2019, Vol. 40
2. 重庆大学三峡库区环境与生态部重点实验室, 重庆 400045
2. Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region's Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)是一种新型脱氮工艺, 因其具有脱氮效率高、曝气量少、无需额外碳源等优点成为近年来研究热点.目前厌氧氨氧化工艺已被用于处理各种废水[1~4].根据厌氧氨氧化反应方程式[5]可知, 经过厌氧氨氧化反应后仍然有10%以上的NO3--N无法去除, 此外单一的厌氧氨氧化工艺对COD没有去除效果, 但废水中往往存在较高的COD.为了去除厌氧氨氧化产生的NO3--N和废水中的COD, 有必要将反硝化工艺与厌氧氨氧化工艺结合, 厌氧氨氧化耦合反硝化(simultaneous ANAMMOX and denitrification, SAD)能够实现同步脱氮除碳的目的.
Li等[6]的研究表明, 厌氧氨氧化和反硝化反应可在同一反应器中发生, 并具有良好的脱氮除碳效果.然而有研究表明, 高COD浓度或高碳氮比对厌氧氨氧化反应具有抑制作用[7], 因此启动SAD工艺需要将碳氮比控制在合理范围内.张诗颖等[8]发现采用ABR反应器时厌氧氨氧化耦合反硝化最佳协同条件为COD/TN=1, TN平均去除率为93%, 比单一厌氧氨氧化理论TN去除率高4%.张美雪等[9]的研究表明在SAD系统稳定期NH4+-N、NO2--N和TN的去除率依次为93.84%、94.62%和86.46%.
以上研究均在低氮进水浓度下(NH4+-N浓度30~80 mg ·L-1、NO2--N浓度45~160 mg ·L-1)进行, 而采用SAD处理高氮浓度废水的研究鲜有报道, 另外现有关于SAD的研究大多注重碳氮去除效果的分析, 缺乏对微生物群落变化的分析, 同时缺少对反应器内部不同部位的菌群变化分析.因此, 本实验采用高氮低碳废水(NH4+-N浓度190.63~246.39 mg ·L-1, NO2--N浓度216.28~267.92 mg ·L-1, COD浓度108~333 mg ·L-1)启动SAD工艺, 探究SAD启动过程中碳氮去除机制与微生物群落的关系, 以期为SAD应用于处理实际废水提供技术支持.
1 材料与方法 1.1 SAD工艺装置与运行实验采用膨胀颗粒污泥床(EGSB), 主要结构见图 1, 反应器高1.3 m, 反应区内径80 mm, 有效容积9 L.该厌氧氨氧化反应器已稳定运行2年, TN去除率85%以上.反应器主体采用水浴加热, 温度35~37℃, 反应器进水DO控制在(0.2±0.02) mg ·L-1, HRT为9 h, 实验阶段进水TN负荷为1.13~1.44 kg ·(m3 ·d)-1.
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图 1 EGSB反应器运行装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of EGSB reactor operation |
本实验采用人工配水, 进水pH均控制在7.8~8.2, 水质指标如表 1所示.
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表 1 EGSB反应器进水水质 Table 1 Influent water quality of EGSB reactor |
DO、pH通过溶解氧仪(520M-01A, Thermo, USA)和pH计(8107UWMMD, Thermo, USA)测量.水质测定均采用国家标准方法[10]：NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法测定, NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定, NO3--N采用紫外分光光度法测定, COD采用快速消解分光光度法测定, MLVSS采用恒重法测定.污泥的厌氧氨氧化活性和反硝化活性参考黄佳璐等[11]和徐峥勇[12]的测定方法并作适当调整, 具体步骤如下：采用100 mL原水和3 g(湿重)污泥置于150 mL血清瓶中, 测定厌氧氨氧化活性时控制NH4+-N和NO2--N的初始浓度分别为100 mg ·L-1和120 mg ·L-1左右, 测定反硝化活性时控制NO3--N和葡萄糖初始浓度分别为100 mg ·L-1和500 mg ·L-1左右, pH值均为7.8~8.1, 实验通过高纯氮气曝气30 min保证厌氧条件, 然后将血清瓶避光置于37℃、150 r · min-1的水浴恒温振荡器中, 采用注射器每1 h取1次水样, 测定NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度.根据基质降解曲线计算出污泥的厌氧氨氧化活性[以NH4+-N/VSS计, g ·(g ·d)-1]和反硝化活性[以NO3--N/VSS计, g ·(g ·d)-1].
1.3 脱氮贡献率计算方法厌氧氨氧化脱氮贡献率A和反硝化脱氮贡献率D参考魏思佳等[13]的计算方法：
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(1) |
式中, (NH4+-N)rem、(NO2--N)rem分别为NH4+-N、NO2--N去除量(mg ·L-1), ΔNO3--N为NO3--N变化量(mg ·L-1).
1.4 高通量测序分析方法在SAD启动实验前后分别提取反应器内上层和下层污泥样品中的微生物DNA, 其中Up1代表SAD启动前上层污泥, Down1代表SAD启动前下层污泥, Up2代表SAD启动后上层污泥, Down2代表SAD启动后下层污泥.采用高通量测序方法检测4组样品中的微生物[14], 测序由上海美吉生物提供(上海, 中国).
2 结果与讨论 2.1 SAD启动过程中脱氮除碳性能分析SAD启动采用逐步提高COD负荷的方式, 图 2表示启动过程中氮素去除特征.添加COD后NH4+-N出水浓度为0.15~11.64 mg ·L-1, 平均去除率为98.54%, 可见COD浓度的增加并没有使氨氮去除率下降. NO2--N出水浓度为0.52~7.96 mg ·L-1, 出水较稳定, 平均去除率为98.05%.从图 2(c)可知, NO3--N出水浓度随着COD的增加逐渐下降, 从启动前的48.01~52.04 mg ·L-1降至第3阶段的5.11~13.03 mg ·L-1.启动过程中TN出水浓度为16.56~48.85 mg ·L-1, 且随着COD的增加TN浓度逐渐降低, 第1阶段TN平均去除率为90.58%, 第2阶段为94.33%, 第3阶段为95.60%, 可见TN去除率随着COD增加而增加, 且增加速度趋缓.启动实验结果表明COD为306~333 mg ·L-1(COD/TN约0.75)时厌氧氨氧化耦合反硝化效果最好, TN最高去除率为95.60%, 比厌氧氨氧化理论TN去除率高了6.8%, 这在目前报道的SAD系统对TN去除率的研究中处于较高水平[8, 9], 表明本实验厌氧氨氧化与反硝化反应达到了良好地协同脱氮效果.
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图 2 SAD启动过程中氮素去除特征 Fig. 2 Characteristics of nitrogen removal during SAD startup process |
图 3表示, SAD启动过程中三氮计量比关系及厌氧氨氧化和反硝化脱氮贡献率变化, 可见启动过程中ΔNO2--N/ΔNH4+-N并没有明显变化, 保持在1.05~1.21范围内, 略低于厌氧氨氧化反应的理论值, 但ΔNO3--N/ΔNH4+-N有明显下降的趋势, 第1阶段该比值范围为0.15~0.17, 第2阶段为0.07~0.10, 第3阶段为0.03~0.07.随着COD浓度的提高, NO2--N去除量没有增加, 但NO3--N消耗量明显增加, 这是由于有机物浓度增加后反应器内异养反硝化菌快速生长, 且优先利用NO3--N作为反硝化氮源, 这与刘晓萍[15]的研究结果相同.
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图 3 SAD启动过程中计量比关系及厌氧氨氧化和反硝化脱氮贡献率变化 Fig. 3 Characteristics of the measurement ratio relation ship and TN removal contribution of ANAMMOX and denitrification during SAD startup process |
由图 3可知, 随着COD的增加厌氧氨氧化脱氮贡献率不断下降, 启动前厌氧氨氧化平均脱氮贡献率为98.5%, 第1阶段为94.1%, 第2阶段为90.7%, 第3阶段为83.9%, 相反地, 反硝化脱氮贡献率从启动前的1.5%增至第3阶段的16.1%, 呈逐渐上升趋势, 这主要是因为异养反硝化菌在反应器内比例逐渐增加.由于COD/TN控制在0.75以下, 碳源不足导致反硝化菌无法正常进行反硝化反应, 其生长增加到一定程度后得到抑制, 增加的反硝化菌并没有和厌氧氨氧化菌抢夺基质NO2--N, 而是利用厌氧氨氧化反应产生的NO3--N, 因此反应器内厌氧氨氧化菌的脱氮性能并没有受到影响. Kumar等[16]指出SAD耦合成功的必要条件是反硝化反应不会和厌氧氨氧化反应争夺NO2--N, 本实验结果也证明了这一点.
图 4表示, SAD启动过程中COD去除特征, 可知第1阶段COD出水浓度为38~46 mg ·L-1, 第2阶段为48~68 mg ·L-1, 第3阶段为58~81 mg ·L-1, 可见, COD进水浓度的大幅增加并没有导致出水浓度大幅增加, 一方面是异养反硝化作用逐渐增强的影响, 另一方面可能是由于反应器内存在一定比例的厌氧消化菌, COD增加后反应器内厌氧消化菌得到生长, 异养反硝化和厌氧消化的共同作用使得COD去除率维持在较高水平, 最终稳定在75%~80%之间.
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图 4 SAD启动过程中COD去除特征 Fig. 4 Characteristics of COD removal during SAD startup process |
通过对反应器内上层污泥和下层污泥取样分析, 计算污泥的厌氧氨氧化活性和反硝化活性, 见表 2.
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表 2 反应器内污泥厌氧氨氧化活性和反硝化活性 Table 2 ANAMMOX and denitrification sludge activity in the reactor |
由表 2可知反应器下层污泥厌氧氨氧化活性明显优于上层, 主要是因为反应器由下部进水, 下部较高的基质浓度更有利于厌氧氨氧化菌的富集. SAD启动成功后, 反应器上层污泥厌氧氨氧化活性下降, 由0.08 g ·(g ·d)-1降至0.027 g ·(g ·d)-1,主要是因为有机物进入反应器后异养菌增长较快, 且异养菌多呈悬浮态, 在上层污泥中较多, 上层厌氧氨氧化菌变少, 厌氧氨氧化活性降低.启动成功后下层污泥厌氧氨氧化活性几乎不变, 由0.114 g ·(g ·d)-1变为0.11 g ·(g ·d)-1, 主要是因为下层颗粒状厌氧氨氧化污泥较多, 且具有一定的抗冲击性, 异养菌的生长对厌氧氨氧化菌影响较少.
从反硝化活性看, SAD启动前, 反应器内上层污泥反硝化活性略高于下层污泥, 启动后上下层污泥反硝化活性都有明显提高, 分别由0.057 g ·(g ·d)-1和0.049 g ·(g ·d)-1增加为0.241 g ·(g ·d)-1和0.213 g ·(g ·d)-1, 且上层污泥反硝化活性更高, 这可能是因为厌氧氨氧化颗粒污泥沉降性能好, 在反应器底部密度较大, 而悬浮态的异养反硝化菌密度较小, 在反应器上部生长更快, 因此上层污泥的反硝化活性优于下层污泥.
2.3 SAD典型周期内基质变化特征图 5表示典型周期(Phase3)内各基质变化曲线, 典型周期结束后测得MLVSS浓度为3156 mg ·L-1.由基质变化曲线可看出, NO2--N和NH4+-N降解可分为两个阶段：快速降解阶段(0~10 h)和稳定阶段(10~18 h).在快速降解阶段, NO2--N和NH4+-N降解过程接近零级反应.在稳定阶段, NO2--N和NH4+-N降解缓慢并趋于稳定. NO3--N浓度在反应中先增后减, 且在10 h时浓度达到最高, 安芳娇等[17]的研究也发现相同的现象, 这可能是由于在反应前期NO2--N浓度较高, 反硝化菌在利用氮源时优先利用NO2--N, 厌氧氨氧化反应产生的NO3--N逐步累积, 后期NO2--N浓度减小, 更多的NO3--N被反硝化菌利用, NO3--N浓度又逐渐降低.由图 5可知, 当NO2--N和NO3--N浓度稳定后, COD浓度依然在降低, 这可能是反应器中厌氧消化菌和微生物繁殖消耗碳源的共同作用.
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图 5 SAD典型周期内基质变化特征 Fig. 5 Characteristics of matrix changes during a typical cycle of SAD |
微生物多样性和丰富度如表 3所示, 本实验中4组微生物测序样本覆盖率(coverage)均大于0.99, 能保证测序结果的准确性. Shannon和Simpson代表样品多样性, Sobs、Ace和Chao代表样品丰富度.由表 3可知SAD启动前上层污泥Shannon和Sobs指数均高于下层污泥, 因此反应器上层污泥微生物多样性和丰富度均高于下层污泥, 这是由于下层污泥富集的厌氧氨氧化菌较多, 微生物种类相对较少. SAD启动后上层污泥Shannon和Sobs指数均有所下降, 这表明SAD启动后反应器上下层污泥微生物多样性和丰富度有所上升, 主要是因为有机物加入后异养菌得到生长, 反应器内微生物种类增多.
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表 3 反应器内微生物多样性和丰富度 Table 3 Microbial diversity and abundance in the reactor |
2.4.2 微生物门分类水平组成分析
将微生物检测相对丰度>1%的菌门作为主要菌门, SAD启动前后反应器上层污泥和下层污泥微生物门水平组成如图 6所示. 4组微生物群落中共发现9个主要菌门, 分别为绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、装甲菌门(Armatimonadetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿菌门(Chlorobi)和Patescibacteria菌门.其中绿菌门仅是SAD启动前的主要菌门, 而Patescibacteria仅是SAD启动后的主要菌门, 二者相对丰度较小(1.22%~1.98%), 其它7个菌门在SAD启动前后均为反应器内主要菌门.
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图 6 反应器内微生物门水平组成 Fig. 6 Composition of microorganisms at the phylum level in the reactor |
绿弯菌门是厌氧氨氧化系统中常见的菌门, 汪瑶琪等[18]在厌氧氨氧化系统中也发现较大丰度的绿弯菌门. Chen等[19]的研究发现, 绿弯菌门是兼性厌氧菌, 有利于厌氧氨氧化菌形成颗粒污泥. Kindaichi等[20]的研究表明, 绿弯菌门分解死亡的厌氧氨氧化菌, 且它的丝状结构有利于生物膜的形成, 可见绿弯菌门对于厌氧氨氧化系统具有重要作用.由图 6可知, SAD启动后绿弯菌门相对丰度有所增加, 反应器上下部分别由35.87%和31.79%升至40.94%和38.92%, 这是因为反应器内属于绿弯菌门的菌种主要为厌氧发酵菌, COD增加后部分厌氧发酵菌得到生长, 绿弯菌门丰度增加.浮霉菌门是厌氧氨氧化菌所在的主要菌门, 在上下层污泥中相对丰度分别为20.16%和32.29%, 可见下层污泥厌氧氨氧化菌富集效果优于上部, 这与污泥活性的分析结果相同. SAD启动后上下层污泥浮霉菌门相对丰度均有所下降, 表明COD增加后异养菌的生长抑制了厌氧氨氧化菌的生长, 但是这种抑制效果并没有影响厌氧氨氧化脱氮效果, 这可从较高的NH4+-N去除率得到验证.相关研究表明变形菌门和厚壁菌门对反硝化有重要作用[21], 启动前后上下层污泥变形菌门相对丰度分别由8.15%和8.45%增至13.84%和14.07%, 这主要是异养反硝化菌生长增殖的作用.装甲菌门是厌氧氨氧化系统中常见的菌门, 其相对丰度在SAD启动后略微下降. Zhang等[22]的研究发现, 厌氧氨氧化系统中装甲菌门的存在会导致NH4+-N过量消耗, 这可能是本实验中ΔNO2--N/ΔNH4+-N低于理论值的原因.
2.4.3 功能微生物群属分析将微生物检测相对丰度>0.5%的菌属作为主要分析对象, 4组微生物样品共检测出27个属, 微生物属水平组成如图 7所示. SAD启动前反应器内部优势菌属为Candidatus Brocadia(18.24%~30.84%)、norank_f_Anaerolineaceae(13.33%~14.42%)、norank_o_SBR1031 (6.71%~7.22%)、norank_o_Fimbriimonadales(5.03%~5.62%)、Limnobacter(4.32%~4.52%)和Clostridium_sensu_stricto_ 1 (3.82%~4.64%)等. SAD启动后反应器内部优势菌属为Candidatus Brocadia(15.91%~25.69%)、OLB 13 (11.09%~23.98%)、norank_o_SBR1031 (5.63%~14.81%)、norank_o_Fimbriimonadales(4.84%~4.99%)、norank_f_A4b(4.25%~6.37%)和Limnobacter(3.53%~4.73%)等. Candidatus Brocadia为反应器内检测出的唯一厌氧氨氧化菌, 其相对丰度和浮霉菌门相当, 表明本实验Candidatus Brocadia为厌氧氨氧化菌优势菌种.文献[23]的研究发现Candidatus Kuenenia适合存在于低基质浓度废水中, 而Candidatus Brocadia主要存在于高基质浓度废水中, 本实验进水NH4+-N平均浓度在200mg ·L-1以上, 属于高基质浓度废水, 更适合Candidatus Brocadia生长. Limnobacter是一种异养菌, 属于变形菌门, SAD启动前后Limnobacter丰度没有较大变化.有研究表明Limnobacter能和厌氧氨氧化菌共生, 保护厌氧氨氧化菌免受外界恶劣环境的影响[24], Candidatus Brocadia相对丰度在SAD启动后有所下降, 但下降不明显, 仍然表现出较高的厌氧氨氧化活性, 这可能与Limnobacter的保护作用有关.
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图 7 反应器内微生物属水平组成 Fig. 7 Composition of microorganisms at the genus level in the reactor |
norank_f_Anaerolineaceae、norank_o_SBR1031、OLB13 和norank_f_A4b均属于绿弯菌门厌氧绳菌纲(Anaerolineae), 有研究表明该类微生物为厌氧消化核心微生物种群[25], SAD启动后该类厌氧消化菌丰度有所增加, 由于实验采用葡萄糖作为碳源, 可能是葡萄糖的添加促进了厌氧消化作用.另有研究表明隶属于厚壁菌门的土孢杆菌(Terrisporobacter)和毛球菌(Trichococcus)也属于厌氧消化菌[26, 27], 在本实验中也检测到.有研究表明, 氢噬菌(Hydrogenophaga)、索氏菌(Thauera)、假单胞菌(Pseudomonas)、副球菌(Paracoccus)和Denitratisoma菌都具有反硝化功能, 其中索氏菌、副球菌和Denitratisoma主要发生异养反硝化[28~30], 假单胞菌既可以发生自养反硝化[31], 也可以发生异养反硝化, 而氢噬菌主要发生自养反硝化[32].另外有研究发现属于厚壁菌门的芽孢杆菌(Bacillus)也具有反硝化功能[33].
图 8反映了SAD启动前后上下层污泥不同功能菌属相对丰度及其变化.可见SAD启动后厌氧消化菌相对丰度有较大增加, 反应器上下部厌氧消化菌相对丰度分别由29.87%和27.14%增至38.56%和35.82%.厌氧氨氧化菌在SAD启动后相对丰度有所下降, 上下层污泥厌氧氨氧化菌相对丰度分别由18.24%和30.84%降至15.91%和25.69%. SAD启动后反硝化菌相对丰度增幅较大, 反应器上下部变形菌门相对丰度分别由2.76%和2.79%增至9.10%和10.88%.菌群变化的主要原因在于有机物进入反应器后, 异养反硝化菌在有外部碳源情况下快速生长, 外加碳源和异养菌的增加抑制了厌氧氨氧化菌的生长, 部分厌氧氨氧化菌死亡, 厌氧氨氧化菌相对丰度下降, 死亡的厌氧氨氧化菌细胞和外加碳源为厌氧消化菌提供了营养物质, 厌氧消化菌得到生长, 相对丰度增加.
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图 8 功能微生物相对丰度变化 Fig. 8 Changes of relative abundance of functional microorganisms |
(1) 在高氮进水基质下启动SAD反应, 随着进水COD浓度的增加, NH4+-N和NO2－-N出水稳定, 平均去除率在98%以上; TN去除率逐渐升高, 第3阶段TN平均去除率为95.6%, 比厌氧氨氧化理论TN去除率高6.8%.随着进水COD浓度的增加, ΔNO3--N/ΔNH4+-N明显下降, 从0.15~0.17逐步降至0.03~0.07; COD浓度增加的过程中厌氧氨氧化脱氮贡献率逐渐下降, 反硝化脱氮贡献率逐渐上升, COD去除率逐步增加.
(2) 反应器内下层污泥厌氧氨氧化活性明显高于上层污泥, 下层污泥反硝化活性略高于上层污泥. SAD启动后厌氧氨氧化活性略微降低, 污泥反硝化活性明显增加, 上层污泥反硝化活性更高.
(3) 典型周期内, 即SAD脱氮效果最佳时, NO2--N和NH4+-N在快速降解阶段降解过程接近零级反应, NO3--N浓度在反应中先增后减, 且在10 h时浓度达到最高.
(4) 高通量测序分析结果表明反应器内微生物群落特征与SAD脱氮除碳性能密切相关.反应器内与脱氮除碳有关的功能微生物主要有厌氧氨氧化菌、反硝化菌和厌氧消化菌. SAD启动后反应器内厌氧氨氧化菌丰度相对减少, 厌氧消化菌和异养反硝化菌丰度明显增加.
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