后采用Muscle基于翻译的氨基酸序列的比对结果进行多序列比对, 使用MEGA 7将所选序列(至少在一个样品中的序列丰度>1.0%)依照邻接法构建系统发育树, 设置1000次引导重复.将高通量测序获得的序列数据提交至NCBI的GenBank数据库, 提取号为SRR9302158.
1.4 数据分析采用SPSS统计软件(version 20.0, IBM SPSS Inc.)进行Pearson相关分析和方差分析.根据OTU表计算Chao 1丰富度、Shannon多样性和Simpson优势度指数, 采用基于weighted unifrac距离矩阵的主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)确定cbbL细菌群落的组成差异.采用CANOCO for Windows 4.5.1软件(Microcomputer Power, Inc., Ithaca. NY)进行典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)以评价环境因子对cbbL细菌群落结构的影响.使用Monte Carlo检验在CCA中执行手工预选变量程序以确定环境变量的显著性(P < 0.05).相关图采用Origin 9.0绘制.
2 结果与分析 2.1 土壤细菌16S rRNA和cbbL基因丰度林地和耕地土壤细菌16S rRNA基因拷贝数(以土质量计, 下同)分别为6.16×1011和2.22×1011 copies ·g-1[图 1(a)], cbbL基因拷贝数分别为7.30×108和2.57×108 copies ·g-1[图 1(b)], 林地土壤细菌16S rRNA基因和cbbL基因丰度均显著高于耕地(P < 0.05).林地和耕地的cbbL/16S rRNA基因拷贝数比均为0.12%, 差异不显著(P>0.05).
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不同小写字母表明差异显著(P < 0.05) 图 1 林地和耕地土壤细菌16S rRNA和cbbL基因丰度 Fig. 1 Abundance of bacterial 16S rRNA and cbbL genes in soils of forest and arable land |
所有土壤样品共获得364, 498条高质量的cbbL基因序列, 每个样品的序列数范围为54 952~63 714, 可聚类为877个OTU.为保证不同样品间cbbL细菌群落多样性指数和结构的可比性, 笔者按照土壤样品的最低序列数(30 282条序列)进行重新抽样.所有处理的覆盖度均大于0.99, 表明Illumina MiSeq测序的结果可信.耕地的Shannon和Chao1指数显著低于林地(P < 0.05), 而Simpson指数显著高于林地(P < 0.05), 见表 2.
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表 2 林地和耕地土壤cbbL细菌群落的多样性指数 Table 2 Diversity indices of the cbbL-harboring bacterial community in soils of forest and arable land |
优势cbbL细菌的OTU(>1%)共52个(图 2), 根据系统发育树, 其隶属于变形菌门(Proteobacteria)的α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)的放线菌纲(Actinobacteria)以及2个无法归类的簇, 整体上可划分为Form IA和Form IC两类, 其中Form IA类包括13个OTU, Form IC类包括39个OTU(图 3).林地和耕地中Form IC类优势OTU分别占总丰度的57.34%和63.21%, 而Form IA类优势OTU分别占4.89%和25.73%, 与林地相比, 耕地中Form IA类优势OTU的比例显著增加(P < 0.05), 见图 2. Form IC类中, α-变形菌纲(α-Proteobacteria)在林地和耕地的相对丰度分别为11.59%和0.54%, β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)和Unclassified cluster Ⅰ的相对丰度分别为28.29%和50.77%、1.00%和7.20%、13.72%和3.29%以及2.73%和1.42%；Form IA类中, Unclassified cluster Ⅱ和α-变形菌纲(α-Proteobacteria)在林地和耕地中的相对丰度分别为4.88%和0.01%以及0.01%和25.72%, 除Unclassified cluster Ⅰ外, 各类群的相对丰度在林地和耕地间均发生显著变化.对林地和耕地间优势OTU的相对丰度进行显著性分析发现(图 4), 22个OTU表现出显著差异(P>0.05), 与林地相比, 耕地中OTU185、OTU166、OTU32、OTU15、OTU33、OTU12、OTU113、OTU389、OTU106、OTU385、OTU60、OTU769、OTU56、OTU339和OTU51的相对丰度显著升高(P>0.05), 而OTU277、OTU817、OTU458、OTU571、OTU428、OTU565和OTU429的相对丰度显著降低(P>0.05). PCoA分析表明, 林地和耕地的cbbL细菌群落结构不同(图 5).综合以上结果说明林地转型耕地改变了cbbL细菌群落组成.
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图 2 林地和耕地土壤cbbL细菌群落的OTU组成 Fig. 2 OTU composition of the cbbL-harboring bacterial community in soils of forest and arable land |
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仅列出相对丰度大于1%的OUT； 为共有,  为林地特有,  为耕地特有
图 3 土壤cbbL细菌群落的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of the soil cbbL-harboring bacterial community
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图 4 林地与耕地间22个相对丰度显著差异的优势OTU Fig. 4 The 22 dominant OTUs with significant differences in relative abundance between forest and arable land |
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图 5 林地和耕地土壤cbbL细菌群落的PCoA分析 Fig. 5 PCoA analysis of the changes of the cbbL-harboring bacterial community in soils of forest and arable land |
将细菌16S rRNA基因丰度、cbbL基因丰度、cbbL细菌群落的Shannon多样性指数及关键理化因子(pH、OM、AP、NO3-和NH4+)进行Pearson相关分析, 结果表明, 细菌16S rRNA基因丰度、cbbL基因丰度和cbbL细菌群落的Shannon多样性指数均与pH呈显著正相关关系, 而与AP和NO3-呈显著负相关关系(表 3), 说明林地转型耕地后, 长期施肥所导致的土壤pH降低及速效养分的增加对土壤细菌和cbbL细菌丰度以及cbbL细菌多样性有显著的负面影响.同时发现, 细菌cbbL基因丰度与16S rRNA基因丰度呈极显著正相关关系, 表明固碳细菌的种群丰度变化与细菌整体丰度变化表现一致.此外, cbbL细菌群落的Shannon多样性指数与细菌cbbL基因丰度和16S rRNA基因丰度均呈极显著正相关关系.
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表 3 林地和耕地土壤理化性质、细菌16S rRNA基因丰度、cbbL基因丰度和Shannon多样性指数间的相关性1) Table 3 Relationship between soil physicochemical parameters, bacterial 16S rRNA gene abundance, cbbL gene abundance, and Shannon diversity in soils of forest and arable land by Pearson correlation method |
2.4 土壤理化因子与cbbL细菌群落的CCA分析
采用CCA分析确定环境因子对土壤cbbL细菌群落组成的潜在影响(图 6).结果表明, Axis1和Axis2可以分别解释土壤cbbL细菌群落变异的54.9%和21.8%.林地和耕地沿Axis1分离, 表明林地和耕地的cbbL细菌群落组成不同.蒙特卡洛分析表明, pH(R2=0.900, P=0.002)、NO3-(R2=0.895, P=0.002)、AP(R2=0.893, P=0.002)和NH4+(R2=0.646, P=0.002)是影响cbbL细菌群落结构的主要因子, 其中pH与林地土壤cbbL细菌群落显著正相关, 而NO3-、AP和NH4+与耕地土壤cbbL细菌群落显著正相关, 并且AP和NO3-的影响程度大于NH4+.
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图 6 土壤cbbL细菌群落结构的典范对应分析 Fig. 6 Soil cbbL-harboring bacterial community structure by CCA analysis |
通过qPCR分析在林地和耕地土壤中均检出较高丰度的cbbL基因, 说明本研究的林地和耕地土壤中均存在相当数量的自养细菌.土地利用方式的变化会影响微生物群落的数量和多样性[29].耕地土壤16S rRNA基因和cbbL基因数量均显著低于林地, 说明这种土地利用类型的转变对土壤总体细菌和自养细菌丰度均产生显著影响.但对cbbL/16S rRNA基因拷贝数比分析发现, 林地和耕地间差异并不显著, 说明林地转型耕地抑制了所有细菌的生长, 而不仅仅是土壤cbbL细菌.这与Hu等[30]在长期施肥对喀斯特土壤phoD细菌群落的影响的研究结果具有相似性.多样性指数是评价不同土壤微生物群落多样性的有效手段[31], Shannon指数和丰富度高表明微生物群落多样性高.本研究发现, 耕地的Shannon指数和Chao1指数均显著降低, 而Simpson指数显著升高, 说明相比于林地这种自然生态系统, 耕地土壤的cbbL细菌多样性降低.然而, Zhou等[32]的研究发现, 与对照不施肥处理相比, 施肥处理显著提高了土壤cbbL基因的α-多样性, 说明施肥对土壤cbbL多样性具有积极的影响[18, 33].这与本研究的结果不同, 分析发现这些研究的对象均为农田生态系统, 而本研究的对象是2种截然不同生态系统(森林生态系统和农田生态系统), 因此才会出现这种相反的研究结果.
高通量测序的结果表明林地和耕地土壤中大多数cbbL OTUs隶属于未知细菌门(分别占林地和耕地总OTU的94%和98%), 这与Zhou等[32]的研究结果一致.进一步对高通量测序结果进行筛选, 仅对可注释的含cbbL的门进行分析, 结果表明变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度最高(数据未列出), 这与一些研究所报道的结果相一致[18, 32, 34~36].分析过程中发现NCBI的GeneBank数据库序列信息的限制是导致对大多数序列无法进行深度注释的原因, 因此, 本研究选取优势cbbL细菌的OUT并在氨基酸水平上重新进行分析和构建系统发育树(图 4), 结果表明优势cbbL细菌的OUT可归入于α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)以及2个无法归类的簇, 这与Lynn等[19]和刘琼等[31]的研究结果相似.这些OUT可归为2大类, 即Form IA类和Form IC类.从整体上看, Form IC类的相对丰度在林地和耕地间差异不显著, 而耕地的Form IA类的相对丰度显著升高, 说明Form IA类cbbL细菌可能对林地转型耕地的响应更加强烈.然而对这2大类中的每一小类的相对丰度在林地和耕地间差异分析发现, 林地的Form IC类α-变形菌纲(α-Proteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)的相对丰度显著高于耕地, 而β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的相对丰度显著低于耕地, 说明虽然整体上Form IC类cbbL细菌的相对丰度未发生显著变化, 但在更深层次的分类水平上其群落组成发生了显著改变；而在Form IA类中, 林地的α-变形菌纲(α-Proteobacteria)的相对丰度却显著低于耕地, 说明生物分类学水平相同的同一纲的cbbL细菌对林地向耕地的转型产生的应答不同, 而林地的Unclassified cluster Ⅱ的相对丰度显著高于耕地.以上这些结果也均表明林地向耕地的转型过程中, 土壤cbbL细菌的群落结构发生了显著变化.同时, PCoA分析(图 5)也进一步证明了林地转型耕地改变了土壤cbbL细菌群落组成.本研究中, 21个林地和耕地共有优势OTU中的18个为Form IC类, 3个为Form IA类, 18个林地特有的优势OTU中的17个为Form IC类, 1个为Form IA类, 13个耕地特有的优势OTU中的4个为Form IC类, 9个为Form IA类.显著性分析表明, 22个OTU表现出显著差异(P>0.05), 而笔者发现这个数值小于林地和耕地特有OTU数量以及存在显著差异共有OTU的数量的总和, 分析认为土壤不均一性所导致的个别OTU在3次重复间差异很大是造成此结果的主要原因.通过进化树对可归类到属的优势OTU进行分析发现, 一些林地特有的OTU隶属于亚硝化螺菌属(Nitrosospira)(OTU737和OTU817)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)(OTU277), 多数耕地特有的OTU隶属于硝化杆菌属(Nitrobacter)(OTU91、OTU33、OTU32、OTU113、OTU106、OTU12、OTU105和OTU109), 亚硝化螺菌属(Nitrosospira)是氨氧化细菌, 慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)是自由生存的共生N2固定微生物, 硝化杆菌属(Nitrobacter)是亚硝酸盐氧化细菌, 这些属的微生物可能在各自生态系统的土壤C和N循环耦合中发挥重要作用.
本研究中, 耕地土壤pH显著低于林地, 说明林地转型耕地后的长期施肥导致土壤酸化[37~39], 相关分析显示细菌16S rRNA基因丰度和cbbL基因丰度均与pH显著正相关, 证明了土壤pH的改变直接导致了土壤细菌总数量和固碳细菌数量的降低.同时, 细菌16S rRNA基因丰度和cbbL基因丰度与AP和NO3-显著负相关, 说明化肥长期投入所带来的速效养分增加没有促进细菌总数量和固碳细菌数量的增加, 相反却改变了土壤cbbL细菌种类, 群落中优势种更加突出, 群落的Shannon多样性指数降低.这一结果同样与[18, 32]的结果相反, 再次说明施肥处理在农田生态系统和不同生态系统(森林生态系统和农田生态系统)间的影响不同.相关性分析也发现, cbbL细菌群落的Shannon多样性指数与细菌cbbL基因丰度极显著正相关, 同样说明土壤cbbL细菌与整体细菌对土地利用方式转变的响应具有协同性.同时, cbbL细菌群落的Shannon多样性指数与细菌cbbL基因丰度和16S rRNA基因丰度也极呈极显著正相关, 这与Lynn等[19]对3种自然生态系统中土壤固碳细菌多样性的研究结果一致. CCA分析表明, 林地转型耕地后的26年长期施肥改变了土壤cbbL细菌群落结构(图 6), 这与Yuan等[18]、Lynn等[19]以及Zhou等[32]的研究结果相似.土壤pH、NO3-、AP和NH4+是决定土壤cbbL群落结构的关键变量, 这与一些研究的结果具有相似性[18, 19, 35, 40].由此可见, 林地转型后的26年长期施肥通过直接影响土壤的pH及速效养分含量从而改变了土壤cbbL细菌的生态特征.而本研究中, OM对土壤cbbL细菌群落结构的影响并不显著, 分析认为可能的原因是本研究由于受地理条件的限制, 玉米的种植和收获均采用人工方式, 玉米生产结束后, 仅地上部分移出农田外, 其根茬仍全部保留在农田里, 导致耕地土壤有机质含量较林地下降不显著.
本研究中未测定土壤固碳活性, 因此无法评价林地转型耕地后土壤固碳活性的变化, 在今后的研究中, 要采取qPCR、稳定同位素探针、RNA seq等技术在RNA水平上对林地和耕地这2种生态系统的土壤固碳细菌的转录情况进行分析, 并结合固碳酶活性的测定, 深入探讨林地转型耕地对土壤固碳活性的影响及其微生物学机制.
4 结论与林地相比, 耕地土壤细菌16S rRNA和cbbL基因丰度显著降低. 26年的长期耕作也显著降低了耕地土壤cbbL细菌的Shannon和Chao1指数, 而Simpson指数显著增高.林地转型耕地导致土壤化学性质的改变, 其中pH、AP和NO3-是决定细菌cbbL基因丰度和Shannon指数的主要环境因子.土壤cbbL细菌群落结构也因林地转型耕地而发生显著变化, pH、NO3-、AP和NH4+的变化共同引起了土壤cbbL细菌群落结构的改变.通过对土壤化学性质的影响, 林地转型耕地主要降低了土壤cbbL基因丰度, 并引起了土壤cbbL细菌群落结构的变化.
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