环境科学  2019, Vol. 40 Issue (10): 4718-4724   PDF    
引用本文
张婷婷, 陈书涛, 王君, 王朝辉, 胡正华. 增温及秸秆施用对豆-麦轮作土壤微生物量碳氮及细菌群落结构的影响[J]. 环境科学, 2019, 40(10): 4718-4724.
ZHANG Ting-ting, CHEN Shu-tao, WANG Jun, WANG Zhao-hui, HU Zheng-hua. Effects of Warming and Straw Application on Soil Microbial Biomass Carbon and Nitrogen and Bacterial Community Structure[J]. Environmental Science, 2019, 40(10): 4718-4724.
增温及秸秆施用对豆-麦轮作土壤微生物量碳氮及细菌群落结构的影响
张婷婷1,2, 陈书涛1,2, 王君2, 王朝辉2, 胡正华2     
1. 南京信息工程大学江苏省大气环境与装备技术协同创新中心, 南京 210044;
2. 南京信息工程大学应用气象学院, 南京 210044
收稿日期: 2019-02-14; 修订日期: 2019-04-14
基金项目: 国家自然科学基金项目（41775151，41775152）；江苏省"六大人才高峰"项目（2015-NY-012）
作者简介: 张婷婷(1994~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为土壤微生物与气候变化, E-mail:iamedith@foxmail.com
摘要: 为研究增温和秸秆施用对农田土壤微生物量碳氮和细菌群落结构的影响，设置随机区组试验，试验设置空白（CK）、增温（WA）、秸秆施用（SA）和增温及秸秆施用（WS）这4种处理.分别在大豆生长季和冬小麦生长季采集土壤样品，测定土壤微生物量碳氮，并采用Illumina HiSeq高通量测序法测定土壤细菌群落结构.结果表明，无论是大豆季还是冬小麦田，不同增温及秸秆施用处理的土壤微生物量碳含量均无显著（P>0.05）差异，大豆季增温处理土壤微生物量氮含量显著（P < 0.01）高于对照，且大豆季土壤微生物量氮含量极显著（P < 0.001）高于冬小麦田.大豆季各处理间土壤细菌纲、目、科和属水平上的类群均无显著（P>0.05）差异，冬小麦季不同处理间的细菌群落结构存在显著差异.大豆季CK与WA、SA处理最具优势的芽单胞菌目（Gemmatimonadales）、芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）的细菌比例之间均存在显著（P < 0.05）差异，冬小麦季CK与WA处理最具优势的γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）的细菌比例之间存在显著（P < 0.05）差异.大豆季增温处理的物种数、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数均最小，冬小麦季增温及秸秆施用处理的物种数、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数均最大.大豆季土壤细菌α多样性指标与土壤微生物量碳氮之间存在极显著（P < 0.001）的相关关系，而冬小麦季这些指标之间则不存在类似的关系.
关键词: 增温      秸秆施用      微生物量碳氮      细菌      群落结构     
Effects of Warming and Straw Application on Soil Microbial Biomass Carbon and Nitrogen and Bacterial Community Structure
ZHANG Ting-ting1,2 , CHEN Shu-tao1,2 , WANG Jun2 , WANG Zhao-hui2 , HU Zheng-hua2     
1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Atmospheric Environment and Equipment Technology(CICAEET), Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China;
2. School of Applied Meteorology, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China
Abstract: In order to investigate the effects of warming and straw application on soil microbial biomass carbon and nitrogen and bacterial community structure, a randomized block experiment was performed. Four treatments were included, namely a control (CK), warming (WA), straw application (SA), and warming and straw application (WS) treatments. The soils were sampled during the soybean (Sep. 23, 2017) and winter wheat (April 21, 2018) growing seasons. The soils were used to determine the microbial biomass C and N content using chloroform fumigation methods, and the bacterial community structure was evaluated using high-throughput sequencing (Illumina HiSeq). Results indicated that there was no significant difference in microbial biomass C between different warming and straw application treatments (P>0.05). The microbial biomass N of the warming treatment was significantly higher than that of control in the soybean field (P < 0.01). There were significant differences in the most dominant soil bacteria between treatments in the soybean growing season (P < 0.05) at the class, order, family, and genus levels, while there was no difference in the winter wheat growing season. The percentages of dominant Gemmatimonadales, Gemmatimonadaceae, and Sphingomonas in the CK and WA (or SA) treatments were significantly different (P < 0.05) in the soybean growing season. There was a significant (P < 0.05) difference in the dominant Gammaproteobacteria between the CK and WA treatments in the winter wheat growing season. The observed number of species, Shannon index, Simpson index, and Chao1 index were lowest in the warming plots in the soybean growing season and highest in the warming and straw application plots in the winter wheat growing season. The Shannon index for the WA plots was significantly higher than in the WS plots in the soybean growing season (P < 0.05). The observed number of species, Shannon index, Simpson index, and Chao1 index were significantly higher in the soybean plots than in the winter wheat plots (P < 0.05), while the abundance was significantly higher in the winter wheat plots than in the soybean plots (P < 0.05). The soybean growing season had significantly higher diversity than the winter wheat growing season. The indexes of α diversity were highly significantly correlated with soil microbial biomass C and N in the soybean growing season (P < 0.001), while there was no such correlation in the winter wheat growing season. The indices of α diversity were significantly correlated in both the soybean growing season and winter wheat growing season (P < 0.05).
Key words: warming      straw application      microbial biomass carbon and nitrogen      bacteria      community structure     

温室气体排放导致的全球变暖是当前重要的环境问题. CO2是最主要的温室气体, 其在大气中的浓度升高也是导致全球变暖的最主要原因.全球变暖对生态系统具有重要影响, 不仅会影响生态系统中的生物群落, 而且会导致生态系统碳氮循环发生变化[1].人们一般通过增温试验研究其对生态系统的影响.

细菌是土壤中最重要的一种微生物类型, 其群落结构与温度升高具有密切关系, 同时, 作为土壤碳氮循环重要表征因子的微生物量碳和微生物量氮也随温度升高而发生变化[2].增温对土壤细菌的影响还与其他因子共同起作用[3].

有研究表明, 增温可促进土壤微生物生长并使其活性增强, 这会使微生物量碳氮含量增大[3, 4], Xu等[5]发现一个生长季的短期增温未显著改变森林土壤微生物量碳氮的含量, Frey等[6]进行的12 a增温试验表明, 增温降低了土壤微生物量, 并造成了革兰氏阳性菌和放线菌数量的变化.温度升高条件下磷脂脂肪酸(PLFAs)含量和多样性的下降表明增温可能导致了一些微生物种群在增温压力下的死亡或细胞膜特性的改变[7].秸秆还田是常见的农业管理措施, 尤其是在目前秸秆禁烧的大背景下, 秸秆还田量在逐渐增加, 这对农田土壤微生物也会产生影响.一方面, 增温会直接导致秸秆分解速率加快, 另一方面, 增温会改变微生物群落结构和微生物量, 进而影响秸秆的分解速率, 因而增温和秸秆施用可能存在交互效应.增温导致的秸秆分解速率的变化又可能会影响土壤微生物群落结构和微生物量.有研究表明, 秸秆施用为微生物提供了丰富的碳氮营养源和能源, 从而会提高微生物生物量和微生物群落的生理代谢活性[8, 9].而Bending等[10]发现不同质量秸秆的施用并未导致土壤微生物功能多样性的差异, 他们认为群落生理代谢在秸秆降解过程中有趋同现象, 这一研究结果与李涛等[11]的结果具有一致性.以往关于增温及秸秆施用对农田土壤微生物的影响研究相对较少, 特别是缺乏采用高通量测序法研究农田细菌群落结构对增温及秸秆施用响应规律的研究.

大豆-冬小麦麦轮作是我国主要的农业种植方式之一, 这种农业生态系统中不同生长季节的土壤细菌对增温和秸秆施用如何响应值得探讨.本研究测定不同增温及秸秆施用处理下农田土壤微生物量碳氮的变化规律, 并采用高通量测序法研究土壤细菌群落结构, 这对于评估未来气候变暖和秸秆还田量增加对农田土壤微生物生态系统的影响规律具有重要科学意义.

1 材料与方法 1.1 试验地概况

于2017-10在南京信息工程大学农业气象试验站(32.16°N, 118.86°E)设置了1个农田生态系统长期增温及秸秆还田试验, 作物种植方式为冬小麦-大豆轮作, 冬小麦生长季为每年11月~次年5月, 大豆生长季为每年6~10月.试验田的土壤为黄棕壤.在进行本研究的冬小麦-大豆轮作之前, 试验地田间情况一致, 土质均一, 取0~20 cm土壤样品, 测定了土壤理化性质, 采用1:2.5的土水比浸提法测定的pH值为6.3, 采用重铬酸钾容量法测定的有机碳含量为19.4 g·kg-1, 采用凯氏定氮法测定的全氮含量为1.15 g·kg-1, 采用环刀法测定得到的容重为1.54 g·cm-3, 采用室内环刀法测定得到的田间持水量为25.6%.

1.2 田间试验设计

本研究为一项增温及秸秆施用对农田生态系统影响的长期定位试验的一部分, 该试验开始于2014-11, 采用随机区组试验, 试验地划分为3个区组, 每区组设置对照(CK)、增温(WA)、秸秆施用(SA)和增温及秸秆施用(WS)共4个处理.田间试验小区(2.5 m×2.5 m)共计12个.采用红外辐射加热管对增温小区昼夜增温.增温小区中的增温装置为3个红外辐射加热管, 每个加热管功率250 W.全生长季平均增温幅度为2℃.在冬小麦田翻耕前将大豆秸秆切成10 cm长的寸段施入到秸秆施用的小区中, 施入量为每小区2.86 kg; 在大豆田翻耕前按照每小区2.86 kg的量将冬小麦秸秆切成10 cm长的寸段施入到对应小区中[12].

1.3 土壤样品采集及测定

分别于2017-09-23和2018-04-21采集大豆田和冬小麦田的土壤样品, 采集土壤样品的层次为0~20 cm, 采集的土壤样品用于分析土壤微生物量碳氮含量, 并用高通量测序分析土壤细菌群落结构.

以氯仿对新鲜土壤样品熏蒸24 h后, 被杀死的土壤微生物生物量能够以一定比例被0.5 mol·L-1的K2SO4溶液提取, 并可被定量测定, 根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定的有机碳量的差值和提取效率(或转换系数)来估算土壤微生物量碳和微生物量氮.

利用Illumina HiSeq高通量测序平台进行土壤细菌群落结构测定.本研究中, 在进行细菌群落结构的高通量测序前首先需要从土壤样品中提取微生物DNA, 采用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit(Omega Bio-tek, Norcross, USA)土壤基因组DNA提取试剂盒提取土壤中微生物总DNA, 使用土样约500 mg.采用电泳体系进行纯度检验, 提取的DNA条带大小均在20 kb左右, 可用于PCR扩增检验.用Nanodrop检测DNA浓度及总量, 并进行PCR预扩增检测样品是否合格.土壤样品检测合格后进行可变区域的扩增, 以得到的DNA为总模板, 采用通用引物515F(5′-barcode- GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)对土壤基因组16S rDNA特异片段进行PCR扩增, PCR扩增产物用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测, PCR反应条件：95℃预变性2 min; 25个循环过程：95℃(30 s)、55℃(30 s)、72℃(30 s)、72℃(5 min).扩增后的产物进行质检、纯化以及文库构建, 构建好的文库经Qubit和QPCR定量, 文库合格后, 利用HiSeq进行上机测序.

1.4 数据结果分析

测序得到的原始下机数据用usearch软件对数据进行去嵌合体和聚类的操作, 经拼接和过滤得到清洁标签数据(clean tags), 之后经过嵌合体的去除得到有效数据(effective tags), 基于质控合格的有效数据进行后续生物信息分析, 即根据特定的阈值(默认选取97%)进行OTU聚类, 结合目前最权威的微生物数据库(Unite数据库)进行物种注释和物种分类分析.需对每个样品的tags进行随机抽平处理, 并提取对应的OTU序列.后续基于OTU的分析, 可以获得样品的丰度信息、样本内α多样性指数. α多样性指数包括Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数、覆盖度(goods_coverage)和物种数(observed speciess).通过多种统计比较, 可以挖掘样品之间的群落结构和物种组成差异.采用Excel和SPSS统计软件对所得数据作图并进行单因素方差分析.

2 结果与分析 2.1 土壤微生物量碳和微生物量氮

方差分析表明, 无论是对于大豆季还是冬小麦季, 不同增温及秸秆施用处理的土壤微生物量碳含量均无显著(P>0.05)差异, 且大豆季和冬小麦季的土壤微生物量碳含量无显著(P>0.05)差异[图 1(a)].冬小麦季不同增温及秸秆施用处理的土壤微生物量氮含量均无显著(P>0.05)差异, 大豆季WA处理土壤微生物氮含量差异显著(P < 0.01)高于CK, 且大豆季土壤微生物量氮含量差异极显著(P < 0.001)高于冬小麦季[图 1(b)], 例如大豆季的CK土壤微生物量氮含量为(86.7±1.82) mg·kg-1, 而冬小麦季的CK土壤微生物量氮含量为(29.40±12.36) mg·kg-1, 前者约是后者的3倍.

图中相同字母表示对于大豆或冬小麦季而言不同处理间无显著差异(P>0.05), 不同字母表示处理间存在显著差异(P < 0.05) 图 1 不同处理的土壤微生物量碳及微生物量氮含量 Fig. 1 Soil microbial biomass C and N for the different treatments

2.2 土壤细菌群落结构

表 1为大豆季和冬小麦季不同增温及秸秆施用处理下纲、目、科和属水平上的细菌优势类群相对丰度.大豆季在纲水平上的优势纲为酸杆菌纲(Acidobacteria)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)等.大豆季最占优势的目为芽单胞菌目(Gemmatimonadales), 根瘤菌目(Rhizobiales)的占比也较大.大豆季的最具优势科为芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae), 最具优势的属为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas).各处理间土壤细菌纲、目、科和属水平上的类群均无显著(P < 0.05)差异.

表 1 增温及秸秆施用对纲、目、科和属水平上细菌优势类群相对丰度的影响1)/% Table 1 Effects of warming and straw application on the relative abundance of dominant soil bacterial at the class, order, family, and genus levels/%

冬小麦季在纲、目、科和属水平上细菌优势类群的相对丰度与大豆季明显不同, 在纲、目、科、属水平上细菌最占优势的类群分别为γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和假单胞菌属(Pseudomonas).不同增温及秸秆施用处理间的细菌群落结构存在显著差异.

2.3 土壤细菌群落多样性

描述土壤细菌多样性的主要指标为α多样性.方差分析表明, 大豆季WA处理的Shannon指数显著(P < 0.05)小于WS处理(表 2); WA处理的物种数、Simpson指数和Chao1指数均最小, 且WA处理的覆盖度最大, 虽然WA与其他处理在0.05水平上无显著差异, 但与其他处理存在边际显著差异(0.05 < P < 0.1), 例如, WA处理的Chao1指数低于SA处理(P=0.054).冬小麦季WS处理的物种数、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数最大, 其中WS与WA处理的Simpson指数和Chao1指数达到显著(P < 0.05)差异水平, 这表明增温及秸秆施用导致了土壤细菌群落多样性的增大.

表 2 不同处理下土壤细菌α多样性1) Table 2 The α diversity of soil bacteria for the different treatments

2.4 土壤细菌α多样性指标及微生物量碳氮之间的相关关系

Pearson相关分析表明(表 3), 大豆季土壤细菌α多样性指标与土壤微生物量碳氮之间存在极显著(P < 0.001)的相关关系, 例如观察到的土壤细菌物种数与土壤微生物量碳和微生物量氮之间的相关系数分别为-0.626和-0.826, 物种数随土壤微生物量碳氮的增大而减小, 且Shannon指数和Simpson指数随土壤微生物量氮的增大而减小.与大豆季不同, 冬小麦季土壤细菌α多样性指标与土壤微生物量碳氮之间无显著(P>0.05)的相关关系.此外, 无论是大豆季还是冬小麦季, 各个α多样性指标之间存在极显著(P < 0.001)的相关关系.

表 3 土壤细菌α多样性指数及微生物碳氮之间的相关关系1) Table 3 Correlation between α diversity of soil bacteria and microbial C and N content

3 讨论 3.1 增温及秸秆施用对土壤微生物量碳氮的影响

以往关于增温及秸秆施用对土壤微生物量碳氮的影响的研究结果存在差异.李娜等[13]在高寒草甸进行的模拟增温试验发现, 较低和较高增温幅度导致土壤微生物量碳氮含量呈现出截然相反的响应规律. Xu等[14]也报道, 在较低增温幅度(< 1℃)的情况下, 土壤微生物量碳氮含量显著增加, 而增温幅度在2℃以上时, 会显著降低土壤微生物量碳氮的含量.李世清等[15]发现土壤微生物量氮与土壤温度呈显著或极显著正相关关系.本研究发现增温及秸秆施用对土壤微生物量碳无显著影响, 但增温显著提高了微生物量氮含量. Liu等[16]认为仅在低增温幅度时植物地上和地下部分新鲜碳源供应量的增加能提高土壤微生物活性和生长速度, 并进一步提高土壤微生物量碳含量; 在增温幅度较大时, 增温导致的土壤水分的蒸发可能会抑制土壤微生物增长, 从而降低微生物量碳含量[17].本研究的增温幅度为2℃, 是适度的增温, 这可能是造成增温对土壤微生物量碳无影响的原因. Xu等[14]报道的中等(1~2℃)和高增温幅度(>2℃)会导致土壤微生物量氮含量的增大等现象也与本研究结果一致.有研究表明, 秸秆施入土壤中, 具有和氮肥相当的供氮能力[18, 19]. Singh等[20]在热带旱地生态系统中进行的不同外源物料施加对土壤微生物量影响的研究表明, 施加外源物料中含有低碳或难降解碳会降低土壤微生物量, 含易分解碳氮的秸秆会增加部分微生物量.汤宏等[21]的研究发现不同水分管理方式对不同秸秆还田量下土壤微生物量碳氮的影响规律存在差异.本研究表明秸秆施用对土壤微生物量碳氮无显著影响, 但大豆季土壤微生物量氮显著高于冬小麦季, 这可能与大豆季具有很强的固氮作用有关[22~25].

3.2 增温及秸秆施用对土壤细菌群落结构的影响

本研究采用16S rRNA高通量测序的方法研究了增温及秸秆施用对农田土壤细菌群落结构的影响, 这种高通量测序的方法比传统的DGGE分析细菌群落结构的方法更为精确[26].大豆季和冬小麦季在细菌群落结构上存在明显差异, 在大豆季占优势的细菌类群(如根瘤菌目)在冬小麦田则不占优势.

以往关于增温和秸秆施用对土壤微生物群落结构的影响的研究结果存在争议.熊金波等[27]在青藏高原的研究发现, 短期的增温处理对土壤细菌的群落结构产生了显著的影响, 但是群落多样性和丰富度没有明显改变.王军等[28]的研究表明短期增温并未对土壤微生物量和群落结构产生明显影响. Rinnan等[29, 30]和王学娟等[31]在苔原生态系统的研究表明, 增温会改变土壤微生物群落结构, 但由于研究区域不同, 土壤类型等不同, 会呈现不同响应方式.以秸秆还田为主的有机肥能够增加微生物活力, 改善土壤中微生物群落结构和提高土壤质量[32].秸秆等外源有机物料的添加提供作物生长所必需的元素, 利于根系生长和根系分泌物质, 使得土壤细菌更加活跃, 进而对根际效应关系密切的变形杆菌门和酸杆菌门等产生影响, 促进了相关细菌类群的相对丰度.郭梨锦等[33]报道秸秆还田不仅显著提高了细菌数量, 而且提高了微生物多样性和丰富度.本研究结果表明, 增温及秸秆施用对大豆田在纲、目、科和属水平上的土壤细菌优势类群相对丰度无显著影响, 但对冬小麦田产生了影响, 这与熊金波等[27]和王军等[28]的研究结果一致.本研究虽然未发现秸秆施用导致土壤细菌多样性显著增大, 但秸秆施用处理的物种数、Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和覆盖度均显著高于对照, 这也与以往结果一致[30].

表 3表明, 随着土壤微生物量氮营养条件的丰富, 土壤细菌的多样性随之减小, 这与马慧君等[34]的研究结果一致, 且在土壤环境中, 土壤微生物量碳氮主要来自细菌[35].与大豆季不同, 冬小麦季土壤细菌α多样性指标与土壤微生物量碳氮之间无显著(P>0.05)的相关关系, 这可能与大豆田本身具有生物固氮机制有关, 大豆田土壤的某些细菌与固氮作用有关, 从而影响到土壤细菌群落结构和多样性, 而冬小麦田土壤细菌固氮能力较弱, 固氮菌不是优势类群, 这导致冬小麦田土壤微生物量碳氮与细菌多样性无显著相关关系.

4 结论

(1) 不同增温及秸秆施用处理对大豆及冬小麦季土壤微生物量碳含量均无显著影响, 但增温显著提高了大豆季土壤微生物量氮含量.大豆季土壤微生物量氮含量显著高于冬小麦季.

(2) 大豆季各处理间土壤细菌纲、目、科、属水平上的类群均无显著差异, 但冬小麦季不同增温及秸秆施用处理的土壤细菌类群存在显著差异.

(3) 大豆季增温处理的Shannon指数显著小于增温及秸秆施用处理, WA处理的物种数、Simpson指数、Chao1指数均最小, 且WA处理的覆盖度最大.冬小麦季WS处理的物种数、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数最大.由此表明增温及秸秆施用导致了土壤细菌群落的多样性增大.

(4) 大豆季土壤细菌α多样性指标与土壤微生物量碳氮之间存在极显著的相关关系, 而冬小麦季则不存在类似的关系.

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