入海河流污染是导致近海海域水环境问题的重要原因^[1], 其中总氮及总磷含量约占总入海通量的39.8%^[2], 导致水体富营养化, 引发赤潮灾害. 2018年中国海洋生态环境状况公报显示无机氮及磷酸盐类物质是影响河口区及近岸海域水质变化的重要因素, 海水富营养化面积达5.67万km^2[3].坚持陆海统筹, 需强化入海河流氮、磷等污染物质的去除, 减缓近岸局部海域污染.

植物不仅具有景观美化效果, 还可通过根系直接吸收利用氮磷等营养物质^[4], 对水体富营养化有抑制与修复作用^[5].但是, 频繁波动的淹水环境、海水入侵、地下水位较高等因素导致河口区水体盐碱浓度高、波动范围大, 盐度高时达20‰以上, pH值高达9, 植物生长困难, 净化水体效果差.盐与碱共同胁迫引起植物细胞离子失衡, 极易产生高渗透胁迫, 迅速伤害植物^[6].耐盐碱植物通过调节体内无机离子含量如Na⁺和K⁺, 或分泌脯氨酸(proline, Pro)、甜菜碱(betaine, Bet)和可溶性糖(soluble sugar, SS)等小分子有机物进行渗透调节, 响应盐碱胁迫^[7].但盐生植物的渗透调节功能存在极限, 耐盐碱能力有限.因此, 提高植物抵抗渗透胁迫的能力是解决盐碱限制植物生长和提高植物净化效果的关键.

目前研究报道显示, 外源Ca²⁺与K⁺可提高作物耐盐碱能力, 增加产量^[8].对植物根施或叶面喷施Ca²⁺, 可缓解植物受到的渗透伤害、离子毒害和氧化胁迫, 提高Ca²⁺的可利用性, 促进Ca²⁺的运输和向植物生长区域的迁移^[9], 提升作物存活率；外源Ca²⁺, 如脱硫石膏可使盐碱土壤Ca²⁺与Na⁺离子交换, 达到脱盐效果^[10], 通过提高保护酶活性、叶片净光合速率、增加Pro含量等途径提高作物的耐盐碱能力, 增加作物生产力^{[11, 12]}；此外, 施用K⁺肥可降低Na⁺/K⁺, 缓解环境中高NaCl浓度引起的植物缺钾症, 同时提高作物对盐胁迫的耐受性^{[13, 14]}.外源K⁺能够增加Pro和糖等渗透物质的积累, 提高作物对氮的吸收和同化, 缓解作物受到的盐碱胁迫^[15].同时, 补充钙和钾能够提高番茄对碱度、盐度的耐受性, 维持叶绿素水平, 缓解氧化胁迫^[16].但是有关提高盐生植物耐盐碱能力的化学调控机制研究较少, 而且外源Ca²⁺与K⁺是否可提高盐生植物的渗透调节能力, 影响机制如何等相关研究还不清晰.

本研究选择滨海河口地区常见的盐生植物碱蓬(Suaeda salsa, S. salsa)作为供试植物.采用水培实验方法, 添加适量Ca²⁺和K⁺, 测定并分析碱蓬对水体中总氮(TN)、总磷(TP)的去除效果, 及叶片、根系中无机离子和有机溶质的含量和分布特征, 探索Ca²⁺和K⁺对碱蓬净水效果的影响和耐盐碱能力提高的机制.主要达到以下3个目的:①盐碱胁迫下碱蓬生长得到缓解的最优Ca²⁺和K⁺浓度；②外源Ca²⁺和K⁺促进碱蓬净化水中氮磷的效果；③外源Ca²⁺和K⁺对碱蓬叶片及根系无机渗透调节与有机渗透调节的影响机制.研究结果为提高植物耐盐碱能力提供有效途径, 以期为植物净化滨海河口区盐碱水体, 降低富营养化风险奠定理论基础.

1 材料与方法 1.1 供试植物

碱蓬:藜科, 叶肉质化真盐生植物, 分布于我国各地的沿海滩涂、盐碱地等区域.碱蓬具有重要的生态功能及药用价值, 大面积播种可在每年5、6月形成红色景观效果.本实验选用的碱蓬采自青岛市李村河河口区.

1.2 实验方法 1.2.1 实验设计与方法

(1) 盐碱胁迫预实验

采用水培实验, 水培溶液营养盐组分浓度参考青岛市李村河河口区水质(表 1). NaCl调整水体盐度分别为0‰、6‰、12‰、18‰、24‰和30‰, NaHCO₃调整水体pH值为8, 共计6个实验组, 每组3个重复, 另设一组盐度为0‰和pH值为7的空白对照组.

本实验容器高20 cm, 上口直径10 cm, 水体体积1 L.将长势一致的植物随机分配到每个实验组中, 每个容器种植4~5株, 株高(30±2)cm, 鲜重(7.0±0.2)g, 种植密度50株·m^-2.每天用蒸馏水补充蒸发的水分, 温度(24±2)℃, 自然光照, 实验周期15 d.

(2) 外源Ca²⁺与K⁺促进碱蓬生长及氮磷去除的实验

采用水培实验, 盐碱胁迫条件为预实验中最佳耐受盐碱度, CaCl₂和KCl调节水培溶液中Ca²⁺和K⁺浓度均为0、2、4、6、8、10、15和20mmol ·L^-1.设Ca²⁺、K⁺浓度均为2 mmol ·L^-1的处理组为对照组(CK), Ca²⁺、K⁺浓度均为0 mmol ·L^-1的处理组为空白对照组. TN与TP浓度设置、实验装置、实验周期与实验条件均与预实验一致, 实验结束测定TN和TP浓度.

1.2.2 指标测定方法

对于水体, 监测实验前后水中TN和TP的浓度变化, 并计算单位时间、单位质量植物对水体中氮和磷的去除量.总氮采用紫外分光光度法测定, 总磷采用钼酸铵分光光度法测定^[17].

对于植物, 实验后测定植物的鲜重、干重、新增叶片数等生长指标, 并选取各组植物的相同部位测定生理指标.植物无机离子K⁺和Na⁺含量采用离子色谱法测定；Pro含量采用酸性茚三酮比色法测定；SS含量采用蒽酮比色法测定；Bet含量采用雷氏盐比色法测定^[18]；丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定^[19]；叶绿素含量采用乙醇提取法测定^[20]；根系活力采用氯化三苯基四氮唑法测定^[21]；叶片含水量采用烘干称重法测定^[21].

1.2.3 数据处理与分析方法

相对生长速率(RGR)参考公式(1)计算.

(1)

式中, W₁为初始时刻t₁(d)植物干重(g)；W₂为结束时刻t₂(d)植物干重(g).

数据处理采用画图软件Origin8.0和统计软件SPSS 16.0.双因素方差分析比较各项测试指标在实验条件下的显著性差异, 显著性水平P＜0.05.

2 结果与讨论 2.1 盐碱胁迫对植物的抑制作用

通过植物的生长和各项生理指标变化可表征植物的耐盐碱(pH=8, 不同盐度)极限(表 2).

盐度的升高显著降低了RGR, 与空白对照组相比, 盐度为6‰时RGR无显著差异, 盐度12‰时显著降低14.8%, 盐度18%时降幅达43.1%.盐度高于18‰的胁迫同时显著降低了碱蓬的含水量、叶绿素含量和根系活力, 表明盐碱胁迫对碱蓬的持水能力, 光合作用及根系代谢等生理过程产生严重的抑制作用, 碱蓬生长状况急剧变差.

MDA含量随盐度的升高而升高, 盐度高于18‰时, 比空白对照组高160%以上, 表明此时碱蓬体内产生大量的活性氧等强氧化性物质, 受到严重的氧化伤害.可见, 碱蓬能够短时耐受pH 8、盐度为18‰的盐碱胁迫, 高于此盐碱度会对碱蓬的生长生理过程产生显著破坏.鉴于滨海河口区水体盐度高达20‰, 本研究选取盐度20‰与pH 8的胁迫条件进行外源Ca²⁺和K⁺影响碱蓬渗透调节作用机制的研究.

2.2 外源Ca²⁺与K⁺提高碱蓬净化氮磷能力

盐碱胁迫下, 外源Ca²⁺与K⁺均能显著提高碱蓬对TN和TP的去除效果(图 1), 在外源Ca²⁺和K⁺浓度分别为8 mmol ·L^-1及10 mmol ·L^-1时, TN和TP的去除效率均最高, 其中对TN的去除, 与CK相比, Ca²⁺和K⁺作用分别提高1.53和1.57倍, 对TP, Ca²⁺和K⁺作用分别提高1.87和1.80倍.有研究表明, 氮磷的积累能力与生长量具有很好的相关性, 植物对氮磷利用率增高与植物生长能力提高有关^[22].

但是, Ca²⁺和K⁺浓度分别高于8 mmol ·L^-1和10 mmol ·L^-1时, 氮、磷的去除效率显著降低, 说明过量的Ca²⁺和K⁺对碱蓬形成新的离子胁迫, 抑制碱蓬对氮磷的吸收利用.正如李德燕^[23]对钙影响马尾松生理生化特性的研究, 发现过量的钙导致马尾松对光能的吸收利用率降低, 光合能力降低；同样, 过量外源钙导致茶苗细胞结构损伤, 生长阻滞^[24].

那么, 外源Ca²⁺和K⁺作用下, 碱蓬生长能力得到提高, 在生长促进和生理缓解等代谢过程中的作用机制体现在以下方面.

2.3 外源Ca²⁺与K⁺对碱蓬生长的促进作用

生长指标能直观地反映盐碱胁迫下Ca²⁺与K⁺对碱蓬的缓解作用. RGR随Ca²⁺和K⁺浓度的增加先升高后降低, Ca²⁺与K⁺浓度在4~15 mmol ·L^-1范围内, 显著缓解了盐碱胁迫对碱蓬生长的抑制作用, Ca²⁺的缓解作用强于同浓度下的K⁺(表 3). Ca²⁺和K⁺浓度分别为8 mmol ·L^-1和10 mmol ·L^-1时RGR达最大, 为对照组(CK)的2.4倍和2.0倍, 与预实验中6‰和12‰~18‰盐胁迫下植株RGR水平持平.结果表明外源离子缓解作用下, 碱蓬生长阻碍变小, 细胞分裂和增长等代谢过程对氮素和磷素的需求变高, 导致碱蓬对氮磷的吸收利用率变高, 生长状态变好.但是, 当Ca²⁺和K⁺浓度达20 mmol ·L^-1时, RGR比CK组低14.1%和11.8%, 说明Ca²⁺和K⁺过量对碱蓬的生长产生抑制作用；空白对照组RGR比CK组低54.1%和44.7%, 说明Ca²⁺或K⁺缺失严重阻碍碱蓬的生长.

植物RGR的提高可表现为株高增加或新叶片数增加. Ca²⁺与K⁺浓度在4~15 mmol ·L^-1范围内均促进碱蓬生出新叶片, 新增叶片数的变化趋势与RGR一致(表 3).而株高仅在Ca²⁺与K⁺浓度为4~10 mmol ·L^-1范围内有促进作用, 表明外源离子促进碱蓬生长的机制主要体现为新叶片数的增加.

3 外源Ca²⁺与K⁺影响碱蓬渗透调节的生理机制 3.1 无机渗透调节 3.1.1 影响效果

Ca²⁺与K⁺对碱蓬叶片与根系中Na⁺、K⁺含量与Na⁺/K⁺的影响见图 2.外源Ca²⁺和K⁺在4~20 mmol ·L^-1范围内降低碱蓬叶片与根系中的Na⁺含量, 叶片中最大降幅分别为10.4%和8.4%, 根系中最大降幅分别为15.3%和3.3%, 即外源Ca²⁺对根系Na⁺含量的影响大于叶片, 而外源K⁺对根系Na⁺含量的影响小于叶片[图 2(a)和图 2(b)].

随外源Ca²⁺和K⁺浓度的增加, 叶片与根系中的K⁺含量先升高后降低, 叶片中K⁺含量的最大增幅分别为69.5%和51.4%, 根系中K⁺含量比叶片少, 最大增幅分别为98.4%和24.1%, 说明外源Ca²⁺对碱蓬K⁺积累的作用强于外源K⁺, 且外源Ca²⁺对根系中K⁺含量的影响比叶片大[图 2(c)和图 2(d)].

随外源Ca²⁺和K⁺浓度增加, 叶片与根系中Na⁺/K⁺先降低后升高, 叶片中Na⁺/K⁺最大降幅分别为47.1%与40.8%, 根系中最大降幅分别为57.3%与31.9%.外源Ca²⁺和K⁺浓度在4~20 mmol ·L^-1时叶片与根系中Na⁺/K⁺均比CK组低. Ca²⁺和K⁺缺失时, Na⁺/K⁺显著升高[图 2(e)和图 2(f)].

3.1.2 无机渗透调节的影响机制

在高盐环境中, 大多数植物的初始响应是增加细胞内的离子含量, 直到达渗透平衡^{[25, 26]}.高浓度的Na⁺产生离子毒害, 与K⁺有竞争性抑制, 阻碍植物对K⁺的吸收^[27].外源Ca²⁺和K⁺在4~15 mmol ·L^-1范围内促进碱蓬叶片对K⁺吸收, 说明外源Ca²⁺和K⁺能够抑制Na⁺向上运输, 减缓Na⁺对叶片的毒害作用, 同时促进根系对Na⁺的外排.叶片Na⁺总量没有显著降低, 可能与碱蓬叶片能够通过离子区室化作用将Na⁺隔离到液泡中有关^{[28, 29]}.储存在液泡中的Na⁺会提高细胞膨压, 降低水势, 有利于植物根系吸收水分抵抗渗透胁迫^[30].因此本研究推测外源Ca²⁺和K⁺影响碱蓬无机渗透调节的机制可能与无机离子含量及植株含水量有关.

外源Ca²⁺和K⁺浓度为4~15 mmol ·L^-1时, 碱蓬叶片和根系中的含水量较CK组高(表 4), 分别在8 mmol ·L^-1与10 mmol ·L^-1时达最大, 根系含水量低于叶片, 缺Ca²⁺和K⁺时叶片与根系中的含水量降幅均高于20.0%, 说明适宜浓度的Ca²⁺和K⁺能提高碱蓬叶片与根系的持水能力, 提高比例在24.6%~69.2%之间.对Na⁺与K⁺含量总和与含水量进行相关系分析(表 5), 碱蓬叶片和根系的含水量与无机离子的相关系数在0.968以上, 进一步说明外源Ca²⁺和K⁺作用下, 无机渗透调节作用机制为降低Na⁺/K⁺, 增强植物持水能力, 提高植物耐盐碱能力.

然而, 值得注意的是, Ca²⁺和K⁺浓度并不是越高越好, 浓度增加到20 mmol ·L^-1时, 离子稳态失衡, 导致碱蓬的各项生理代谢过程受到较大的抑制.在对外源Pro、精胺、亚精胺缓解盐胁迫的研究中也有类似的结果, 外源物质的浓度仅在一定范围内能缓解植物受到盐胁迫的伤害, 若超出该浓度, 会加剧对植物体的损伤^{[31, 32, 33]}.

3.2 有机渗透调节 3.2.1 影响效果

Ca²⁺和K⁺处理对碱蓬盐碱胁迫下叶片与根系中脯氨酸(Pro)、甜菜碱(Bet)与可溶性糖(SS)含量的影响见图 3.随着Ca²⁺和K⁺浓度的增加, 叶片与根系中的Pro含量先减少后增加, 浓度分别为8 mmol ·L^-1和10 mmol ·L^-1时达最小值, 叶片中Pro的最大降幅分别为42.5%和33.6%, 根系降幅相对较低, 且在Ca²⁺与K⁺浓度为8~15 mmol ·L^-1范围内, 根系中Pro的差异不显著[图 3(a)和图 3(b)].

Ca²⁺与K⁺浓度升高均能促进碱蓬体内Bet的积累, 叶片积累幅度较根系明显[图 3(c)和图 3(d)]. Ca²⁺浓度在8~15 mmol ·L^-1范围内叶片与根系中Bet含量均较高, 最高分别高于对照组35.0%和17.9%, 各组间无显著差异. K⁺浓度为10 mmol ·L^-1时叶片与根系中Bet含量均最高, 分别高于对照组28.0%和14.3%.

随外源Ca²⁺与K⁺浓度的增加, 叶片与根系中SS含量先增加后减少[图 3(e)和图 3(f)]. Ca²⁺浓度为6 mmol ·L^-1和K⁺浓度为8 mmol ·L^-1时, 碱蓬叶片与根系中SS含量最高, 叶片中最高分别比CK高43.3%和33.1%, 根系中分别高26.5%和25.4%.

由以上结果可知, 面对高盐碱胁迫, 外源Ca²⁺与K⁺促使碱蓬合成一些可溶性溶质作为调节剂来缓解盐碱伤害, 叶片中合成量更大.本文初步猜测这些可溶性小分子有机物通过对活性氧物质的解毒作用来保护碱蓬免受盐碱伤害.

3.2.2 有机渗透调节的影响机制

为明确外源Ca²⁺和K⁺对碱蓬有机渗透调节的缓解机制, 本文从以下两方面分别验证以上猜想.首先, 盐碱等逆境胁迫会破坏活性氧代谢平衡, 引起活性氧积累, 导致膜脂过氧化^{[34, 35]}, 产生MDA, 因此, MDA含量可直接鉴定植物体内膜脂分解状况.其次, 逆境中活性氧主要在细胞器中生成, Bet合成主要在叶绿体中, Pro合成主要在线粒体中^[36], 叶片光合作用指标叶绿素含量的高低与根系呼吸作用指标根系活力的强弱可间接证明有机渗透调节物质与膜脂过氧化的关系.

3.2.2.1 MDA

外源Ca²⁺和K⁺浓度在4~15 mmol ·L^-1范围内, 叶片与根系中的MDA含量均低于CK组(图 4).在Ca²⁺和K⁺浓度分别为8 mmol ·L^-1和10 mmol ·L^-1时, 叶片及根系中MDA含量最低, 叶片最大降幅为72.9%和61.7%, 根系中最大降幅为23.3%和13.2%.对碱蓬叶片与根系中小分子有机物与MDA之间的相关性分析可知(表 5), 小分子有机物与MDA相关性较强, 相关系数达0.966以上, 尤其Bet与MDA呈显著负相关, 相关系数达0.989以上, 说明外源Ca²⁺和K⁺缓解作用下碱蓬合成的小分子有机物对细胞膜有较强的保护作用.与本文观点类似, Amanifar等^[37]认为Bet等有机渗透调节物质不但能够降低细胞水势, 保护和稳定细胞内酶系统, 而且对维持细胞膜系统在逆境中的稳定性, 降低膜脂过氧化有重要作用；Nedjimi等^[38]认为外源Ca²⁺对盐胁迫下的植物膜透性有改善作用.因此, 盐碱胁迫下外源Ca²⁺与K⁺对碱蓬有机渗透调节作用的影响机制与降低细胞膜脂过氧化作用有关.

3.2.2.2 叶绿素与根系活力

外源Ca²⁺和K⁺能促进叶绿素的合成, 提高根系活力, 浓度过高则效果降低(图 5).在Ca²⁺和K⁺浓度分别为8 mmol ·L^-1和10 mmol ·L^-1时均有最佳促进效果, 其中叶绿素最高值分别为CK的2.0倍和1.3倍, 根系活力最高值分别为CK组的2.3倍和1.7倍.对碱蓬的叶绿素含量、根系活力与MDA进行相关性分析, 结果发现叶片中MDA和叶绿素呈显著负相关(相关系数0.939), 根系中MDA与根系活力显著负相关(相关系数0.882), 说明光合作用、根系活力与膜脂过氧化存在密切关系.有研究表明, 盐碱胁迫降低活性氧解毒酶的活性, 活性氧过量积累导致光化学损失, 使叶绿体蛋白下调, 光合作用受到影响^{[39, 40]}.本研究中适宜浓度外源Ca²⁺和K⁺对盐碱胁迫下碱蓬有机渗透调节的缓解作用机制为：促进合成有机渗透物质, 抑制活性氧的产生, 减缓膜脂过氧化, 最终通过叶绿素含量的增加与根系活力增强表现出来.

综上所述, 外源Ca²⁺和K⁺通过促进碱蓬生长, 提高碱蓬对氮磷的去除能力.盐碱胁迫下, 外源Ca²⁺和K⁺促进碱蓬生长的机制为提高相对生长速率, 增加新叶片数目；对碱蓬生理的影响机制表现在无机渗透调节与有机渗透调节两方面(图 6), 无机渗透调节中, Ca²⁺和K⁺主要通过促进水分吸收, 提高细胞含水量来缓解盐碱胁迫, 并将Na⁺隔离到液泡中降低盐碱伤害, 达到调节细胞内外渗透势、维持细胞内的离子稳态和减缓离子毒害作用.有机渗透调节中, Ca²⁺和K⁺主要通过分泌有机渗透调节物质, 缓解膜脂过氧化作用, 实现碱蓬叶片光合作用与根系呼吸作用的增强, 提高氮磷等物质的吸收利用, 最终降低水体富营养化风险.

4 结论

(1) 外源Ca²⁺和K⁺提高碱蓬对TN和TP的去除能力的适宜浓度范围为4~15 mmol ·L^-1；在外源Ca²⁺和K⁺浓度分别为8 mmol ·L^-1和10 mmol ·L^-1时, 碱蓬对TN和TP去除率提高一倍以上.

(2) 盐碱胁迫下碱蓬生长得到缓解的最优Ca²⁺和K⁺浓度为8 mmol ·L^-1和10 mmol ·L^-1.外源Ca²⁺和K⁺主要通过促进生成新叶片, 提高碱蓬相对生长速率.

(3) 外源Ca²⁺和K⁺缓解作用下, 碱蓬叶片及根系的无机渗透调节机制为促进Na⁺和K⁺的选择性吸收、提高碱蓬持水能力.无机离子对根系的调节作用强于叶片, 且外源Ca²⁺对碱蓬Na⁺/K⁺的调节能力强于外源K⁺.有机渗透调节机制为促进小分子有机物如Pro和Bet的合成, 缓解植物细胞膜脂过氧化作用, 降低MDA含量, 提高植物叶片叶绿素含量, 提升根系活力.小分子有机物对叶片的调节作用优于根系.