2019, Vol. 40
2. 苏州科技大学环境生物技术研究所, 苏州 215009;
3. 江苏省环境科学与工程重点实验室, 苏州 215009
, GAO Jia-qi1,2 , HUANG Yong1,2
, HU Yu-ting1,2 , LI Xiang1,2 , GU Cheng-wei1,2 , TAN Xin-wei1,2 , YIN Ji-qiang1,2 , FANG Wen-ye1,2 , NI Min1,3
2. Institute of Environmental Biotechnology, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China;
3. Jiangsu Key Laboratory of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)是指在厌氧或缺氧条件下, ANAMMOX微生物以亚硝酸盐为电子受体, 将氨氮氧化为氮气去除的生物过程[1], 反应方程如式(1).
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(1) |
相对于传统的硝化反硝化工艺, 厌氧氨氧化具有以下优势：①无需额外投加有机碳源, 有效避免了二次污染[2]; ②脱氮能力强, 容积效率高[3]; ③剩余污泥产率低, 节省污泥处理费用[4, 5].目前, 国内外已经有120座工业规模化厌氧氨氧化工艺[6], 由厌氧氨氧化贡献的氮气产量占海洋氮气释放量的30%~50%[7], 厌氧氨氧化已经成为氮素循环中的重要环节.
然而, 在实际污水处理过程中, 厌氧氨氧化工艺应用的主要瓶颈就是ANAMMOX菌难以持留和扩增.因此, 保证反应器内拥有足够的生物量且生物活性良好的ANAMMOX污泥, 是ANAMMOX反应器高效稳定运行的关键所在.氨氮和亚硝酸盐氮作为ANAMMOX微生物的基质来源, 其浓度的高低会直接影响到ANAMMOX菌对底物的利用效率, 进而影响到ANAMMOX微生物的生长代谢以及活性. Strous等[8]的研究表明, 氨氮浓度达到1 000 mg ·L-1时才会对ANAMMOX微生物产生抑制, 而NO2--N浓度高于70 mg ·L-1时就会对ANAMMOX菌产生毒性影响, 使其失去竞争优势.当亚硝酸盐的浓度进一步升高至100 mg ·L-1时, 会导致ANAMMOX微生物活性被完全抑制.然而, 鉴于不同研究中采用的工艺、运行工况及废水水质等的差异, 基质浓度对ANAMMOX活性影响的具体机制与浓度阈值仍未得到统一结论. Yang等[9]的研究中, 进水NO2--N抑制浓度为230~530 mg ·L-1, 该浓度范围比较宽泛且差异较大[10, 11].调研上述研究可以发现, ANAMMOX微生物受到高浓度基质抑制时, 对应的出水NO2--N浓度为60~180 mg ·L-1, 这与Strous等[8]提出的基质暴露水平范围70~100 mg ·L-1比较一致.而Tang等[10]在考察基质浓度对UASB反应器脱氮性能的影响时发现, 设置出水回流可保证在较高进水NO2--N浓度下反应器脱氮效果不受影响, 并认为这是由于内回流的稀释作用及时降低了反应器底部NO2--N的浓度.由此可见, 相对于进水基质浓度, ANAMMOX微生物生长所处的基质暴露水平才是直接影响其生长活性和反应系统脱氮能力的关键所在.
而目前关于基质暴露水平对ANAMMOX微生物的影响研究主要是通过批次实验来实现的, 且大部分是基质暴露水平对ANAMMOX微生物的抑制作用研究.尚无在长期、连续运行工况下基质暴露水平对ANAMMOX微生物生长量、活性以及反应器脱氮性能的影响的研究报道.本文采用高、低两种基质暴露水平培养方式, 在连续培养ANAMMOX微生物的过程中, 通过污泥浓度及总基因拷贝数、SAA以及污泥表观性状等的变化, 考察不同培养方式对于ANAMMOX污泥生长量和生长活性的影响.通过本文的研究, 丰富了基质暴露水平对ANAMMOX微生物代谢生长影响的理论认识, 重新揭示了基质浓度对于ANAMMOX微生物富集培养的重要性; 并从ANAMMOX微生物污泥浓度以及生长活性两个关键角度, 通过控制合适的基质暴露水平, 提供了一种可以缩短厌氧氨氧化工艺的启动时间以及快速提升ANAMMOX反应器脱氮性能的理论方法.
1 材料与方法 1.1 运行工艺及实验设计本实验采用发酵罐作为ANAMMOX反应器系统, 反应装置如图 1所示.该反应器由硼硅玻璃制成, 罐体总容积5 L, 有效容积4.0 L.发酵罐反应器具有温度、转速、pH、DO显示及控制功能.反应器进水采用人工模拟废水, 废水由BT100-2J型恒流蠕动泵连续泵入反应器底部, 并随液体和气体逐渐上升至出水面, 出水通过排水管前端的海绵网过滤后经沉淀区实现泥水分离.反应器外以黑布包裹, 防止光线对ANAMMOX混培物产生影响.
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图 1 发酵罐反应装置示意 |
接种厌氧氨氧化污泥取自本课题组厌氧氨氧化反应器, 该反应器内的ANAMMOX污泥总氮去除速率维持在70%左右, 总氮负荷为0.1 kg ·(m3 ·d)-1左右.取出的ANAMMOX污泥经YL-BS22多功能料理机破碎为絮状污泥.接种ANAMMOX絮状污泥的MLSS、MLVSS分别为3 813.63 mg ·L-1和1 258.5 mg ·L-1, 采用连续流搅拌方式运行反应器, 控制系统温度为(36±1)℃; 维持出水pH为7.8~8.2, 设定机械搅拌转速为80 r ·min-1, 整个实验过程HRT稳定为12 h.
通过控制反应系统不同出水基质浓度来实现ANAMMOX微生物生长的不同环境, 具体如下：维持R1反应器出水NH4+-N和NO2--N浓度均为40~60 mg ·L-1, 即保持R1处于较高但不至于对ANAMMOX菌产生抑制的基质暴露水平中; 维持R2反应器出水NH4+-N和NO2--N浓度均为0~20 mg ·L-1, 即保持R2处于较低但不至于饥饿的基质暴露水平中.
1.2 水质及污泥特性分析项目NH4+-N、NO2--N和NO3--N等水质指标分析方法参照文献[12].挥发性污泥质量浓度(MLVSS)采用马弗炉灼烧重量法测定; 污泥粒径采用马尔文激光粒度仪(MASTERSIZER 3000, Malvern, UK)进行分析测定.
1.3 EPS的提取和分析将所取泥样用pH=7的PBS(磷酸缓冲液, 组成为：1.3 mmol ·L-1 Na3PO4, 2.7 mmol ·L-1 NaH2PO4, 6 mmol ·L-1 NaCl和0.7mmol ·L-1 KCl)清洗、稀释至一定体积后混匀, 并均分为两份, 一份用于测定MLVSS; 另一份用于提取和测定EPS.在20 kHz和480W的条件下超声10 min, 于20000g离心20 min, 收集上清液即为EPS[13].所有的上清液都经0.45 μm的醋酸纤维滤膜过滤以去除不溶物.所取上清液的蛋白质、多糖含量分别采用福林酚法和苯酚-硫酸比色法测定[14, 15], 测量结果取3次测试平均值. EPS取上清液中蛋白质、多糖含量总和, 单位为mg ·g-1, 以VSS计, 即：EPS=(PN+PS)/MLVSS.
1.4 实时荧光定量PCR首先进行基因组DNA的提取, 再利用引物AMX809F/AMX1066R以及ANAMMOX菌的功能基因引物HzsBF/HzsBR对ANAMMOX菌的功能基因HzsB进行定量分析.实时荧光定量PCR(ABI7500, 美国)扩增体系(20 μL)为0.8 μL上游引物, 0.8 μL下游引物, 2 μL浓度为10 ng ·μL-1的DNA样品, 0.4 μL ROXⅡ, 2 μL dNTP, 10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ, 6 μL灭菌水.将已知浓度的质粒DNA, 按10倍梯度进行稀释得到标准曲线方程, 根据待测样品的Ct值可获得起始基因拷贝数.
1.5 比厌氧氨氧化活性测定向容积为120 mL的玻璃盐水瓶中加入100 mL基质(NH4+-N和NO2--N)浓度均为60 mg ·L-1的模拟废水.再加入经pH=7的PBS清洗后的ANAMMOX污泥(约3 g).用95%氮气曝气20 min除氧.盐水瓶用丁基橡胶塞塞紧后用铝盖加固, 置于气浴摇床上, 设定摇床环境温度为35℃, 转速为150 r ·min-1.每隔1 h定时取样, 分别测定水样中的NH4+-N和NO2--N浓度.由基质浓度降解曲线, 计算出污泥的比厌氧氨氧化活性[以N/VSS计, 单位g ·(g ·d)-1][16].
2 结果与讨论 2.1 基质暴露水平对反应器氮素去除的影响图 2为运行102 d的过程中, 高基质暴露水平反应器(R1)和低基质暴露水平反应器(R2)系统内氮素去除的情况.由图 2(a)和2(b)可以发现, 整个运行过程中, 高、低基质暴露水平反应器出水NH4+-N浓度分别为(50.74±8.81) mg ·L-1和(15.13±4.71) mg ·L-1; 对应出水NO2--N浓度分别为(51.53±6.63) mg ·L-1和(15.52±4.37) mg ·L-1, 均在设定的基质暴露水平范围内.从氮素去除速率来看, 低基质暴露水平反应系统内NH4+-N和NO2--N平均去除率比前者高出38%.化学计量比被认为是衡量氨氧化反应指标之一[17].由图 2(c)和2(d)可以看到, 两个系统内反应化学计量比(ΔNO2--N/ΔNH4+-N)介于1.18~1.19之间, (ΔNO3--N/ΔNH4+-N)比值为0.24~0.25, 与已有报道的1.20~1.32和0.22~0.32比较一致[1, 18~20].表明两个反应系统内ANAMMOX菌已经明显发挥厌氧氨氧化作用.从图 2中也可以看到, R1在整个运行过程中的进水容积负荷为R2的2倍左右, 其负荷提升进程明显快于低基质暴露水平反应器.反应器运行的前46 d, 二者氮素去除速率差异较小, R1去除速率比R2略高; 46 d以后, 在R1和R2反应器NLR分别升至0.69 kg ·(m3 ·d)-1和0.31 kg ·(m3 ·d)-1的情况下. R1负荷去除速率[0.41 kg ·(m3 ·d)-1]也相应增大为后者[0.21 kg ·(m3 ·d)-1]的2倍.相比于低基质暴露水平培养方式, 高基质暴露水平可以获得更高的脱氮效能.这是因为, 随着ANAMMOX微生物活性的提高, 较高浓度的基质暴露水平, 有利于增大底物浓度压力, 促进NH4+和NO2-在ANAMMOX小颗粒污泥内部的传递, 加快ANAMMOX细胞对基质的吸收, 进而增强系统的氮素去除效果.
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图 2 不同基质暴露水平条件下反应器氮素去除情况 Fig. 2 Nitrogen removal in the reactors under different substrate exposure levels |
作为衡量ANAMMOX微生物活性的关键指标之一, 比厌氧氨氧化活性(specific ANAMMOX activity, SAA)被广泛用来分析ANAMMOX微生物在富集培养过程中的活性变化. 图 3为不同培养条件下SAA变化情况. 表 1为反应器运行过程中ANAMMOX污泥粒径和EPS的变化情况.由图 3可知, 相比于接种时极低的ANAMMOX活性, 不同条件培养一段时间后, ANAMMOX微生物的比活性迅速提高. R1内ANAMMOX污泥的比厌氧氨氧化活性在经历31 d和46 d的培养后, 由接种启动时的0.05 g ·(g ·d)-1分别提高到0.19 g ·(g ·d)-1和0.24 g ·(g ·d)-1; R2经历31 d和46 d的培养后, ANAMMOX污泥的比厌氧氨氧化活性分别提升至0.22 g ·(g ·d)-1和0.27 g ·(g ·d)-1.在经历31 d和46 d的不同基质环境条件培养后, R2内微生物的比厌氧氨氧化活性比R1分别高出15.6%和12.5%, 即低基质暴露水平下, ANAMMOX污泥的活性更高.
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图 3 不同培养条件下ANAMMOX污泥的SAA变化情况 Fig. 3 Changes in SAA of ANAMMOX sludge under different culture conditions |
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表 1 不同培养条件下ANAMMOX微生物的粒径与EPS含量变化 Table 1 Changes in the diameter and EPS content of ANAMMOX microorganisms under different culture conditions |
本实验低基质暴露水平培养方式下, ANAMMOX污泥的最大比活性为0.27 g ·(g ·d)-1, 介于国内外报道的0.05~2 g ·(g ·d)-1之间[24~27].整个运行过程中, 低基质暴露水平培养方式下厌氧氨氧化污泥拥有更高的活性.由表 1可知, 粒径、EPS与ANAMMOX微生物比活性之间存在一定关系.有研究表明, ANAMMOX微生物的活性主要发生于颗粒污泥表面1 mm厚度的范围内[28]. Ni等[29]建立了粒径介于0.5~2.75 mm之间的ANAMMOX污泥对基质的降解模型, 认为合适的ANAMMOX污泥粒径范围是1~1.3 mm.当粒径小于该范围时, 颗粒粒径的增大会促进ANAMMOX微生物活性的提高; 当粒径过大, 细胞内部会由于底物传质受阻而出现衰亡.当颗粒粒径适宜, 如本实验中后期(R1/R2=0.85/1.18), 此时的ANAMMOX污泥兼具良好的传质效率和较强的抗冲击性能, 因此可以展现更好的生物活性.本实验中, 低基质暴露水平环境下富集培养的ANAMMOX污泥粒径比高基质方式更大, 且粒径处于合适(1~1.5 mm)的范围内, 也就是说, 该范围内ANAMMOX的活性随污泥粒径的增大而升高.因此, 这可以从一方面解释低基质暴露水平培养方式下获得的ANAMMOX污泥活性更高.
另一方面, 两种培养方式下, ANAMMOX污泥的EPS含量(以VSS计, 下同)分别由接种时的159 mg ·g-1增大至314 mg ·g-1和337 mg ·g-1, 且不同运行时段, 低基质暴露水平反应其中EPS含量更高. Wang等[30]在考察EPS在ANAMMOX-SBR反应器处于稳定、抑制及恢复阶段发挥的作用时发现, 在稳定阶段, EPS含量与ANAMMOX微生物脱氮活性呈正相关, 即EPS含量越高, ANAMMOX污泥脱氮活性越强.本实验中, EPS的含量与ANAMMOX污泥的活性也表现出类似关联, 这表明尽管EPS本身不具有生物活性, 但EPS可以保障或促进ANAMMOX微生物生物活性的表达.分析原因可能是, 细菌分泌的EPS对微生物聚集体的理化性质, 如结构、表面电荷、絮凝、沉降性能、脱水性能、吸附能力等具有重要意义[31~34]. EPS可以通过影响ANAMMOX微生物的理化性质, 进一步影响到ANAMMOX菌对基质的利用率, 从而间接影响到ANAMMOX污泥的生物活性.
2.3 不同基质暴露水平对ANAMMOX微生物生物量的影响通过定期对不同基质暴露水平反应器内的生物量进行分析测定, MLVSS以及总功能基因拷贝数变化情况分别如图 4和图 5(运行至46 d)所示.由图 4可以看到, R1在反应器稳定运行的第31、46和98 d时对应的生物量分别由接种时的1 258.5 mg ·L逐渐升高到1 600、1 735和1 805 mg ·L-1; R2则对应增大至1 360、1 462和1 506 mg ·L-1. 3个阶段R1相比于R2的生物增量分别是17.64%、18.67%和19.85%, R1的ANAMMOX富集程度明显超过R2.而从VSS/SS总体趋势来看, 高基质暴露水平富集培养的ANAMMOX污泥拥有更高的有机成分占比. 图 5中, R1和R2培养获得的厌氧氨氧化功能菌基因拷贝数分别由接种时的1.67×1012 copies升高到4.81×1012copies和3.39×1012copies.高基质暴露水平培养得到的厌氧氨氧化污泥功能基因拷贝数是低基质暴露水平培养方式的1.4倍, 高基质暴露水平培养方式更有利于ANAMMOX功能菌的富集代谢和生长繁殖.
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图 4 不同培养条件下ANAMMOX污泥浓度的变化情况 Fig. 4 Changes in sludge concentrations under different culture conditions |
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图 5 不同培养条件下ANAMMOX功能基因拷贝数变化情况 Fig. 5 Variation in the copy numbers of ANAMMOX functional genes under different culture conditions |
分析可能的原因是, ANAMMOX细菌细胞产率低(0.8~0.11 g ·g-1, 以VSS/NH4+-N计), 生长缓慢且在高细胞浓度(1010~1011个·mL-1)时才具有活性[1, 35]. ANAMMOX菌在适应新环境之后, 厌氧氨氧化活性逐渐提高, 较高的基质暴露水平(40~60 mg ·L-1)的选择压, 一方面提供了比较充足且不会对ANAMMOX菌产生抑制的底物营养; 另一方面, 较高浓度的氨氮、亚氮浓度, 使得ANAMMOX细胞内外的底物压力差增大, 提高了氨氮、亚硝酸盐氮的传质效率.而Strous等[1]也曾指出, 限制ANAMMOX微生物生长快慢的关键因素就是ANAMMOX菌对底物的利用速率.在较高基质暴露水平环境中, ANAMMOX菌对底物氨氮、亚硝酸盐氮的利用速率更快, 促进了ANAMMOX污泥繁殖生长, 因此其生物量明显高于低基质暴露水平培养方式.综上, 高基质暴露水平培养方式更有利于ANAMMOX微生物的富集培养以及厌氧氨氧化反应器脱氮性能的提升, 而鉴于ANAMMOX实际工程应用需要大量的ANAMMOX接种污泥, 建议在ANAMMOX污泥种泥的培养过程中可采用高基质暴露水平培养方式, 以获得生物量大、脱氮性能良好的ANAMMOX泥源.
3 结论(1) 高、低基质暴露水平两种培养环境都能实现ANAMMOX脱氮能力的增强.相比之下, 高基质暴露水平培养方式下获得的NLR(以N计, 下同)为0.69 kg ·(m3 ·d)-1, 其负荷提升速率为低基质暴露水平培养方式[0.31 kg ·(m3 ·d)-1]的2倍; 且高基质暴露水平培养方式的脱氮效果更优, 对应NRR分别为0.41 kg ·(m3 ·d)-1, 高于低基质暴露水平系统获得的0.21 kg ·(m3 ·d)-1.
(2) 高、低基质暴露水平方式下ANAMMOX污泥的SAA分别从接种时的0.05 g ·(g ·d)-1提高到0.22 g ·(g ·d)-1和0.27 g ·(g ·d)-1; 后者ANAMMOX污泥活性较前者高出22.7%, 低基质暴露水平培养方式有利于富集生物活性更高的ANAMMOX污泥.
(3) 高基质暴露水平方式下, ANAMMOX污泥浓度和总基因拷贝数分别达到1 805 mg ·L-1和4.81×1012copies, 是低基质暴露水平环境的1.2~1.4倍, 高基质暴露水平培养方式更有利于ANAMMOX污泥的快速富集.
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