2019, Vol. 40
2. 青岛大学附属医院, 青岛 266000
2. Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, China
ZnO NPs的粒径介于1~100 nm之间, 具有优异的光、电、磁、敏感等特性, 在化妆品、医药和光触媒颜料等的生产中得到广泛的应用[1, 2].在NPs的生产、使用以及含NPs产品的处置、遗弃等过程中, 都可能导致NPs进入生态系统[3, 4].近年来, 在多处污水和污水厂污泥中检测到ZnO NPs的存在[5, 6].大量研究表明, ZnO NPs会对污水生物处理系统的性能及微生物种群结构和多样性产生不利影响[7~12].
对NPs生物毒性的影响因素包括粒径、表面积、表面修饰情况、暴露途径、实验对象、方法和浓度以及接触方式等[13].其中, 粒径在影响NPs渗入细胞和组织过程中起着关键作用[14]. NPs粒径愈小, 比表面积愈大, 表面活性愈强, 生物毒性也愈大[15~17].有研究发现, Ag NPs对硝化细菌的毒性具有明显的粒径效应, Ag NPs比块状Ag的毒性高, 且Ag NPs粒径越小产生的毒性越强[18].关于NPs对湿地生态系统的影响, 国内外的学者也进行了初步的探索.然而, 目前关于ZnO NPs对人工湿地脱氮性能及微生物群落结构的粒径效应缺乏系统深入地研究.
本研究在实验室构建水平潜流人工湿地(horizontal subsurface flow constructed wetland, HSFCW), 研究不同粒径ZnO NPs(15、50和90 nm)对人工湿地(constructed wetland, CW)中微生物群落结构和多样性的影响, 同时结合CW脱氮性能的变化, 探讨CW中微生物群落结构与其处理性能的相互关系.
1 材料与方法 1.1 实验材料15 nm的ZnO NPs, 白色粉末, 纯度99.9%, 比表面积110 m2 ·g-1, 购自南京埃普瑞纳米材料有限公司; 50 nm和90 nm的ZnO NPs, 淡黄色到白色粉末, 纯度都为99.8%, 比表面积分别为15~30 m2 ·g-1和10~20 m2 ·g-1, 购自于杭州万景新材料有限公司.
ZnO NPs悬浊液：称取0.5 g NPs加入1 L超纯水中, 磁力搅拌器搅拌30 min后, 转移至棕色试剂瓶, 在25℃、500 W和40 kHz下超声1 h[19].在每次使用前, 先将NPs悬浊液超声1 h.
香蒲植株高度30 cm左右, 生长状况基本一致.为了保证实验结果的稳定、可靠性, 所有购买的香蒲先放入装有1/4浓度的霍格兰氏植物培养液的塑料箱中, 25℃下驯化培养10 d左右.
1.2 接种污泥与实验用水取青岛市李村河污水处理厂二沉池回流污泥作为接种污泥, 污泥呈黄褐色, 絮体状态良好.
实验用水为人工模拟废水, 分别以乙酸钠、氯化铵及磷酸二氢钾和磷酸氢二钾提供碳源、氮源和磷源.配水中添加微量元素1 mL ·L-1, 具体成分见表 1.用1 mol ·L-1的盐酸或氢氧化钠调pH至7.4左右.进水中包括COD(200.0±10.2)mg ·L-1、NH4+-N(12.5±0.6)mg ·L-1、NO3--N(0.05±0.01)mg ·L-1、TN(13.0±2.5)mg ·L-1和溶解性总磷(4.0±0.5)mg ·L-1.采用连续进水方式, 水力停留时间约3 d.
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表 1 微量元素组成 Table 1 Microelement composition |
1.3 实验装置
反应器为PP材质, 高37.0 cm, 长26.5 cm, 宽26.5 cm, 有效容积20 L(见图 1和图 2).自下往上, 2.0 cm细沙, 17.0 cm砾石, 细丝网(80目), 8.0 cm细沙.
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图 1 实验装置构造示意 Fig. 1 Schematic of CW |
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图 2 实验装置照片 Fig. 2 Picture of CWs |
砾石装入反应器前先进行挂膜.取1.2中的活性污泥作为接种污泥, 倒入放满砾石的40 L容器中(淹没砾石), 先闷曝3 d, 然后进行间歇曝气, 以人工配制的污水作为进水, 运行大约10 d后把表面带有一层黄色生物膜的砾石转移到反应器中, 顶部覆盖8.0 cm的细沙, 每个反应器种植9株香蒲, 每天投配一定量的人工污水.再连续运行大约10 d后, 开始测定COD、氨氮和TN等指标. COD、氨氮和TN的去除达到稳定7 d后, 加入不同粒径ZnO NPs.
环境中ZnO NPs浓度较低, 环境本底在1 mg ·L-1左右, 考虑到ZnO NPs使用量逐年增多及其不可降解的属性, 在环境中累积的数量不断增大, 因此有必要研究高浓度ZnO NPs可能产生的毒性效应.本实验共设2个对照组(不加ZnO NPs, 对照), 3个实验组(ZnO NPs浓度均为10 mg ·L-1, ZnO NPs粒径分别为15、50和90 nm).投加15、50和90 nm ZnO NPs的反应器编号分别为CW-15、CW-50和CW-90.培养温度22~25℃, 光照/黑暗周期为16 h/8 h.
1.4 指标测定及方法 1.4.1 常规指标COD、氨氮、NO2--N和NO3--N的测定参照文献[20].
1.4.2 生物膜的采集挂膜成功以及暴露于不同粒径ZnO NPs 28 d后, 从每个反应器不同位置采集砾石共300 g, 放入3 L磷酸盐缓冲溶液中(10 mmol ·L-1 Na2HPO4, 8.5 g ·L-1 NaCl), 在暗处振荡3 h(100 r ·min-1, 30℃)[21], 静置后倒掉上清液, 底部沉淀物即生物膜.进行测序之前, 提取的生物膜样品在-20℃保存.
1.4.3 DNA提取和PCR扩增采用MO BIO公司的PowerSoil DNA isolation Kit提取DNA, 并对DNA进行琼脂糖电泳, 验证DNA的浓度与完整性.以稀释后的DNA为模板, 使用带Barcode的16S rDNA V4区特异引物515F(5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′)进行PCR.
1.4.4 高通量测序及结果分析PCR产物使用2%浓度的琼脂糖胶电泳, 采用GeneJET胶回收试剂盒(Thermo Scientific)回收产物.使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库的构建, 检测合格后, 使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序(诺禾致源生物信息科技有限公司, 北京).
测序完成后, 首先用Cutadapt(V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)Barcode和引物序列得到原始数据(Raw reads), 去除嵌合体序列后得到最终的有效数据(Clean Reads).利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001, http://drive5.com/uparse/)对所有样品的全部Clean Reads进行聚类, 将97%相似性的序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units).用Mothur方法与SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1), 获得分类学信息并分别在各个分类水平.
使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Observed-OTUs、Chao1、Shannon、Simpson、ACE和测序深度指数, 使用R软件(Version 2.15.3)进行α多样性指数组间差异分析.
2 结果与讨论 2.1 ZnO NPs粒径对系统性能的影响 2.1.1 ZnO NPs粒径大小对系统去除COD性能的影响如图 3所示, 进水COD浓度在205~220 mg ·L-1, 对照、CW-15、CW-50和CW-90对COD的平均去除率分别为76.7%、75.9%、75.5%和74.2%.稳定运行7 d后, 进水中投加10 mg ·L-1 ZnO NPs.投加ZnO NPs后, CW-15、CW-50和CW-90对COD的去除率有不同程度地下降.连续运行28 d后, 对照反应器对COD的去除率稳定在70%左右, 而CW-15、CW-50和CW-90对COD的去除率分别降至56.9%、64.5%和68.3%.上述结果表明, ZnO NPs对COD的去除产生了抑制, 且粒径小的抑制作用更为明显.原因可能是, 随着NPs粒径的变小, 其表面积呈指数增加, 增大了与微生物细胞的接触[17, 22], 从而增强了对异养菌的抑制作用, 导致有机物去除效果的恶化.
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图 3 不同粒径ZnO NPs对CWs去除COD效果的影响 Fig. 3 Effects of different sized ZnO NPs on removal efficiency of COD in CWs |
如图 4所示, 进水氨氮浓度在12.2~13.4 mg ·L-1, 对照反应器、CW-15、CW-50和CW-90对氨氮的平均去除率分别为61.8%、62.4%、61.5%和61.4%.投加ZnO NPs后, CW-15、CW-50和CW-90对氨氮的去除率有不同程度地降低.连续运行28 d后, CW-15、CW-50和CW-90对氨氮的去除率都有不同程度地降低, 分别降至36.8%、48.4%和54.2%.实验过程中, 对照反应器对氨氮的去除率稳定在60%左右.上述结果表明, 加入15 nm的ZnO NPs对系统去除氨氮的抑制作用最大, 50 nm次之, 90 nm的最小.
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图 4 不同粒径ZnO NPs对CWs去除氨氮效果的影响 Fig. 4 Effects of different sized ZnO NPs on removal efficiency of ammonia nitrogen in CWs |
稳定条件下, 对照反应器与CW-15、CW-50和CW-90中总氮的平均出水浓度分别为5.87、5.66、5.75和5.60 mg ·L-1(图 5).投加ZnO NPs后, CW-15、CW-50和CW-90对总氮的去除率明显降低.连续运行28 d后, CW-15、CW-50和CW-90中出水总氮浓度分别增加至10.7、8.2和7.3 mg ·L-1.上述结果表明, 加入小粒径(15 nm)的ZnO NPs对总氮的去除起抑制作用比大粒径ZnO NPs更为显著.原因可能是, ZnO NPs对反硝化菌有显著的抑制作用[23], 而小粒径的抑制作用更为明显, 导致出水氨氮浓度增加, 亚硝酸盐和硝酸盐发生积累, 从而使出水总氮浓度增大.
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图 5 不同粒径ZnO NPs对CWs去除总氮效果的影响 Fig. 5 Effects of different sized ZnO NPs on removal efficiency of total nitrogen in CWs |
利用IonS5TMXL测序平台, 检测不同粒径ZnO NPs下微生物的种群结构. 4个样品中共得到320 837条高质量序列和1 408个OTUs(按97%的相似度划分). 4个样品中微生物群落的丰富度和多样性指数如表 2所示.基于处理后得到有效序列, 4个样品的物种数目在1 182~1 240之间.在相似度为97%的条件下, 样品的测序深度指数稳定在0.998, 说明测序涵盖了样品中绝大部分的物种, 能够较准确地反映微生物的丰富度和多样性. ACE和Chao1指数表征微生物群落的丰富度, 而Shannon和Simpson指数代表微生物的多样性. Chao1和ACE指数越大, 说明群落丰富度越高. Shannon和Simpson指数值越大, 说明群落多样性越高.可以看出, ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数呈现出波动.未投加ZnO NPs时, 样品的ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数最小, 投加ZnO NPs后, ZnO NPs颗粒促使微生物对外界影响和冲击做出反应, 因此微生物多样性都有不同程度地增大, 这与王未青[24]研究纳米氧化锌对SBR中微生物群落的影响的研究结果一致, 且粒径越小增加越显著.这说明暴露于15 nm ZnO NPs后微生物群落多样性和丰富度最大, 50 nm的样品次之, 而90 nm的样品增加得最小.这归因于小粒径的ZnO NPs具有更大的比表面积, 更强的表面活性以及更容易穿透进入细胞内部, 从而比大粒径颗粒具有更强的毒性[14, 17, 25], 而微生物群落多样性和丰富度越大, 系统的稳定性越强, 从而导致系统微生物群落产生不同的变化.
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表 2 4个样品中微生物群落的丰富度和多样性指数汇总 Table 2 Richness and diversity indices of the microbial communities in the four samples |
2.3 微生物群落差异性分析
为了更准确地研究群落结构差异, 本研究利用统计学方法主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA).如图 6所示, 主成分1和主成分2分别能够解释微生物群落结构变异的39.53%和31.93%.对照、CW-15、CW-50和CW-90分布较离散, 说明微生物群落结构间存在一定的差异.其中CW-50和CW-90空间距离较近, 而与CW-15距离较远, 说明暴露于不同粒径ZnO NPs的微生物群落结构有明显差异.
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图 6 暴露于不同粒径ZnO NPs下微生物群落PCoA分析 Fig. 6 PCoA of unweighted UniFrac distances of microbial communities exposed to different sized ZnO NPs |
如图 7所示, Venn图中展示的样品间共有和特有的OTUs.对照、CW-15、CW-50和CW-90这4个样品的总OTUs是1406个, 其中936个为四者共有(占总OTUs的68.5%), 这说明某些微生物种群在暴露于不同粒径ZnO NPs前后一直存在.这936个共有OTUs中, 最优势菌门是Proteobacteria(占总OTUs的29.2%), Bacteroidetes次之(24.4%).对照、CW-15、CW-50和CW-90 4个样品中独有的OTUs分别为25个、18个、6个和25个, 它们共占总OTUs的5.26%. CW-50和CW-90的2个样品间具有最多相同的OTUs(1107个), 这与PCoA的结果一致.
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图 7 暴露于不同粒径ZnO NPs下微生物群落的Venn图(97%相似度)及其共有OTUs在门水平上的分类 Fig. 7 Venn diagram of microbial communities exposed to different sized ZnO NPs based on OTUs (97% similarity), and the taxonomic identities of the shared OTUs at the phylum level |
为了研究不同粒径ZnO NPs对微生物群落结构的影响, 在门水平上进行分析(图 8).测序结果表明, 对照与CW-15、CW-50和CW-90中主要包括：变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)及浮霉菌门(Planctomycetes)等52个菌门的微生物.其中, Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Nitrospirae和Firmicutes是4个反应器中的优势微生物种群, 分别占对照、CW-15、CW-50和CW-90中微生物总量的92.3%、92.3%、91.4%和90.9%.有研究表明, 人工湿地底泥优势菌种以Proteobacteria、Chloroflexi和Acidobacteria为主, 所占比例高于80%[26]. 4个反应器中Proteobacteria都是最多的菌门, 占微生物总量的比例依次为39.1%、39.4%、38.9%和43.9%, 作为活性污泥系统中最重要的一类细菌, 其在系统中所占比例的增加一定程度上可以理解为活性污泥系统对投加纳米污染物这一外界冲击表现出的适应与抗性[27]; Bacteroidetes次之, 分别为32.6%、33.2%、30.2%和27.4%, 这与其他学者的研究结果一致[28].上述变化表明, 暴露于不同粒径的ZnO NPs后, CW的微生物群落结构受到了不同程度的影响, Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Nitrospirae和Firmicutes能够很好适应投加ZnO NPs的环境.
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图 8 不同粒径ZnO NPs下微生物群落在门水平上的分类 Fig. 8 Taxonomic classification of the microbial community exposed to different sized ZnO NPs at the phylum level |
为进一步阐明不同粒径ZnO NPs对CW中微生物群落的影响, 在属水平上选取优势菌属进行分析(对于占微生物总量的比例小于0.5%的物种统一用“other”表示).如图 9所示, 加入ZnO NPs前后, 4个反应器中的菌属都发生了不同程度的变化.对照反应器中, 占微生物总量的比例较高的菌属(占微生物总量的比例≥2%)依次为Anaerolinea(13.17%)、Lewinella(6.71%)、Methylotenera(6.69%)、Ignavibacterium(5.85%)、Dechloromonas(5.14%)、Terrimonas(3.41%)、Thauera(2.57%)和Acidovorax(2.19%).加入ZnO NPs后, CW-15、CW-50和CW-90中Anaerolinea占微生物总量的比例有所下降, 但依然是最优势菌属, 而Lewinella占微生物总量的比例分别增至7.22%、8.23%和7.85%. Methylotenera和Ignavibacterium在CW-15中占微生物总量的比例有轻微增加, 而在CW-50和CW-90中明显降低. Dechloromonas占微生物总量的比例分别降至4.66%、4.86%和4.80%, 而Terrimonas则无明显变化. Thauera和Acidovorax占微生物总量的比例都有显著增加, 分别增至2.57%、2.75%、4.09%和2.22%、2.45%、2.77%.
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图 9 不同粒径ZnO NPs下微生物群落在属水平上的分类 Fig. 9 Taxonomic classification of the microbial community exposed to different sized ZnO NPs at the genus level |
Anaerolinea属于Anaerolinaceae科, 为常见的发酵菌群, 可将有机物水解转化为能被产甲烷菌直接利用的小分子有机物[29]. Lewinella, 一种水解相关的异养菌, 能够在低温条件下去除有机物[30, 31]. Terrimonas于2006年发现于以甲醇为碳源的反硝化系统, 然而它们的功能还需进一步确认[32, 33].
人工湿地中含氮污染物的去除机制主要有硝化作用、反硝化作用以及氨氧化作用等[34].硝化菌属主要是unidentified_Nitrospiraceae、Nitrosomonas和unidentified_Nitrosomonadaceae, 在4个系统(对照、CW-15、CW-50和CW-90)中所占比例分别为2.41%、2.44%、3.66%和4.44%.而反硝化菌属主要包括Methylotenera、Ignavibacterium、Dechloromonas、Thauera、Acidovorax, 4个系统中反硝化菌属序列数所占比例分别为22.38%、22.35%、17.72%和18.19%.硝酸盐存在的条件下, 会刺激Methylotenera的生长, 而且有研究指出Methylotenera对甲醇代谢可能与反硝化有关[35]. Thauera是广泛存在于废水处理系统自养和/或异养反硝化菌[36], 而Ignavibacterium通常存在于自养脱氮系统[37].在缺氧条件且存在硝酸盐和容易获得的碳源的条件下, Dechloromonas快速增长繁殖[38].有研究发现, Acidovorax能够氧化乙酸钠和H2进行反硝化[39].
4个系统中反硝化菌属丰度均明显高于硝化菌属, 这说明硝化过程可能是制约CW脱氮效果的关键因素, 这归因于HSFCW中的缺氧或厌氧环境更适合反硝化细菌生存所致, 这与其他学者的研究结果一致[28].与CW-50和CW-90相比, CW-15中硝化菌属的丰度最低, 这也是其脱氮性能相对较差的主要原因.
3 结论(1) ZnO NPs(10 mg ·L-1)的粒径(15、50和90 nm)对COD去除无明显影响, 而对脱氮则表现出明显的粒径效应.
(2) 暴露于不同粒径ZnO NPs后, CW中微生物群落多样性和丰富度增大, 而且ZnO NPs粒径越小, 多样性和丰富度增加更加显著.
(3) 暴露于不同粒径的ZnO NPs后, CW中微生物群落结构发生变化, 尤其是小粒径ZnO NPs更为显著.
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