2019, Vol. 40
采矿对周围环境造成严重的重金属污染.重金属是一种持久性的有毒污染物, 具有潜在的、长期的、累积的和不可逆的特征.重金属污染不仅改变土壤质量, 影响作物生长, 还通过食物链进入人体, 危害人体健康和生命[1~3].由于人类活动所导致的环境变化可以从根本上改变土壤质量和养分循环(如C、N和P), 从而构建新的土壤微生物群落[4], 而微生物比土壤理化性质更具有动态性和敏感性, 因此土壤微生物群落的多样性能够表征土壤质量[5, 6].
近年来, 高通量测序技术已经被广泛应用在深入了解环境中微生物群落组成和多样性的认识[7~10].由于微生物群落的结构和多样性能有效地提供关于环境变化的综合信息, 其受到人们越来越多的关注, 并且许多研究也试图阐明影响微生物的各种因素.一般来说, 重金属对微生物群落的影响是显著的[11], 它使敏感菌群骤减甚至灭绝, 而使抗性菌群成为优势菌[12], 由这引起的群落结构变化严重影响了土壤微生物原有的功能[13], 使得物质循环能力及营养分解等土壤肥力严重下降[14], 同时, 可以从污染土壤中分离筛选出耐受重金属的菌株, 有助于研究其抗性基因[15], 为将来应用与重金属修复提供菌株.此外, 其他环境因子(pH与营养物质等)也与具体微生物而关联. Jiang等[16]研究了铜矿区的耐铜植物根际土壤细菌群落, 也发现影响细菌群落的最重要的环境因素是土壤pH而不是Cu浓度.相比之下, Stefanowicz等[17]在铅锌矿区草地进行的研究的结果表明, 高营养物质和植物物种丰富度可明显抵消金属污染的毒性作用, 这后来被证明有益于土壤微生物生存[13].这些研究发现影响微生物的环境因素具有多样性, 表明土壤微生物群落可以适应不同的生态环境.且有助于人们探索重金属等环境因子与土壤微生物群落之间的相互作用, 从而阐明重金属污染改变微生物群落结构的机制.
铜陵市是我国著名的有色多金属矿区, 其中狮子山金属矿开采等一系列工况所造成的土壤重金属污染问题对当地环境造成了很大影响[18], 研究这一矿山问题具有显著代表性.据调查, 矿山不同的土地利用类型是由于不同的矿业活动造成的, 从而导致重金属污染及理化性质在不同区域差异显著[19], 且不同土壤利用类型下的土壤理化性质[SOM、含水率(MC)、pH和AK等]也会影响重金属毒性, 所以重金属污染下微生物群落结构的变化不仅取决于重金属浓度, 还需结合土壤中的理化性质等参数[20~22].并且关于铜陵狮子山矿区不同土地利用类型的重金属污染对土壤微生物群落影响的研究并不多.张雪晴等[23]和Yang等[24]分别对铜陵矿区的不同污染程度的土壤和废弃尾矿池的酸矿水进行微生物群落分析, 得到了部分细菌和真菌及分布情况.而本研究使用的高通量测序方法能够较为准确全面地反映土壤微生物群落结构[25], 且能较全面地对于矿山不同土地利用类型中土壤微生物群落多样性进行研究.
因此, 本文选择安徽铜陵狮子山矿区4种不同土地利用类型(菜园、尾矿库、堆矿区和选矿区)的土壤为研究对象, 利用高通量测序的方法, 对不同片区土壤中的微生物群落结构及其与环境因子的相关性进行了研究.具体来说, 本研究使用高通量测序描述微生物群落与土样理化性质之间的联系, 从而掌握矿山不同土壤环境及环境胁迫带来的微生物多态性的差异.更重要的是这些方法的应用, 可以将环境变量以及地域差异对群落多样性的影响量化以及可视化.
1 材料与方法 1.1 样品采集本研究采样点设在狮子山杨山冲尾矿库及周边, 采样地点属于亚热带气候, 年均温度16.2℃、平均年降水量1 340 mm[26].根据矿山总平面布置图, 针对不同土地利用类型, 选取菜园V.G.(矿山脚下的菜地)、尾矿库T.R.(已经复垦的尾矿区)、堆矿区H.M.A.(临时堆土区、排土场)和选矿区D.A.(选矿厂)进行采样(图 1).每个采样区域样品收集5份土样, 同一区域样品彻底混合装入无菌密封袋冷藏运输回实验室.将所有的土壤样品过2 mm尼龙筛均质化去除结石和植物根部并分成2份.将一部分新鲜土壤于室内风干、研磨、过筛后装入无菌的自封样品袋中于4℃冰箱保存, 用于土壤理化性质测定；另一部分新鲜土壤, 装入无菌塑料袋, 置于-80℃的冰箱中存储, 用于土壤微生物的DNA提取和测序.
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图 1 采样分布示意 Fig. 1 Sampling location map |
土壤pH采用电极电位法测定[27].养分指标选择有机质、速效氮、全氮、有效磷和速效钾, 其中, 有机质采用重铬酸钾容量法[27]；全氮和速效氮采用纳氏比色分光光度法[26]；有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法[27]；速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度计法[28].水分指标选择土壤含水率(MC), 采用烘箱干燥法在(105±2)℃条件下, 烘干至恒重, 然后称量计算[29].样品采用过氧化氢-硝酸-氢氟酸消解法消解.配置重金属标准曲线溶液, 使用火焰原子分光光度计(AAS), 测定样品Cu、Pb、Zn、Cd、Ni和Mn等元素含量[30].采用内梅罗综合污染指数法评价矿山土壤重金属综合污染状况[31].
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式中, PN为内梅罗综合污染指数；Ci为污染物i含量的实测值, mg·kg-1；Si为污染物i的当地背景值, mg·kg-1.
1.3 DNA提取与PCR扩增样品按照MOBIO PowerSoil® DNA Isolation Kit试剂盒操作方法提取样品基因组DNA[32].以提取的样品基因组DNA为模板针对微生物16S rRNA基因V4区(515F与806R)进行PCR扩增[28]. PCR扩增条件：94℃变性5 min, 然后30个循环(94℃ 30 s, 52℃ 30 s, 72℃ 45 s), 最后在72℃延伸10 min.将同一样品的PCR产物利用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 并根据PCR产物的浓度, 将各样品进行等浓度混样, 最后使用EZNA Gel Extraction Kit(Omega, USA)凝胶试剂盒回收混合产物. PCR扩增产物经建库检测, 将合格的文库在Illumina MiSeq平台进行高通量测序.
1.4 统计分析数据采用Microsoft Excel 2013进行统计.通过QIIME平台去除原始序列中的低质量序列[33], 根据标签序列分开来自不同样品的序列.利用Uchime软件去除在PCR过程中形成的嵌合体[34], 获得的高质量序列用Usearch方法进行聚类[35], 以16S rRNA基因序列97%相似度作为分类操作单元(operational taxonomic units, OTUs)的划分标准. Chao1和Shannon多样性指数的计算利用QIIME平台完成, 通过RDP分类鉴定OTU代表性序列的微生物分类相对丰度.方差分析(ANOVA)、Pearson相关性分析用SPSS Statistics 19.0完成.用R软件(版本2.15.3)中的各种数据包可以完成VPA、Heatmap等图进行分析检验[35].
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质及重金属含量4种不同土地利用类型土壤样品MC和营养物质含量如表 1所示, 可以看出, 4个区域的pH的顺序为尾矿库(7.14)>菜园(5.64)>选矿区(5.17)>堆矿区(3.75).菜园中的有机质、全氮、速效氮、有效磷、有效钾相对于其他3个采样区域样品要高, 分别为16.16 g·kg-1、2.91 g·kg-1、334.53 mg·kg-1、119.80 mg·kg-1和118.10 mg·kg-1.而在MC方面, 尾矿库最低为0.53%；最高出现在堆矿区, 为4.27%, 高于菜园(1.53%).
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表 1 土壤含水率和营养物质含量 Table 1 Soil moisture and nutrient content |
土壤重金属含量及污染指数如表 2所示.重金属Cu、Pb、Zn、Cd、Ni和Mn含量分别在297.48~601.37、94.45~406.40、362.62~593.67、5.43~6.63、37.31~65.07和425.56~1 425.44 mg·kg-1之间.与铜陵当地的土壤背景值(Cu：79.0 mg·kg-1, Pb：67 mg·kg-1, Zn：139 mg·kg-1, Cd：0.71 mg·kg-1, Ni：33 mg·kg-1, Mn：846 mg·kg-1)相比, 6种元素均超出背景值.根据内梅罗综合污染指数发现矿山4种不同土地利用类型均为重污染土壤(PN>3), 依次为堆矿区(7.28)>选矿区(6.99)>尾矿库(6.55)>菜园(5.92).
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表 2 土壤重金属含量及污染指数 Table 2 Heavy metal content in soil and pollution index |
2.2 微生物群落的组成及多样性
Observed species指数对应的稀释曲线表明(图 2), 随着测序数量的增加, 曲线趋于平缓但并未达到饱和, 这说明此次试验取样基本合理, 现有的测序量对于获得新的OTUs已经足够.
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图 2 物种稀释曲线 Fig. 2 Species dilution curve |
而通过Veen图可以直观地表现环境样本的OTUs数目组成相似性及重叠情况[36]. 图 3显示, 4个区域共有的OTUs数目为670个, 并且各区域都有不同于其他区域的OTUs数目.另外, 4个区域的OTUs数量为尾矿库(3028)>选矿区(2814)>菜园(2755)>堆矿区(2172).同时, 表 3中的Shannon指数、Chao1指数和Observed species指数验证上述物种丰富度排名情况. Shannon指数表征物种多样性和均匀性.由Shannon指数得出, 选矿区(9.45)具有最大多样性和均匀性, 而堆矿区(7.39)则最小.在物种的丰富度上, 由Chao1指数和Observed species指数可以得出, 这两种指数最大值均在选矿区, 分别为3 329和2 814, 最小值均在堆矿区, 分别为2 677和1 907.
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图 3 OTU韦恩图 Fig. 3 OTU Venn diagram |
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表 3 微生物多样性信息 Table 3 Sequencing information in this study |
基于Weighted Unifrac距离的主坐标分析(PCoA)显示了土地利用类型和土壤理化性质对微生物群落β-多样性的综合影响(图 4). PCoA结果显示, 约有83.16%的微生物群落组成变异得到解释(第一和第二维分别是52.81%和30.35%), 表明土地利用类型及土壤理化性质等相关参数对微生物群落有较为显著地影响.此外, 菜园和选矿区距离相近, 说明这两个采样区域的微生物群落相似性很高.而尾矿库与堆矿区各自分散, 较为独立, 说明不同土地利用类型下微生物群落组成差异很大.
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图 4 细菌群落相似性PCoA分析 Fig. 4 PCoA analysis of the similarity of bacteria communities |
OTUs序列条数可以分成不同的类别(从属到门), 土壤微生物群落在门(0.01)水平上的相对丰度共有13门(图 5), 主要有细菌(98.07%)和古菌(1.93%)组成.由图 6得, 其中的优势菌群有Proteobacteria(37.21%)、Bacteroidetes(17.53%)、Acidobacteria(12.27%)、Actinobacteria(5.53%)和Gemmatimonadetes(5.35%), 丰富度>5%, 优势菌占总菌数的77.89%.此外, 笔者还在样品中观察到有许多丰富度小但能引起人们注意的菌种, 如Verrucomicrobia (4.90%)、Firmicutes(4.24%)、Chloroflexi(3.55%)、Planctomycetes(3.10%)、Crenarchaeota(1.93%)、OD1(0.93%)、Cyanobacteria(0.74%)和Nitrospirae(0.60%).
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图 5 不同土地利用类型中微生物群落(门水平)分布 Fig. 5 Distribution of microbial community (phylum level) in different land use types |
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图 6 各门类微生物总体占比情况 Fig. 6 Overall proportion of each phylum of microorganisms |
13门菌在4个区域中的占比情况如图 5. Proteobacteria为最优势菌群, 分别占堆矿区的43.67%, 占选矿区的41.63%, 占菜园的32.62%和尾矿库的30.93%. Bacteroidetes在菜园、尾矿库以及选矿区较多, 分别占27.65%、16.69%和17.90%. Firmicutes在堆矿区占比最多为15.19%, 而在其他3个区域中几乎可以忽略. Cyanobacteria和Nitrospirae在4个区域分布都很少.
从纲的丰度图(图 7)可以看出, 4个区域的微生物群落在纲水平上分布具有较大差异.在纲的水平上, Proteobacteria主要包括4个纲目, 分别为β-Proteobacteria(13.16%)、α-Proteobacteria(10.52%)、γ-Proteobacteria(9.54%)和δ-Proteobacteria(3.81%), 见图 8.其中β-Proteobacteria和α-Proteobacteria都在选矿区具有最大的占比, 分别为16.12%和17.48%, 而其他区域差异不大.而γ-Proteobacteria在选矿区只占3.85%, 最大丰度在尾矿库为20.92%.从属的丰度图(图 9)可以看出, 较丰富的物种是Flavobacterium(3.37%)、Kaistobacter(2.04%)、Ramlibacter(2.01%)和Acinetobacter(2.00%), 见图 10.其中Flavobacterium在菜园丰度最大, 为7.68%. Kaistobacter除了在菜园和尾矿库丰度很小, 在堆矿区和选矿区丰度较高, 菜园占0.09%, 尾矿库占0.09%, 堆矿区占3.01%, 选矿区占3.37%. Ramlibacter在堆矿区丰度最小, 为0.09%, 在选矿区丰度最大, 为3.78%. Acinetobacter在堆矿区丰度最高, 为7.22%, 而在其他3个区域丰度几乎可以忽略不计.
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图 7 各纲目在不同土地利用类型中的分布 Fig. 7 Distribution of each class in different land use types |
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图 8 各纲目总体占比情况 Fig. 8 Overall proportions of each class |
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图 9 各属在不同土地利用类型中的分布 Fig. 9 Distribution of genera in different land use types |
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图 10 各属总体占比情况 Fig. 10 Overall proportion of each genera |
本研究对土壤微生物群落结构及多样性与环境因子进行了典型对应分析和相关性分析(见图 11和表 4).由CCA结果显示(图 11), 微生物群落结构与该生境中的重金属浓度、土壤营养物质等14个环境因子之间存在明显的关联.得出MC、Pb和Cd是本研究中对微生物群落影响最大的环境因子, 其次是pH、Mn和PN等. 图 11中Firmicutes与MC、Pb和Zn呈极显著正相关, Crenarchaeota和Nitrospirae与Cd呈正相关, 与pH、Mn和Ni呈显著正相关, Cyanobacteria与Cu、AP、AN等营养物质呈极显著正相关. PN与Firmicutes呈显著正相关, 与Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Proteobacteria、Actinobacteria和OD1呈较弱正相关, 与Cyanobacteria、Crenarchaeota等其他微生物呈负相关.
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图 11 微生物与环境典型对应分析 Fig. 11 Canonical correspondence analysis (CCA) of microorganisms and environment |
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表 4 土壤细菌生态多样性与土壤理化性质相关性分析1) Table 4 Correlation analysis between soil bacterial ecological diversity and soil physical and chemical properties |
由相关性分析(表 4)来看, pH和OTUs数目呈显著正相关, 和Shannon指数、Chao1指数以及Observed species指数呈正相关.对于土壤有机质、全氮、速效氮、有效磷和有效钾来说, 其与细菌丰富度之间相关性较低.在重金属方面, 重金属Cu、Cd、Mn和OTUs、Shannon指数、Chao1指数、Observed species指数呈正相关, 其中重金属Cd和4个生态多样性指标呈显著正相关, 与Chao1指数和Observed species指数呈极显著正相关.与Cd不同的是, 重金属Pb、Zn、Ni和4个生态多样性指标均呈负相关, 与OTUs和Chao1指数呈显著负相关.
3 讨论 3.1 土壤理化性质特征本研究中, 土壤MC、营养物质与重金属含量在不同土地利用类型下表现出显著的变化(表 1).各采样区域理化性质的不同可能是由于矿石处置时间[37]、当地空气和水的可用性以及不同取样部位的微生物代谢活动的水平和性质[38]所导致的.尾矿库pH呈中性偏碱性, 可能是由于添加了粉煤灰等表面覆盖物质, 导致其土壤呈中性偏碱性[39], 而其他区域可能是受到矿山的酸矿水的流经或者灌溉等影响, 从而导致其土壤呈酸性.菜园中的营养物质明显高于其他3个区域, 这可能是菜园经常灌溉施肥, 土壤较为肥沃. 表 2显示, 4个区域均表现出不同重金属污染程度.其中重金属Cu含量较高, 在选矿区含量最高, 该区域是选矿工艺形成废水的集中地, 这也跟狮子山是铜矿产地且在选矿过程主要筛选铜矿有很大关系.其次严重的是重金属Cd污染, 菜园重金属Cd含量为5.43 mg·kg-1, 远高于当地土壤背景值, 这可能是由于矿山开采过程中产生的重金属通过多种途径散布至菜园, 因此菜园种植的蔬菜可能危害周围居民身体健康, 同时菜园也无法成为合格的无公害蔬菜产地.殷汉琴等[40]对铜陵市及其周边地区土壤重金属元素污染评价时也发现, 铜陵市及周边地区土壤中Cd和Cu污染较严重.
3.2 微生物群落组成及多样性分析微生物会通过改变其群落丰度及结构来适应高负荷的重金属污染, 因此生态系统中的微生物多样性和均匀性也会受到改变. 表 3显示, 在受重金属污染最严重的堆矿区中, 其微生物群落丰度及结构多样性均弱于其他3个区域, 图 5也验证了该结果, 即Bacteroidetes、Acidobacteria和Verrucomicrobia等菌在堆矿区中的丰度较其他3个区域有很明显的锐减趋势, 特别是Crenarchaeota在堆矿区基本上无分布.相反的是, Proteobacteria和Firmicutes在堆矿区和选矿区中分布反而增加了. Pereira等[41]的研究结果也发现, 在长期重金属污染下, 微生物群落结构多样性和丰度会降低.
所研究土壤中最丰富的3种门之一是Proteobacteria, 其在不同的土壤中如农田[42]、森林土壤[43]和红树林[44]均属于优势菌[45]. Feris等[46]和Gillan等[47]的研究表明, Proteobacteria对重金属的耐受力最强, 一定浓度下随着重金属污染的加重而增加, 这与本研究的结果一致.而Yin等[48]却发现在重金属高污染沉积物中, Proteobacteria的丰度相对较低, 这可能是由于微生物群落间相互作用来适应新生境的结果.所以Proteobacteria对重金属所表现出的反应可能取决于其复杂的生活方式, 一方面可以通过生物转化作用降低重金属的毒害[49], 另一方面可以使用多种有机质作为能源与其他菌群共同生存[50], 这一特性使得Proteobacteria能够适应绝大多数环境.
而另一种优势菌Bacteroidetes与Proteobacteria不同, 其在4个采样区域的丰度大小各不相同, 说明不同重金属元素对Bacteroidetes的影响不同[51]. Acidobacteria和Verrucomicrobia在尾矿库丰度最大, 在重金属污染最严重的堆矿区中丰度最小.江玉梅等[52]也发现在重金属污染下这两种微生物的分布. Firmicutes与重金属Pb、Zn及PN显著相关(图 11), 有研究表明[53, 54], Firmicutes有耐重金属的特性, 可以通过各种方法减轻重金属的毒害, 从而使得Firmicutes在堆矿区丰度最多, 但是可能是由于尾矿库复垦时间长, 氮含量增加[55], 导致Firmicutes在尾矿库丰度分布少.
进一步地分类学表明, 纲水平的微生物组成存在相当大的差异. β-Proteobacteria是Proteobacteria中丰度最高的一个纲菌, 在4个采样区域均有大量出现, Liao等[56]和Wang等[57]的研究结果也表明在受重金属污染的土壤中, β-Proteobacteria是变形杆菌中最丰富的纲.在属水平的微生物中, Flavobacterium在菜园大量出现, 而在其他3个区域存在极少, 这说明重金属会导致该属丰度降低, 易艳梅等[58]也发现在重金属污染区Flavobacterium含量也极少. Kaistobacter在堆矿区和选矿区丰度较高, 在其他2个区域丰度较低, 这表明Kaistobacter可能对重金属有一定的耐受性, 且Wu等[59]也发现, Cu等重金属与Kaistobacter具有显着正相关性, Kaistobacter和Sphingomonas与Cu呈正相关, 并在重金属污染土壤中被广泛检测到[60]. Candidatus Nitrososphaera以氨氧化著称[61], 在污染环境中氨氧化细菌具有绝对优势[62], 这表明氮循环与矿山重金属污染土壤中的微生物之间存在密切的相互作用[63].
3.3 环境因子对微生物群落结构多样性的影响微生物群落组成不仅受重金属污染的影响, 还受到土壤水分、理化性质等因素影响, 尤其是受到MC、Pb、Cd、pH、Mn和内梅罗综合污染指数PN的影响(图 11).多种微生物与MC呈正相关, 如Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria等, 尤其是Firmicutes与MC呈极显著正相关.这与Wu等[64]在土壤理化性质与重金属浓度对不同土地利用类型微生物群落组成的研究中认为土壤水分是影响微生物群落的第二大重要因素相似.景炬辉等[37]的研究也发现, 重金属Cu、Pb、Zn和Mn主要影响细菌相对丰度变化.
表 4显示, 本研究中pH与多样性指数均为正相关, 表明pH对微生物群落结构有较大影响[65].这与Pennanen[66]研究北方森林下的土壤所得结论相似, 即pH的增加改变了微生物群落的结构, 导致革兰氏阴性菌的数量增加.而对于土壤有机质、全氮和速效氮等营养物质来说, 其与微生物丰度之间的相关性较弱, 这表明营养物质的水平对微生物种类的影响较小.但是戴雅婷等[67]的研究结果表明, 土壤有机质等营养物质含量与土壤细菌群落多样性间均有极显著正相关关系.与本研究结果不同的原因可能是采样区域处于矿区, 植被覆盖率低, 导致土壤营养物质含量较低.
相较于pH与土壤有机质、全氮和速效氮等营养物质, 本研究发现重金属污染对微生物群落结构多样性的影响更大.堆矿区物种丰度最小的原因可能就是由于大量废弃矿石堆积该区域, 重金属不断堆积至土壤中[68], 导致物种丰富度下降.而谢学辉等[69]和金笑等[70]的研究发现, 重金属Cu和Cd对微生物群落结构多样性的影响并不显著, 相反, 张雪晴等[23]对铜陵附近铜矿的研究结果则表明随着重金属浓度的加大, 引起细菌物种数量的下降, 导致细菌群落多样性降低, 与本研究结果相似.另外, Kelly等[71]的研究发现Zn会影响土壤微生物的群落结构和功能多样性. Moffett等[72]应用扩增核糖体DNA限制分析也发现, 高浓度的Zn含量降低了可耕地细菌群落的多样性, 本研究也得出了与上述研究相似结果.各研究结果的差异可能是由于不同区域所处的环境不同, 导致差异出现, 同时这也从另一方面说明了影响微生物群落结构多样性不是简单地由单个因素造成的, 而是与多种复杂的环境因子有关.
总的来说, 本研究对矿区中4种不同土地利用类型进行了分析, 可以大致看出, 整个矿区的微生物群落结构变化呈现区域性, 并不是一个整体, 对不同土地利用类型划分研究, 让人们对矿区微生物群落结构的系统变化有了更加全面地了解.
4 结论(1) 不同土地利用类型的土壤理化性质不同. 4个区域pH顺序为尾矿库(7.14)>菜园(5.64)>选矿区(5.17)>堆矿区(3.75)；菜园中的有机质、全氮、速效氮、有效磷、有效钾为4个区域样品中最高. 4个区域的内梅罗综合污染指数依次为堆矿区(7.28)>选矿区(6.99)>尾矿库(6.55)>菜园(5.92).
(2) 微生物群落结构多样性存在区域性变化, 即在不同土地利用类型中, 其变化均不同.通过PCoA、CCA和相关性分析可知, pH和重金属污染对微生物群落结构多样性影响较大.在不同土地利用类型土壤受到长期重金属污染的情况下, Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes对重金属污染有耐受能力, 能够在污染较强的区域仍有较大的丰度, 在纲和属水平的微生物中, β-Proteobacteria和Kaistobacter也具有较强的重金属耐受性.
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