环境科学  2019, Vol. 40 Issue (10): 4678-4684   PDF    
引用本文
张海丰, 史明明, 孙艳梅, 程首涛, 高浩泽, 王旭明. 磺胺甲唑污染土壤中微生物群落结构与抗生素抗性基因的分布特征[J]. 环境科学, 2019, 40(10): 4678-4684.
ZHANG Hai-feng, SHI Ming-ming, SUN Yan-mei, CHENG Shou-tao, GAO Hao-ze, WANG Xu-ming. Microbial Community Structure and the Distribution of Antibiotic Resistance Genes in Soil Contaminated by Sulfamethoxazole[J]. Environmental Science, 2019, 40(10): 4678-4684.
磺胺甲唑污染土壤中微生物群落结构与抗生素抗性基因的分布特征
张海丰1, 史明明1,2, 孙艳梅2, 程首涛2, 高浩泽2, 王旭明2     
1. 东北电力大学化学工程学院, 吉林 132012;
2. 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 北京 100097
收稿日期: 2019-03-18; 修订日期: 2019-05-14
基金项目: 国家重点研发计划项目（2016YFD0800205）；北京市农林科学院青年基金项目（QNJJ201829）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20170302）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31800098）；北京市自然科学基金项目（5192005）；家禽产业技术体系北京市创新团队专项（BAIC04-2019）
作者简介: 张海丰(1974~), 男, 博士, 主要研究方向为环境生物技术, E-mail:zhftju@163.com
通信作者: 孙艳梅, E-mail:sunyanmei2001@126.com
摘要: 采用盆栽实验模拟磺胺甲唑污染，通过Illumina高通量测序研究了土壤微生物群落组成的变化，应用普通PCR和微滴数字PCR技术分析了6种抗生素抗性基因的64个抗性基因亚型的分布特征.结果表明，土壤受不同浓度磺胺甲唑污染120 d后，土壤真菌的多样性无明显变化（P>0.05），但土壤细菌的多样性显著降低了（P < 0.05），土壤细菌和真菌群落结构均发生显著改变，且不同浓度磺胺甲唑处理土壤的优势细菌与真菌在属水平上存在明显差异.磺胺甲唑污染使土壤中抗生素抗性基因的多样性增加，且能显著提高磺胺抗性基因sul1的丰度（P < 0.05），但对磺胺抗性基因sul2、喹诺酮抗性基因floR与cmlA1、四环素抗性基因tet（34）、tetG2、tetG1、tetM与tetA/P的丰度均无显著性影响（P>0.05）.
关键词: 磺胺甲唑      土壤      微生物群落      微滴数字PCR      抗生素抗性基因     
Microbial Community Structure and the Distribution of Antibiotic Resistance Genes in Soil Contaminated by Sulfamethoxazole
ZHANG Hai-feng1 , SHI Ming-ming1,2 , SUN Yan-mei2 , CHENG Shou-tao2 , GAO Hao-ze2 , WANG Xu-ming2     
1. School of Chemical Engineering, Northeast Electric Power University, Jilin 132012, China;
2. Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: A pot experiment was carried out to simulate soil contaminated by sulfamethoxazole at different concentrations. The community structure of soil microorganisms was investigated using Illumina high-throughput sequencing, and 64 subtypes of antibiotic resistance genes (ARGs) resistant to six classes of antibiotic were also analyzed by PCR and droplet digital PCR. The results showed that soil contamination with sulfamethoxazole had no significant effect on fungal diversity after 120 days (P>0.05) whereas bacterial diversity was significantly reduced (P < 0.05). The microbial community structure of the contaminated soil changed significantly, with the dominant bacterial and fungal genera being significantly different from the control soil. Sulfamethoxazole contamination resulted in an increase in ARG diversity, and the abundance of the sulfonamide resistance gene sul1 increased significantly (P < 0.05). However, the abundance of the sulfonamide resistance gene sul2, the quinolone resistance genes floR and cmlA1, and the tetracycline resistance genes tet(34), tetG2, tetG1, tetM, and tetA/P did not show significant changes in the contaminated soil (P>0.05).
Key words: sulfamethoxazole      soil      microbial community      droplet digital PCR      antibiotic resistance genes     

抗生素作为抗感染药物, 在治疗人畜感染性疾病、促进动物生长方面发挥着重要作用, 但其大量不规范使用引起环境中抗生素与耐药菌富集, 已成为人类健康的潜在威胁.我国每年约使用16.2万t抗生素, 约占世界用量的一半, 其中52%为兽用[1].进入动物体内的抗生素有30%~90%以原药或初级代谢产物的形式通过排泄物释放到环境中[2].据2013年统计, 中国每年向环境中释放的抗生素约5.38万t, 兽用中广泛应用的四环素类、磺胺类以及喹诺酮类抗生素占释放总量的44%[3].已有研究表明, 污水处理厂污泥中磺胺甲基嘧啶的含量高达139 mg·kg-1, 液态猪粪中磺胺类抗生素的质量浓度达0.05~38.4 mg·kg-1 [4, 5].

关于磺胺类抗生素的环境行为研究, 主要集中在磺胺类抗生素及相关抗性基因在土壤、水体、动植物中的残留与分布特征分析[6~10], 各种磺胺类抗生素在土壤中的吸附迁移分析[8], 降解菌株筛选[11, 12], 以及对土壤微生物生物量的作用[13]等.然而不同浓度的磺胺类抗生素污染对土壤微生物多样性与抗生素抗性基因的影响是否存在一定差异, 仍缺乏系统研究.

针对上述问题, 本文选择磺胺类抗生素中应用广泛、且半衰期较长的磺胺甲唑为研究对象, 通过蔬菜盆栽实验, 模拟磺胺甲唑污染.以此来探讨不同浓度磺胺甲唑对土壤微生物群落结构与抗生素抗性基因分布特征的影响, 以期为磺胺类抗生素的生态风险评价和安全管理提供理论依据.

1 材料与方法 1.1 盆栽实验设计

于2018年5月中旬至9月在北京市农林科学院玻璃温室内进行盆栽实验.室温20.8~35.4℃, 自然光照.用塑料盆(230×180 mm)装2.5 kg过2 mm筛的农田土壤(取自河北滦平县涝洼乡).实验共设4个处理：空白对照(SC)、低浓度(SL)、中浓度(SM)与高浓度(SH)磺胺甲唑处理, 土壤中磺胺甲唑的含量分别为0、100、200和300 mg·kg-1, 每个处理设置3个重复.选取颗粒饱满的生菜种子播种, 覆土1 cm, 每盆留苗1棵.每2 d浇一次水, 土壤含水率约为15%.为保证光照的一致性, 每2 d随机调换盆的位置. 120 d后结束实验, 采集土壤样品, 保存于-80℃, 用于DNA的提取.

1.2 土壤微生物群落结构分析

取0.25 g土壤, 用试剂盒PowerSoil DNA Isolation Kit(Mobio, USA)提取土壤微生物基因组DNA.用Qubit® assays分析DNA浓度.应用Illumina HiSeq平台(诺禾致源生物信息公司, 北京)对细菌16S rRNA V3-V4区(引物341F/518R, 341F: 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′; 518R: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)和真菌ITS区(引物ITS1F/ITS2R, ITS1F: 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3′; ITS2R: 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)进行高通量测序, 分析磺胺甲唑污染后土壤微生物群落组成的变化.将HiSeq测序得到的原始数据进行拼接和质控, 再进行嵌合体过滤, 得到可用于后续分析的有效数据.对样品的全部序列与数据库进行比对分析, 相似度高于97%的序列聚类为一个OTU.

1.3 土壤中抗生素抗性基因分析

应用普通PCR对不同处理土壤中的喹诺酮类、磺胺类、甲氧苄啶、红霉素、四环素以及多黏菌素这6种抗生素的64个抗性基因亚型进行普通PCR分析, 抗生素抗性基因PCR的引物依据文献[14]设定.依据普通PCR结果, 对检测阳性且条带清晰的11种抗生素抗性基因亚型, 包括磺胺抗性基因(sul1、sul2)、四环素抗性基因[tetM、tetA/P、tet(34)、tetG1、tetG2]和喹诺酮抗性基因(qnrS1、qnrS2、cmlA1、floR)进行定量检测.抗性基因的定量检测采用微滴数字PCR(Droplet digital PCR, ddPCR)(Bio-Rad, USA). ddPCR反应条件为：94℃预变性5 min、94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min, 39个循环, 72℃延伸10 min.以土壤基因组DNA为模板, 用无菌水为阴性对照, 反应体系包含12.5 μL EverGreen Supermix(Bio-Rad, USA), 正向和反向引物各0.25 μL, 1.25 μL DNA模板, 最后无菌水补充至25 μL.采用自动微滴生成仪(QX200 droplet generator, Bio-Rad, USA)生成微滴.设置程序进行PCR扩增后, 将96孔板置入微滴读取仪MyCycler Thermocycler中读取信号, 分析数据, 获得绝对定量结果.

1.4 数据分析处理

对Illumina高通量测序的数据进行过滤、质控获得高质量的测序数据, 将其与SILVA的SSU rRNA数据库比对进行物种注释分析, 得到所有OTU代表序列的微生物系统发育地位.通过Mothur计算香农指数、辛普森指数与覆盖率, 以评估测序深度是否足以反映样品中微生物的组成, 比较不同处理中微生物多样性的差异.采用R语言vegan软件包绘制非度量型多维尺度(NMDS)图, 分析不同处理中总的微生物组成的差异.利用R语言pheatmap软件包绘制热图, 对比分析不同处理中优势微生物种属差异.采用R语言TukeyHSD方法对不同处理是否存在差异进行统计分析.应用Origin绘图软件进行柱形图、箱型图与散点图的绘制.

2 结果与讨论 2.1 磺胺甲唑对土壤微生物多样性与群落结构的影响 2.1.1 土壤细菌及真菌的多样性指数

各处理土壤样品细菌与真菌测序的覆盖率在99.2%~99.8%, 表明测序结果可以反映土壤的微生物组成(表 1).对不同浓度磺胺甲唑污染土壤的细菌与真菌多样性进行分析, 结果显示空白组细菌的香农指数显著高于3个磺胺甲唑处理组(P < 0.05);几个处理中真菌的香农指数处于同等水平; 不同处理下细菌与真菌的辛普森指数变化均不大(表 1).以上结果表明, 磺胺甲唑污染显著降低了土壤细菌的多样性, 对真菌的多样性无显著影响.已有研究表明, 水稻土受兽用抗生素污染后可引起细菌多样性降低[15].以上结果与磺胺药物的功能相关, 即磺胺类药物的化学结构与细菌生长所需的氨基苯甲酸很相似, 可与氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶, 妨碍二氢叶酸的形成, 最终影响细菌核蛋白的合成, 从而抑制细菌的生长繁殖[16].

表 1 不同浓度磺胺甲唑对土壤细菌及真菌多样性的影响1) Table 1 Effects of different sulfamethoxazole concentrations on soil bacterial and fungal diversity

2.1.2 土壤微生物的群落结构

依据不同处理土壤样品的OTUs组成, 对样品进行NMDS分析.由细菌NMDS分析可以看出, 空白组与施加磺胺甲唑的3个处理组明显分开, SL、SM与SH处理组分别聚在一起, 施加磺胺甲唑的浓度越高与空白组的细菌组成差异越大[图 1(a)].真菌NMDS分析亦表明, 空白组与处理组明显分开, 施加不同浓度磺胺甲唑的3个处理组真菌群落结构相似[图 1(b)], 以上结果表明, 土壤受磺胺甲唑污染后, 可显著改变土壤微生物群落结构.

图 1 不同浓度磺胺甲唑对土壤微生物群落组成的影响 Fig. 1 Effect of different sulfamethoxazole concentrations on microbial composition

从门的分类水平看, 各处理土壤中的优势细菌类群为放线菌门(Actinbacteria)占44.3%~50.6%, 变形菌门(Proteobacteria)占14.5%~16.3%, 厚壁菌门(Firmicutes)占9.9%~11.5[图 2(a)].土壤中的优势真菌为子囊菌门(Ascomycota)占60%~75%, 担子菌门(Basidiomycota)占5%~30%, 接合菌门(Zygomycota)占9%~19%. SH处理组中担子菌门的相对丰度明显高于SC空白对照组, 而子囊菌门与结合菌门低于SC空白对照组[图 2(b)].以上结果表明, 土壤受磺胺甲唑污染未改变优势菌门, 但改变了其丰度, 尤其是高浓度磺胺甲唑污染对真菌的组成影响较大.其它研究中也表明土壤受抗生素污染后, 其中放线菌门与厚壁菌门的丰度会发生变化[15], 表明这两大门类中的微生物对抗生素较为敏感.磺胺类抗生素主要作用为抑制细菌生长, 土壤真菌的多样性未发生明显的改变, 但土壤中的担子菌门的相对丰度发生显著变化, 这可能是土壤受磺胺类抗生素污染后, 土壤的微生态环境的变化间接影响了真菌的组成.

图 2 不同磺胺甲唑浓度对土壤中细菌及真菌优势菌门的作用 Fig. 2 Effects of different sulfamethoxazole concentrations on the predominance of bacterial and fungal phyla in soil

为进一步分析磺胺甲唑对土壤微生物属的影响, 选取丰度排名前35的属进行聚类绘制成热图(图 3), 以分析不同处理中微生物在属水平的差异.结果表明, 磺胺甲唑处理后土壤优势属发生明显变化, 空白组中的优势属与磺胺甲唑处理组明显不同, SL与SM处理组细菌优势菌属相似, SH处理组菌属组成改变较大.在不施加抗生素的空白组(SC)中, Agromyces、Ensifer、Gaiella、Streptomyces、Rubellimicrobium、Alyslosphaera、Altererythrobacter与Sphingomona占优势. SL处理组中, Skermanella与Paenibacillus为优势属; SM处理组中, Microbacterium、Geobacillus、Bacillus与Brevundimonas的相对丰度较高; SH处理组中, Nitrososphaera、Blaseocatellaceae与Desulfurellaceae为优势属.与空白组相比, 施加磺胺甲唑3个处理组中均富集的微生物为Microvirga、Massilia、Blastococcus与Lysobacter[图 3(a)].施加不同浓度磺胺甲唑处理亦显著改变了土壤优势真菌菌属. SL处理组中, Cystofilobasidium、Metarhizium、Phoma与Scytalidium的相对丰度较高.然而在SM处理组中主要的优势真菌为Cercophora、Fusicolla与Gaertheriomyces. SH处理组中Geastrum、Sphaerodes、Guehomyces与Epicoccum的相对丰度较高.由此可见, 磺胺甲唑污染会显著改变土壤的优势细菌与真菌属.

(a)细菌菌属；(b)真菌菌属 图 3 不同磺胺甲唑浓度下土壤中优势微生物属差异比较 Fig. 3 Differences of dominant soil genera contaminated with different concentrations of sulfamethoxazole

对土壤微生物优势属对比分析发现, 3个磺胺甲唑处理组中均富集了一些抗生素抗性菌, 如Massilia与Lysobacter等. Massilia隶属于β-变形菌纲草酸杆菌科, 主要分离于病人、土壤与水环境, 已报道的Massilia中的很多菌种(如Massilia aurea等)对青霉素、杆菌肽与头孢噻吩具有抗性[17]. Lysobacter是革兰氏阴性需氧菌, 属于γ-变形菌纲的黄单胞菌科, 存在于土壤和淡水栖息地, 前人研究发现Lysobacter是新型抗生素的潜在来源, 可生产青霉素、头孢菌素类、大环内酰胺类、环肽等抗生素复合物[18, 19].可见Massilia与Lysobacter对抗生素具有较广谱的抗性, 关于这两类微生物对磺胺甲唑是否具有抗性的相关报道较少, 本研究中3个磺胺甲唑处理组中均富集了Massilia与Lysobacter, 表明它们可能对磺胺甲唑也具有抗性.此外, 笔者发现土壤微生物组成随着磺胺甲唑污染浓度的不同而发生明显的改变. SL中富集了一些抗氧化、抗辐射等抗逆性强的细菌, 如Skermamella、Geodermatophilus与Modestobacter等[20, 21].在SM中富集了一些抗生素产生菌与磺胺类抗生素的降解菌如Paenibacillus、Bacillus、Geobacillus、Microbacterium以及Brevundimonas等[22~26].但在SH中, 上述的抗生素产生菌以及降解抗生素的相对丰度低于SL处理, 而是一些氮、硫循环相关的微生物Nitrososphaera与Desulfurella相对丰度较高.分析原因可能是初始的磺胺甲唑浓度较高(土壤中含量为300 mg·kg-1), 破坏了土壤中原有的细菌群落结构, 随着土壤中磺胺甲唑浓度的降低(120 d时降到66.6 mg·kg-1), 高浓度处理组中的微生物群落可能发生了重建的过程.尽管磺胺甲唑的直接作用对象是细菌, 但在土壤受磺胺甲唑污染后, 土壤真菌属组成亦发生明显改变[图 3(b)], 这可能与土壤受磺胺甲唑污染后, 土壤的微生态环境发生改变相关.例如, 土壤细菌与真菌间存在相互作用, 细菌群落组成的改变也许会影响土壤中真菌群落结构[27].此外, 低浓度与中等浓度磺胺甲唑污染处理组的种属组成较为相似而与高浓度污染差异较大, 可能与磺胺甲唑的污染浓度相关.因此, 磺胺甲唑污染显著改变了土壤的微生物群落组成, 且污染浓度越高变化越明显.

2.2 磺胺甲唑对土壤抗生素抗性基因种类与丰度的影响 2.2.1 抗生素抗性基因的定性分析

为明确不同浓度的磺胺甲唑污染是否会引起土壤抗生素抗性基因发生改变, 本研究选择常见的6种抗生素(磺胺、喹诺酮、甲氧苄啶、红霉素、四环素与多黏菌素)的64种抗性基因亚型, 进行普通PCR定性分析(表 2).结果表明, 磺胺抗性基因检出率较多的亚型为sul1和sul2, 喹诺酮抗性基因检出率较高的亚型为qnrS1、qnrS2、gyrA1、cmlA1和floR; 红霉素抗性基因检出率较高的亚型为ermB; 四环素抗性基因检出率较高的亚型为tetA/P、tetM1、tetG1、tetG2、tet(34)与tetM; 多黏菌素抗性基因检出率较高的亚型为pmrB2和phoQ.与空白对照相比, 磺胺甲唑污染会增加土壤抗生素抗性基因亚型的种类, 如喹诺酮类的gyrA2与qnrC; 四环素类的tetA1与tetP1可以在施加中等或高浓度磺胺甲唑的处理中检测到.由此可见, 磺胺甲唑污染可增加土壤中抗生素抗性基因的多样性.

表 2 不同处理中土壤中抗生素抗性基因的定性分析1) Table 2 Qualitative analysis of antibiotic resistance genes (ARGs) in soil under the different treatments

2.2.2 抗生素抗性基因的丰度

土壤中抗生素抗性基因的丰度可以反映土壤中抗生素抗性组的变化, 磺胺甲唑的污染尤其是高浓度污染, 可以增加土壤中抗生素抗性基因亚型, 其是否会引起抗生素抗性基因丰度的变化？为此, 应用ddPCR方法深入研究不同处理中抗生素抗性基因的丰度差异.对抗生素抗性基因定性检测中阳性率较高且电泳检测条带清晰的11种抗性基因亚型进行定量分析.研究结果显示, 磺胺甲唑污染会引起土壤中磺胺抗性基因sul1丰度显著增加(P < 0.05)、提高sul2的丰度(图 4中sul2列显示3个点是因为SM与SH两点重合); 而喹诺酮抗性基因floR、cmlA1、qnrS1与qnrS2的丰度虽然有增加趋势, 但与对照相比无显著性差异(P>0.05). 4种处理的四环素抗性基因中, tet(34)的丰度最高(9.42×105~1.24×106 copies·g-1), 其次分别为tetG2、tetM、tetG1与tetA/P(图 5).与对照土壤相比, 磺胺甲唑处理组中上述几种四环素抗性基因亚型均呈现增加趋势(图 5), 但无显著性差异(P>0.05).以上结果表明, 磺胺甲唑污染可显著增加土壤中磺胺抗生素抗性基因丰度, 但对喹诺酮与四环素抗性基因的丰度影响不大.

图 4 磺胺甲唑污染对土壤中磺胺与喹诺酮抗性基因丰度的影响 Fig. 4 Effect of different sulfamethoxazole concentrations on the abundance of sulfonamide and quinolone ARGs in soil

图 5 磺胺甲唑污染对土壤四环素抗性基因亚型丰度的影响 Fig. 5 Effect of different sulfamethoxazole concentrations on soil tetracycline ARG subtypes

抗生素污染对环境中的抗性基因具有一定的选择性压力, 土壤中检测到抗生素浓度高的土层, 抗性基因的丰度也较高[28, 29].本研究也显示磺胺甲唑污染土壤中不仅富集了一些抗生素抗性与降解菌, 且增加了土壤中磺胺抗性基因的丰度.已有报道表明, 抗生素与其同类或不同类的抗生素抗性基因之间存在显著的正相关性[30, 31].本研究中, 磺胺甲唑污染土壤中四环素与喹诺酮抗性基因的丰度没有明显增加, 可能还与盆栽实验周期较短有关, 后续需要关注抗生素污染对土壤抗生素抗性基因的长期影响.

3 结论

(1) 温室盆栽实验模拟土壤磺胺甲唑污染, 经过120d盆栽实验后, 土壤中的微生物发生明显变化.磺胺甲唑污染可显著降低土壤细菌的多样性, 对真菌多样性的影响较小.

(2) 高浓度磺胺甲唑污染对真菌优势菌门的相对丰度影响较大; 高、中、低浓度磺胺甲唑污染均显著改变了土壤优势细菌与真菌的种属组成, 富集了一些生产抗生素复合物的菌属.此外, 低浓度磺胺甲唑污染土壤中富集了抗氧化、抗辐射的菌群; 中、高浓度磺胺甲唑污染土壤中富集了抗生素产生菌与磺胺类抗生素的降解菌群.

(3) 磺胺甲唑污染会增加土壤中抗生素抗性基因的多样性, 显著增加磺胺抗性基因sul1的丰度, 提高sul2的丰度; 对喹诺酮抗性基因floR、cmlA1、qnrS1、qnrS2和四环素抗性基因tet(34)、tetG2、tetM、tetG1、tetA/P丰度无显著性影响.

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