环境科学  2019, Vol. 40 Issue (12): 5446-5455   PDF    
共基质模式下铁盐脱氮反应器的运行性能及微生物学特征
王茹1, 刘梦瑜1, 刘冰茵1, 赵治国2, 袁林江1     
1. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 陕西省环境重点实验室, 西北水资源环境与生态教育部重点实验室, 西安 710055;
2. 陕西冶金设计研究院有限公司, 西安 710032
摘要: 铁盐作为自养反硝化电子供体时,被氧化产生的高价铁易于沉淀,使得反硝化微生物表面产生"铁壳",其抑制微生物的活性,甚至导致微生物死亡.为解决自养铁盐脱氮反应器因"铁壳"包被而导致的反应器效能下降问题,本文采用共基质模式培养铁盐脱氮反应器,即在反应器进水中适量添加少量乙酸钠,作为有机电子供体,以期实现铁盐脱氮反应器的高效、稳定运行.结果表明,添加适量有机物可使得铁盐脱氮反应器高效稳定运行,效能(以N计)达0.51 kg·(m3·d)-1,稳定运行约30 d.共基质模式下,反应器运行期间始终可以检测到异养菌.结合污泥的TEM检测结果,发现在铁盐脱氮反应器稳定运行期间,异养菌是铁盐脱氮主力军,其独特的铁盐代谢方式可有效避免铁壳形成.本项研究有效解决了铁盐脱氮过程中微生物"铁壳"包被难题,将助力于自养脱氮技术的研发及应用.
关键词: 铁盐脱氮      共基质      脱氮效能      微生物学特征      反应机制     
Operational Performance and Microbiological Characteristics of an Iron-Salt Denitrification Reactor in Co-substrate Mode
WANG Ru1 , LIU Meng-yu1 , LIU Bing-yin1 , ZHAO Zhi-guo2 , YUAN Lin-jiang1     
1. Key Laboratory of Environmental Engineering, Shaanxi Province, Key Laboratory of Northwest Water Resources, Environment and Ecology, Ministry of Education, School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China;
2. Shaanxi Metallurgical Design & Research Institute Co., Ltd., Xi'an 710032, China
Abstract: When iron salt is used as an autotrophic denitrification electron donor, the high iron yield generated by oxidation is easy to precipitate, resulting in "iron encrustation" on the surface of denitrifying microorganisms, which inhibits their activity and even leads to their death. In order to solve the degradation of the efficiency of the autotrophic ferric denitrification reactor caused by the "iron encrustation" coating, this paper adopted the co-substrate mode to cultivate the ferric denitrification reactor; that is, a small amount of sodium acetate was added into the water of the reactor as an organic electron donor, to realize the efficient and stable operation of the ferric denitrification reactor. The results showed that adding an appropriate amount of organic matter could make the iron salt denitrification reactor run efficiently and stably, with an efficiency of up to 0.51 kg·(m3·d)-1, for more than 30 days. Heterotrophic bacteria could always be detected during the operation of the reactor in the co-substrate mode. Combined with the transmission electron microscopy (TEM) test results of the sludge, it was found that during the stable operation of the iron-salt denitrification reactor, heterotrophic bacteria were the main cause of iron-salt denitrification, and their unique iron-salt metabolism mode could effectively avoid the formation of iron encrustation. This study effectively solved the problem of microbial "iron encrustation" coating in the process of iron-salt denitrification, and will contribute to the development and application of autotrophic denitrification technology.
Key words: ferrous iron-dependent denitrification      co-substrate      denitrifying efficiency      microbiological characteristics      mechanism     

传统的生物反硝化需要有机物作为电子供体, 被称为异养反硝化.异养反硝化脱氮彻底但成本略高, 且产生温室气体, 同时污泥产量高[1~3]. 1996年, 德国学者Straub首次在城市下水道管网中分离获得3株可利用亚铁盐作为电子供体的反硝化菌株, 从此开启铁型自氧反硝化的系列研究[4~6].

基于铁盐的反硝化技术逐步引起人们的青睐.亚铁盐价廉易得, 且基于亚铁盐的自养反硝化产物多为氮气, 反硝化过程无亚硝氮积累, 污泥产量低[7~9].基于亚铁盐的自养反硝化产物高铁盐还可用于废水除磷和重金属吸附去除[10~12].此外, 亚铁盐和硝酸盐作为污染物共存于地下水时, 硝酸盐得以还原, 产生的三价铁可用于吸附水体中的重金属汞[13, 14], 在笔者先前的工作中通过种泥流加技术实现了基于铁盐的单基质模式下高效、稳定废水自养脱氮, 脱氮最高效能(以N计)为0.7 kg ·(m3 ·d)-1;稳定效能达(以N计)0.22 kg ·(m3 ·d)-1, 高于报道的其他铁盐脱氮反应器脱氮效能, 较之硫型、氢型自养反硝化, 铁型自养反硝化具有安全性高、无毒害和价格低廉等优势.在自养反硝化过程中亚铁盐失去电子成为高铁盐, 高铁盐会在细胞周围沉淀(偏中性pH环境所致), 产生大量铁质结壳.铁质结壳包裹微生物细胞, 阻碍细胞与外界的传质, 导致细胞失活甚至死亡, 从而降低铁盐脱氮的效能[15, 16].如何避免“铁壳”形成, 或如何“破壳”, 成为铁盐脱氮技术发展的瓶颈.

2009年Weber等[17]提出了“共基质”的概念, 他们认为在有机电子供体和无机电子供体共存的反硝化体系中, 有机电子供体作为“第一基质”为反硝化菌生长提供碳源及能源, 亚铁盐作为“第二基质”为反硝化菌生长提供能源.多数研究表明, 添加有机物可促进铁盐脱氮微生物的活性. Straub等[4]发现添加乙酸盐(≤1 mmol ·L-1)可使Acidovorax sp. strain BrG1的亚铁转化速率提升4倍;添加0.5~1.0 mmol ·L-1乙酸盐可使Acidovorax sp. strain 2AN长效、连续进行铁盐反硝化, 且其表面的铁壳包被状况明显减弱[18].也有研究表明, 异养反硝化混培物可同时进行Fe(Ⅱ)氧化[13].截止目前, 已分离获得多株基于亚铁盐的反硝化菌, 它们中的大多数是混合营养型细菌, 需要有机物(例如乙酸盐等)作为共基质实现连续的铁盐反硝化[19, 20].本文拟在共基质模式下(即添加少量乙酸盐为有机电子供体的铁盐脱氮体系)考察铁盐脱氮反应器的运行效能和反应器中颗粒污泥的组成特性、结构特性和生物活性, 揭示共基质模式维持铁盐脱氮高效能的机制, 以期为铁盐脱氮技术的发展提供理论依据, 并为城市污水处理方法提供新思路.

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 接种污泥

接种污泥采用反硝化优势菌源HDS, 该菌源由异养反硝化菌(80%), 自养反硝化菌和混合营养型反硝化菌以及不具备反硝化功能的杂菌组成[15].污泥的SS为27.82 g ·L-1, VSS为16.4 g ·L-1.

1.1.2 模拟废水

本实验采用模拟含氮废水, 根据微生物生长代谢所需, 将实验废水成分分为大量营养素和微量营养素, 其中大量营养素:NaNO3, 0.425 g ·L-1;FeSO4 ·7H2 O, 3.475 g ·L-1;NaHCO3, 2.5 g ·L-1;KH2PO4, 0.25 g ·L-1; CaCl2 ·2H2 O, 0.01 g ·L-1;MgSO4 ·7H2 O, 0.5 g ·L-1;CH3COONa, 0.05 g ·L-1;(NH4)2SO4, 0.28 g ·L-1.微量元素:EDTA, 3.000 mg ·L-1;NiCl3 ·6H2 O, 0.024 mg ·L-1;CuCl2 ·2H2 O, 0.010 mg ·L-1;H3BO3, 0.010 mg ·L-1;MnCl2 ·2H2 O, 0.500 mg ·L-1;CoCl2 ·6H2 O, 0.190 mg ·L-1;Na2MoO4 ·2H2 O, 0.036 mg ·L-1;ZnCl2, 0.070 mg ·L-1.其中, NaNO3、FeSO4 ·7H2 O、CH3COONa以及NaHCO3分别作为氮源(电子受体), 能源(电子供体)和有机碳源(有机电子供体)和无机碳源按需添加, 其中(总碳)C/N值为6.07, NaNO3、FeSO4 ·7H2 O以及CH3COONa的摩尔比例为8:12:1.采用1 mol ·L-1 HCl和1 mol ·L-1 NaOH调节实验废水pH, 使其最终稳定在6.6±0.1.

1.1.3 反应装置

采用上流式厌氧污泥床(Up-flow anaerobic sludge blanket, UASB)装置作为共培养模式铁盐脱氮反应器, 反应器内径65 mm, 总高700 mm, 总体积3 L, 有效体积1.2 L.污泥接种量为800 mL.反应器每日进水量为12 L, 水力停留时间(HRT)为6 h, 进水pH设定在6.6±0.1.进水硝氮浓度设定为70 mg ·L-1, 进水亚铁浓度设定为700 mg ·L-1, 低于微生物半抑制亚铁浓度229 259.387 mg ·L-1[16], 硝氮容积负荷(以N计)为0.7 kg ·(m3 ·d)-1, 亚铁容积负荷(以Fe计)为7.0 kg ·(m3 ·d)-1.

1.2 方法 1.2.1 污泥形貌

采用透射电镜(TEM)对污泥形貌进行观察.样品制备过程如下:用2.5%的戊二醛溶液将样品固定, 于4℃冰箱中放置过夜;倒掉固定液, 经0.1 mol ·L-1 pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液漂洗3次后, 用1%的锇酸固定样品2 h; 取出锇酸废液, 用0.1 mol ·L-1 pH 7.0的磷酸盐缓冲液漂洗3次;用梯度体积分数(30%、50%、70%、80%、90%和95%)乙醇溶液对样品进行脱水处理, 每次15 min;使用100%乙醇处理1次, 20 min;用纯丙酮处理1次, 20 min;用包埋剂处理样品, 70℃加热过夜;样品于LEICAEMUC7超薄切片机中切片, 获得70~90 nm超薄切片, 经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色10 min, 即可在透射电镜(Gtontorn, USA)下观察.

1.2.2 活/死细胞检测

取适量颗粒污泥, 溶于0.85% NaCl溶液, 用细胞超声破碎仪破碎颗粒污泥, 获得悬浮菌液.避光条件下, 利用活/死细胞荧光鉴定试剂盒(Molecular Probes, USA)对菌悬液进行荧光染色10 min, 接种环挑取适量菌悬液进行涂片, 于荧光显微镜下观察细胞活死状态, 利用Image-pro Plus 6.0软件对视野中活/死细胞个数进行统计, 计算得出活细胞占总细胞个数的比例[21].

1.2.3 生物量测定

取铁盐脱氮颗粒污泥, 用滤纸吸干其表面水分, 质量记为M1, 105℃烘至恒重, 质量记为M2;将烘干的颗粒污泥置于600℃马弗炉中灰化, 质量记为m, 挥发性悬浮固体颗粒(volatile suspended solids, VSS, 以湿泥计)[22]的计算公式如下:

(1)
1.2.4 比活性测定

采用批次实验测定颗粒污泥的比反硝化、比铁氧化活性.取10 mL模拟废水于40 mL血清瓶中.加入一定质量(m)沥干颗粒污泥, 氮气驱氧10 min, 加入七水硫酸亚铁, 将血清瓶封口并用铝盖加固.血清瓶置于摇床上培养, 120 r ·min-1, 30℃.每组实验设置2个平行, 定时取上清液测定硝氮、亚铁含量[23].

比活性计算公式如下:

(2)

式中, RA指颗粒污泥比活性(以N或Fe/VSS计), mg ·(g ·L ·h)-1ctt时刻指标浓度(mg ·L-1);c0指0时刻指标浓度(mg ·L-1);m指添加颗粒污泥质量(g);VSS(%)指挥发性固体颗粒物占总颗粒污泥(湿基)的质量分数;t指培养时间(h).

1.2.5 测定项目与方法

硝氮(NO3--N):紫外分光光度法;亚铁:1, 10-邻菲啰啉分光光度法;pH:pHS- 9V型酸度计;TS和VSS:重量法.

2 结果与讨论 2.1 反应器运行效能的变化

对1.1.3节所述的反应器进行了运行实验.整个实验为期70 d, 期间反应器内温度为(30±2)℃, 进水pH为6.6±0.1, 反应器容积负荷和去除负荷随时间的变化如图 1所示.根据反应器的脱氮效能, 可将运行过程分为3个阶段:

图 1 反应器运行效能 Fig. 1 Performance of the reactor

阶段一(0 d之前)为反应器试运行阶段.根据电子守恒定律, 设定该阶段中反应器进水硝酸钠、七水合硫酸亚铁及无水乙酸钠的摩尔比例为8:32:1.结果表明, 阶段一中平均硝氮去除率达79%, 平均硝氮去除负荷为0.58 kg ·(m3 ·d)-1, 平均亚铁去除率达28.1%, 平均亚铁去除负荷为2.76 kg ·(m3 ·d)-1.该阶段反应器进水中的乙酸钠被亚铁盐替代, 反应器效能波动较大.

阶段二(第0~8 d)为反应器调整阶段.试运行阶段发现反应器对硝氮的去除率远远大于对亚铁的去除率, 大量的亚铁未被使用就被排出反应器, 说明进水中亚铁过量.同时, 进水中过量的亚铁将造成模拟废水盐度的提高, 高盐度通常会抑制酶的活性, 还可引起细胞质溶解[24].为降低进水盐度, 节约废水处理成本, 本阶段中反应器进水的硝酸钠、七水合硫酸亚铁及无水乙酸钠的摩尔比例降为8:20:1.结果表明, 阶段二中平均硝氮去除率达98%, 硝氮出水浓度低于3 mg ·L-1, 满足城镇污水一级排放标准, 平均硝氮去除负荷达0.74 kg ·(m3 ·d)-1, 平均亚铁去除负荷达2.55 kg ·(m3 ·d)-1.该阶段中反应器脱氮效能达到最佳.

阶段三(第9~50 d)为反应器稳定运行阶段.该阶段中, 第11~15 d期间由于进水管堵塞导致反应器脱氮效能失稳, 除此之外反应器运行效能平稳, 平均出水硝氮浓度维持在22.59 mg ·L-1左右, 硝氮去除率维持在67%左右, 平均硝氮去除负荷维持在0.51 kg ·(m3 ·d)-1左右;平均出水亚铁浓度维持在66.36 mg ·L-1左右, 平均亚铁去除率维持在87%左右, 亚铁去除负荷维持在4.65 kg ·(m3 ·d)-1左右.该阶段中, 反应器效能稳定.

整个反应器运行期间, 出水pH均稳定在6.5±0.2范围内, 平均出水Fe/N比为2.28:1.当反应器脱氮效能降低时, 反应器出水中检测到亚硝酸盐.前期研究结果表明, 同样运行条件下, 不添加有机物时整个运行周期内并未在反应器出水中检测到亚硝酸盐.亚硝酸盐的产生一般被认为是由反硝化过程电子供体不足造成的.反硝化过程分为4步, 依次为硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、一氧化氮还原及一氧化二氮还原.在反硝化体系中, 醌池提供的电子优先还原硝酸盐, 只有在硝酸盐大部分被还原为亚硝酸盐之后, 醌池提供的电子才会顺延给亚硝酸盐还原[25~27].

综上, 适当添加有机物将有助于铁盐脱氮反应的进行.前期的研究结果表明, 同样条件下, 进水不添加有机物时, 铁盐脱氮反应器效能最高达0.7 kg ·(m3 ·d)-1, 但18 d后反应器效能开始退化, 最终反应器脱氮效能稳定在0.22 kg ·(m3 ·d)-1.本实验中, 进水添加适量有机物可使铁盐脱氮反应器的脱氮效能成功维持在0.51 kg ·(m3 ·d)-1达30 d之久.至于添加有机物能够稳定提升铁盐脱氮效能的机制, 还有待进一步探究.

2.2 共培养模式下铁盐脱氮污泥特性

为揭示共基质模式下的铁盐脱氮机制, 对比研究添加有机物前后铁盐脱氮污泥特性, 于反应器启动后的第1、7、19、26和42 d, 分别从反应器底部取出适量污泥, 对污泥的活性生物量、菌群组成及比活性等特性进行了研究.根据取样时间的不同, 对样品依次编号为1、2、3、4和5.

2.2.1 菌群组成

采用高通量测序技术对不同取样时间的样品中优势微生物菌群进行了分析.各样品中的优势菌分析如下.从物种门水平上分析, 如图 2(a)所示, 5个样品中占比最大的是Proteobacteria(变形菌门), 均占比50%以上, 且随反应器运行时间的延长, 变形菌门在污泥中的占比逐渐增大.比如, 样品1中Proteobacteria(变形菌门)占比仅为54.38%, 而样品5中Proteobacteria(变形菌门)占比增大到65.70%.随反应器运行时间的延长, 占比同样增大的还有Acidobacteria(酸杆菌门), 样品1中占比几乎为零, 但样品5中占比为7.73%.与此相反, Firmicutes(厚壁菌门)和Actinobacteria(放线菌门)在各样本中占比呈递减趋势, 样品1中Firmicutes(厚壁菌门)和Actinobacteria(放线菌门)的占比依次为23.35%和12.27%, 而Firmicutes(厚壁菌门)和Actinobacteria(放线菌门)在样品5的占比依次为16.55%和1.25%.

图 2 颗粒污泥菌群组成 Fig. 2 Microbial community in granular sludge

就物种属水平上而言, 如图 2(b)所示, 样品1~5中优势属为Castellaniella(卡斯特兰尼氏菌属)、Clostridium_sensu_stricto_7、Comamonas(丛毛单胞菌属)、Clostridium_sensu_stricto_10、Thermomonas(热单胞菌属)及Rhodanobacter.其中Castellaniella(卡斯特兰尼氏菌属)、Comamonas(丛毛单胞菌属)和Thermomonas(热单胞菌属)均属于Proteobacteria(变形菌门), 且均为异养反硝化菌[28~30]. Clostridium_sensu_stricto_7和Clostridium_sensu_stricto_10均属于Firmicutes(厚壁菌门)Clostridium(梭状菌纲), 也具有异养反硝化功能[31~32].从图 2不难发现, 随着反应器运行时间的延长, 样品中Comamonas(丛毛单胞菌属)、Thermomonas(热单胞菌属)和Rhodanobacte占比逐渐增加, 而Castellaniella(卡斯特兰尼氏菌属)、Clostridium_sensu_stricto_7和Clostridium_sensu_stricto_10的占比却逐渐减小.研究表明Comamonas(丛毛单胞菌属)可利用无机物作为自己的碳源和能源进行生长繁殖[29]Thermomonas(热单胞菌属)是兼性异养菌, 可在缺氧条件下以硝酸盐作为电子受体进行电子传递[33~34]Rhodanobacter是一种可进行自养反硝化的反硝化菌[35~36].而Castellaniella(卡斯特兰尼氏菌属)、Clostridium_sensu_stricto_7和Clostridium_sensu_stricto_10均为异养菌, 有机营养不足便导致Clostridium_sensu_stricto_7和Clostridium_sensu_stricto_10的减少, 同时兼养性微生物逐步成为优势菌, 正因为如此, Proteobacteria(变形菌门)占比才逐渐增大.

综上所述, 共基质模式下异养菌一直作为优势属存在于铁盐脱氮反应器内, 但其占比随反应器运行时间的延续而略微减少, 同时兼养菌的占比增加.而在单基质模式下铁盐脱氮反应器中, 仅在运行前期检测到异养菌的存在, 运行后期几乎检测不到异养菌.

2.2.2 活性生物量

活性污泥的组成主要包括水分, 微生物及微生物表面的附着物质, 其中微生物及微生物表面吸附物质可用SS含量表征, 微生物可用VSS含量表征[22].采用重量法测定了5个样品中SS和VSS含量, 结果见表 1.随着反应器运行时间的延长, 样品中的SS含量逐渐上升, VSS含量逐渐下降, VSS/SS值逐渐减少.

表 1 颗粒污泥的组成成分 Table 1 Components of granular sludge

以时间为横坐标, VSS含量为纵坐标绘图, 对数据进行线性拟合, 获得共基质模式下铁盐脱氮活性污泥VSS随时间的衰减系数(为0.001), 高于单基质模式下铁盐脱氮污泥VSS随时间的衰减系数(0.000 7).

采用Live/Dead Baclight试剂盒, 对样品1~5的活细胞和死细胞进行了染色, 并于荧光显微镜下进行了观察, 视野中绿色荧光为活细胞, 红色荧光为死细胞, 结果如图 3所示.随反应器运行时间的延长, 样品1~5中的活细胞比例逐渐降低, 死细胞比例逐渐增加.采用Image-Pro plus 6.0对图中的活细胞和死细胞进行个数统计, 结果见表 2.反应器正式运行的污泥(即样品1)中的活细胞比例最高, 为78.2%, 此后, 颗粒污泥中的活细胞比例逐渐下降到40.3%.

图 3 颗粒污泥中活/死细胞荧光显微图 Fig. 3 Micrographs of live and dead bacteria in granular sludge

表 2 颗粒污泥中活/死细胞比例 Table 2 Percentages of live cells and dead cells in granular sludge 2

同上, 对随时间变化的活细胞比例值进行线性拟合, 获得共基质模式下铁盐脱氮活性污泥中活细胞比例随时间的衰减系数, 为0.862 7, 低于单基质模式下铁盐脱氮污泥中活细胞比例随时间的衰减系数(1.094 9).

2.2.3 污泥比活性

采用批次实验, 测定了颗粒污泥的比FeNiR活性, 结果如图 4所示.随反应器运行时间的延续, 样品1~5的比FeNiR活性呈先下降后平稳的趋势.接种污泥(即样品1)的比反硝化活性为1.71 mg ·(g ·L ·h)-1, 比铁氧化活性为6.19 mg ·(g ·L ·h)-1;反应器运行后期污泥(即样品5)的比反硝化活性为0.73 mg ·(g ·L ·h)-1, 同比下降88.2%, 比铁氧化活性为6.37 mg ·(g ·L ·h)-1, 基本没有变化.

图 4 颗粒污泥相对比活性 Fig. 4 Relative specific activity of granular sludge

图 4中可知铁盐脱氮污泥的比反硝化活性并非随时间变化呈现线性下降趋势, 即污泥的比反硝化活性并非是零级衰减.故而不能简单地对数据进行线性拟合求衰减系数.但通过后3次数据对比发现, 污泥的比反硝化活性趋于稳定与反应器层面脱氮效能趋于稳定呈现出相关性.

2.3 共基质模式对铁盐脱氮效能的提升机制

共基质模式下, 反应器的铁盐脱氮效能显著提升.与笔者先前不添加有机物的单基质模式相比, 共基质模式下的最佳铁盐脱氮活性提升了4倍, 效能稳定期的铁盐脱氮活性提升了7.3倍, 说明共基质模式可实现铁盐脱氮的高效性.整个运行期间, 共基质模式下铁盐脱氮反应器的铁氧化活性维持在较高水平, 而单基质模式下铁盐脱氮反应器的铁氧化活性呈持续下降趋势, 说明共基质模式下Fe(Ⅱ)的氧化机制不同于单基质模式下Fe(Ⅱ)的氧化机制, 这一点将在后续作进一步分析.

共基质模式下反应器的铁盐脱氮效能最终稳定在0.51 kg ·(m3 ·d)-1左右, 污泥的比FeNiR活性稳定在0.73 mg ·(g ·L ·h)-1左右.单基质模式下铁盐脱氮反应器中细胞的衰亡系数为1.094 9, 而共基质模式下铁盐脱氮细胞的衰亡系数为0.8629, 说明共基质模式能够降低铁盐脱氮微生物的衰亡率, 进而维持铁盐脱氮的高效能.有研究[4, 17]发现, 在贫有机物环境中一些有机营养型微生物可利用Fe(Ⅱ)作为能源进行混合营养代谢, 有限的有机碳源被用于微生物的生长.从上文中微生物菌群分析结果来看, 即便在运行后期, 反应器中仍旧存在异养菌.共基质模式下, 兼养菌与异养菌共存, 增加了反硝化途径的多样性, 从而维持了脱氮高效能.

采用透射电镜(TEM)观察了样品1~5中微生物细胞的内部结构, 结果如图 5所示.在共基质模式下部分铁盐脱氮微生物表面仍旧形成“铁壳”, 这与单基质模式下观察到的微生物形貌一致, 说明添加少量有机物后并不能完全阻止所有铁盐脱氮微生物表面生成“铁壳”.在反应器运行初期, 发现未结壳活细胞成堆聚集, 且其周围可观察到一层“屏障”如图 5(a)5(b)内白色虚线所示, 该“屏障”将结壳细胞与未结壳细胞明显分区.微生物细胞可分泌多糖、蛋白等物质至胞外, 形成胞外聚合物(EPS), 且能够形成大量EPS的细胞多为营养充足的异养微生物细胞[37].故而笔者推测该“屏障”是异养反硝化菌分泌的EPS.当体系中存在有机物时, 异养反硝化菌大量摄食, 产生EPS分泌至胞外. EPS具有黏性, 对Fe(Ⅱ)具有强吸附性[38], 溶液中的溶解性Fe(Ⅱ)无法穿透EPS进入细胞参与反硝化反应, 故而图 5(a)5(b)中聚集的异养反硝化菌周围不形成铁壳.但随着反应时间的延长, 异养菌大量增殖, 而所提供的有机物有限, 异养菌的反硝化过程受限, 有限的有机电子供体只能够提供硝酸盐还原成亚硝酸盐, 致使反应器出水中检出亚硝酸盐.有限的有机物供给也致使异养微生物的摄食不足, 异养微生物无法产生EPS供细胞黏合使用, 聚集的异养微生物群解散, 从图 5(c)~5(e)可知, 反应器运行后期大量结壳细胞内部已为空腔, 基本判断其为死细胞, 但视野中仍见少量周围未附着“铁壳”的活细胞, 根据反应器稳定时Fe(Ⅱ)和硝酸盐的去除效能判断这类细胞应兼具铁氧化和反硝化功能, 结合高通量测序结果(图 3)未形成“铁壳”的铁盐脱氮微生物是异养菌, 且是反应器稳定运行期间保持较高效能的“主力军”.

图 5 TEM下颗粒污泥中细胞形貌特征 Fig. 5 Morphologies of cells by TEM

Moraghan等[39]几十年前发现了亚硝酸盐对Fe(Ⅱ)的化学氧化作用, 并且从动力学角度证实亚硝酸盐和Fe(Ⅱ)的化学反应非常快.近年来, 有研究表明由微生物介导的硝酸盐型铁氧化是由生物反应和化学反应耦合而成的[40, 41].亚硝氮与Fe(Ⅱ)的化学反应发生在周质空间, 该反应只从反硝化过程的上游获取质子, 并不获取电子, 这就使得流向硝酸盐还原酶的电子结余, 从而更多的硝酸盐在硝酸盐还原酶上被还原, 同时产生大量的亚硝酸盐[42].如果此时周质空间存在Fe(Ⅱ), 那么亚硝酸盐将与Fe(Ⅱ)反应, 生成的Fe(Ⅲ)将以沉积物的形式堆积在细胞周质空间, 形成铁壳.但在本研究中, 由于进水添加有机物, 反应器里的异养菌会产生EPS, 将亚铁阻挡在细胞之外, 因有机电子供体不足导致异养反硝化产生的亚硝酸氮积累[43], 积累的亚硝酸盐与Fe(Ⅱ)相遇, 发生化学反应, 生成气态氮化物, 实现废水脱氮, 异养反硝化菌对硝酸盐还原与Fe(Ⅱ)氧化的概念代谢途径如图 6所示.综上所述, 共基质模式下的未结壳细胞是以少量有机物作为电子供体进行硝酸盐还原的, 产生的亚硝酸盐外排至胞外, 并与可溶性Fe(Ⅱ)发生化学反应, 进而实现水体脱氮的目的.共基质模式为高效铁盐脱氮工艺的研发提供了一种新的思路及可能.

图 6 未结壳细胞的硝酸盐还原和铁氧化机制模型 Fig. 6 Mechanism model of nitrate reduction and iron oxidation in uncrusted cells

3 结论

(1) 共基质模式培养可实现铁盐脱氮技术的高效、稳定.本实验条件下, 铁盐脱氮反应器的脱氮效能可维持在0.51 kg ·(m3 ·d)-1达30 d之久.

(2) 与单基质模式相比, 共基质模式下的颗粒污泥中活性生物量、细胞存活率以及比FeNiR活性都显著提高, 这与异养菌的高效存活能力息息相关.

(3) 异养反硝化菌是共基质模式下铁盐脱氮反应器中脱氮主力军.异养反硝化菌以其独特的铁盐代谢机制导致不生成铁壳是维持铁盐脱氮高效能的关键.在有限有机物供给下, 电子优先提供给硝酸盐还原为亚硝酸盐, 产生的亚硝酸盐被微生物排出体外, 亚硝酸盐与环境中的亚铁反应, 实现水体中硝氮的去除, 同时避免微生物表面产生铁壳.

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