2019, Vol. 40
2. 南京大学环境学院, 环境科学与工程国家级实验教学示范中心, 南京 210023
2. State Experimental Teaching Demonstration Centre for Environmental Science and Engineering, School of Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China
自2004年Thompson等[1]在海洋水体和沉积物中发现塑料碎片以来, 微塑料作为一种新型持久性环境污染物逐渐成为国内外的研究热点之一[2].通常将粒径＜5 mm的塑料碎片或颗粒定义为微塑料[1, 3], 目前在全球范围内的大气[4, 5]、水体[6, 7]、沉积物[8, 9]、土壤[10, 11]和生物体[12, 13]等环境介质中均有其不同程度的检出.受塑料自身结构和性质影响, 微塑料在自然环境中难以降解, 并且由于具有高疏水性和较高的比表面积, 其表面易吸附周围环境污染物和病原体, 甚至可能通过食物链传递、富集, 对生态系统构成威胁, 产生的环境污染与毒害问题不容小觑[3, 14].已有研究表明, 微塑料进入生物体内会引起一系列生态毒理学效应, 包括细胞毒性、遗传毒性、神经毒性、生殖毒性、氧化应激及损伤和行为异常等, 甚至造成生物死亡[15].
相较于水生生态系统, 现阶段有关土壤生态系统中微塑料的研究较少[16, 17].土壤作为人类赖以生存的环境及物质交换基础, 与人类接触尤为密切.然而, 一些污水、污泥的土地利用和塑料薄膜覆盖物的大量使用, 加剧了土壤塑料废弃物污染, 造成土壤微塑料积累[18], 久而久之对土壤理化性质及物质循环产生潜在的不利影响[10].迄今, 关于土壤中微塑料含量及其分布的报道还很有限[19]. Zhang等[11]对我国西南地区土壤团聚体的调查显示, 微塑料平均丰度为18 760个·kg-1. Scheurer等[20]的研究也发现, 瑞士洪泛平原中有最高含量达55.5 mg ·kg-1的微塑料检出.因此, 土壤环境中微塑料污染及其生态毒理效应逐渐引起相关学者的关注[21].
目前, 微塑料对土壤生物毒性效应的研究才刚刚起步.有研究表明, 土壤动物蚯蚓能摄食微塑料[22], 高浓度微塑料造成蚯蚓明显肠道损伤[23], 抑制其生长并增加死亡率[24].此外, 微塑料的暴露还能改变弹尾虫和线蚓的肠道微生物多样性及群落结构[25, 26].然而, 微塑料对植物影响的研究鲜见报道[2].植物是生态系统的生产者, 也是生物蓄积的起点, 长期存留在土壤中的微塑料很有可能形成纳米塑料[18, 27], 被迁移并积聚在植物中, 再通过食物链被摄入体内, 最终导致人体暴露, 对生态环境和人类健康构成风险[28].因此, 开展土壤中微塑料对植物的毒性效应研究已刻不容缓.
本研究选取陆生高等植物小麦(Triticum aestivum)为试验作物, 采用水培和土培方式, 分析纳米级(100 nm)和微米级(5 μm)聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)对其生长, 光合色素和可溶性蛋白含量、抗氧化酶和淀粉酶活性等生理生化指标的影响, 以期为评估微塑料对植物的毒性效应及其作用机制提供基础数据和科学依据.
1 材料与方法 1.1 试验材料小麦(Triticum aestivum L.)购自北京市某市场, 籽粒饱满, 状态健康.
聚苯乙烯荧光微球(fluorescent polystyrene microspheres, PS-MPs)购自天津市某色谱技术开发中心, 粒径分别为100 nm和5 μm. 100 mg聚苯乙烯微球分装在10 mL去离子水-乙醇(1:1, 体积比)乳浊液中, 固含量1%(质量浓度), 于4℃冰箱贮存.
1.2 试验方法 1.2.1 微塑料表征将聚苯乙烯荧光微球原液[100 mg ·(10 mL)-1]稀释一定倍数, 稀释前后均超声处理10 min(120 W)以进行分散, 用透射电子显微镜(TEM, Jeol 2100F, 日本Jeol公司)表征微塑料的形貌, 激光粒度仪动态光散射(DLS, Zetasizer Nano-S, 英国Malvern公司)验证其粒径分布.
1.2.2 植物培养选取均一饱满的小麦种子, 蒸馏水浸泡30 min, 弃去浮于水面的种子.剩余种子经1% H2O2浸泡消毒30 min后, 用蒸馏水冲洗3次.将消毒后的种子置于蒸馏水中浸泡12 h, 滤纸吸干表面水分后用于试验.
(1) 水培 水培试验在培养皿中进行.将表面消毒的15粒种子均匀放入铺有消毒滤纸的培养皿中, 分别向培养皿加入预先配制的不同粒径(100 nm和5 μm)、不同浓度(0、10、20、50、100和200 mg ·L-1)的PS-MPs溶液10 mL.然后置于25℃、80%湿度、明暗12 h/12 h、光照度3 000 lx的恒温恒湿培养箱中培养6 d, 每天适当补充蒸馏水.每个处理设置3个平行.
(2) 土培 土培试验在花盆中进行, 供试土壤采自南京市未受污染的紫金山深处.将土样风干后过20目筛, 加入2种粒径、不同浓度的PS-MPs溶液80 mL, 分别配制PS-MPs含量为0、1、10、50和100 mg ·kg-1的土壤, 分装入盆, 每盆300 g.选取浸泡发芽的小麦种子播种于土中, 每盆15粒, 置室温自然光照下培养10 d.每个处理重复3次.
1.2.3 各毒性指标的测定(1) 形态学指标的测定 分别于试验周期第6 d和10 d, 用厘米尺测量小麦水培、土培条件下的根长、茎长和株高.
(2) 光合色素含量的测定 于试验第10 d, 称取200 mg土培条件下的小麦叶片, 经液氮粉碎后, 加入25 mL 80%丙酮, 离心(4 800 r ·min-1, 10 min)后取上清液, 用酶标仪测定663 nm(叶绿素a)、645 nm(叶绿素b)和470 nm(类胡萝卜素)波长下的吸光度值.用公式计算光合色素含量(mg ·L-1)：
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式中, Chla、Chlb和Car分别表示叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度. A663、A645和A470分别为相应波长下的吸光度值.
(3) 酶活性及可溶性蛋白含量的测定 取剩余液氮粉碎后的土培小麦叶片, 按重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入9倍体积的生理盐水制作10%组织匀浆, 离心(3 500 r ·min-1, 10 min)后取上清液, 用于淀粉酶(AMS)活力检测.另取液氮粉碎后的新鲜土培小麦叶片, 用PBS(0.1 mol ·L-1, pH为7~7.4)制备10%或1%组织匀浆, 离心(3 500 r ·min-1, 10 min)后取上清液, 用于检测小麦叶片过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和可溶性蛋白含量.试验用试剂盒及方法均来自南京建成生物工程研究所.
1.3 数据统计与分析利用Excel 2013和SPSS 19.0软件进行数据分析, 试验数据以平均值±标准偏差(SD)表示, 并用方差分析(ANOVA)进行统计处理, P < 0.05时, 表示处理组与对照组存在显著差异.采用Origin 2017绘图.
2 结果与讨论 2.1 PS-MPs表征通过TEM和DLS对PS-MPs进行相关表征, 结果如图 1所示.本试验所用100 nm和5 μm PS-MPs在水溶液中呈球状, 平均粒径分别为99.94 nm和5.04 μm, 微塑料溶液体系分布较为均匀, 分散效果良好.
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(a)100 nm PS-MPs TEM图; (b)5 μm PS-MPs TEM图; (c)100 nm PS-MPs DLS图; (d)5 μm PS-MPs DLS图 图 1 聚苯乙烯塑料微球形貌及粒径强度分布 Fig. 1 TEM images and DLS results of PS-MPs |
水培环境中, 不同处理浓度下2种粒径PS-MPs对小麦根长和茎长的影响如表 1所示. 100 nm PS-MPs对小麦生长的作用表现为中、低浓度(0~50 mg ·L-1)暴露时根长逐渐伸长, 茎长先降低后升高; 200 mg ·L-1PS-MPs暴露下根和茎长度均显著低于对照组(P＜0.05), 分别降低了9.25%和13.71%.当PS-MPs处理浓度为50 mg ·L-1时, 小麦根长和茎长均达到最大值.
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表 1 水培条件下聚苯乙烯塑料微球暴露对小麦形态指标的影响1) Table 1 Effects of PS-MPs on the morphology index of wheat (treated with water) |
对于5 μm PS-MPs而言, 随处理浓度的增加, 与对照组相比, 小麦根长和茎长均呈降低趋势. 200 mg ·L-1PS-MPs处理组中, 根长和茎长分别降低67.15%和56.45%, 此时小麦根、茎的伸长受到显著抑制(P＜0.05).与100 nm PS-MPs相比, 5 μm PS-MPs表现出更强的生长抑制作用, 与Jiang等[17]的研究结果相一致.
2.2.2 土培法由表 2可知, 土培条件下, 100 nm PS-MPs对小麦的根长和株高有微弱的抑制作用.随暴露含量增大, 呈根长先降后升、株高先升后降的趋势, 且在10 mg ·kg-1时达到根长最小值和株高最大值, 分别为对照的91.50%和105.75%.
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表 2 土培条件下聚苯乙烯塑料微球暴露对小麦形态指标的影响 Table 2 Effects of PS-MPs on the morphology index of wheat (treated with soil) |
5 μm PS-MPs处理下, 小麦的根长和株高均呈先降后升的趋势, 且在10 mg ·kg-1时分别达到最低值, 与对照相比, 各降低了15.91%和5.94%.当暴露含量达100 mg ·kg-1时, PS-MPs对小麦的生长无明显影响(P＞0.05).
土培试验结果表明, 纳米级(100 nm)和微米级(5 μm)尺寸对小麦生长的影响略有不同, 高含量(100 mg ·kg-1)暴露下, 100 nm PS-MPs对株高的影响更甚, 但总体表现为10 mg ·kg-1 PS-MPs暴露显著抑制根的伸长.
总体而言, PS-MPs暴露对小麦生长具有一定抑制作用, 这与Qi等[2]的研究结果一致. Qi等发现聚乙烯和可生物降解地膜的塑料残留物对小麦的生长造成了不良影响.类似地, 徐荣乐等[29]研究了塑料地膜对小麦种子萌发的影响, 结果显示, 塑料地膜高添加量(15 000 mg ·kg-1)明显抑制小麦芽和根的伸长, 阻碍根系对土壤水分和养分的吸收, 导致植物的新陈代谢需求得不到满足.在本试验中, 两种培养方式下, 水培环境中PS-MPs对小麦的生长抑制作用强于土培, 与陈忠林等[30]的研究结果相似.这可能是由于水培条件下, 悬浮液中的PS-MPs与小麦根系接触更为充分, 且较土壤介质而言, 微塑料在水环境中易于移动并附着于根表面或进入植物体内, 干扰根系对水分的吸收[31, 32].植物细胞壁孔洞约5~50 nm, 因此尺寸较大的塑料颗粒透过细胞壁孔洞被植物吸收的可能性极小[18]. Kalčiková等[33]的研究发现, 30~600 μm聚乙烯微珠可以通过机械阻断显著影响浮萍的根系生长.推测水培条件下高浓度PS-MPs可能通过吸附在小麦种子表皮或根系细胞壁孔洞, 扰乱了种子或根系对水分、营养的正常吸收或运输, 从而导致小麦生长受抑[17].目前有关微塑料与植物相互作用的机制并不清楚, 对此需进一步深入开展相关研究工作.
2.3 土培试验PS-MPs对小麦光合色素的影响光合色素含量的多少能反映植物光合能力的强弱[34].不同粒径、不同含量PS-MPs处理对土培小麦叶片光合色素含量的影响结果如图 2所示.培养10 d后, 小麦叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均随处理浓度的增大呈现先升高后下降的趋势, 且类胡萝卜素变化程度最大.与对照组相比, 2种粒径PS-MPs在中、低含量(0~50 mg ·kg-1)时明显促进植物光合色素含量的增加(P＜0.05), 并在10 mg ·kg-1处达光合色素含量最大值, 且粒径间的差异性不显著.当浓度为100 mg ·kg-1时, 100 nm PS-MPs处理的小麦叶片光合色素含量较对照无显著差异(P＞0.05), 5 μm PS-MPs处理下叶绿素a和类胡萝卜素含量明显降低(P＜0.01), 分别下降13.55%和19.90%.即, 2种粒径PS-MPs对小麦叶片光合色素含量的影响表现为中、低含量(0~50mg ·kg-1)增强小麦叶片光合作用; 高含量(100mg ·kg-1)100 nm PS-MPs对小麦叶片光合作用无明显效应, 而5 μm PS-MPs使其光合色素合成受阻, 表明植物光合系统受到损伤[35], 对小麦叶片存在较为明显的毒害效应. Zhang等[36]研究了单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)对水稻幼苗生长发育的影响, 结果显示低浓度(20 mg ·L-1)暴露能促进水稻幼苗叶绿素含量的增加, 与本试验结果一致.
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与CK相比有显著差异, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01, 下同 图 2 2种粒径PS-MPs处理后土培小麦叶片光合色素含量变化 Fig. 2 Changes of the photosynthetic pigment content of the leaves of wheat with differently sized PS-MPs treatments |
图 3所示为2种粒径PS-MPs对土培小麦叶片POD、SOD和CAT活性的测定结果.结果显示, 100 nm PS-MPs试验组中, 叶片POD活性呈低促高抑现象, 在10 mg ·kg-1达到最大值, 较对照组升高了73.69%, 与100 nm PS-MPs处理下的株高趋势一致(表 2).对于5 μm PS-MPs处理组而言, 中、低含量(0~50 mg ·kg-1)时叶片POD活性先降低后升高, 在50 mg ·kg-1达到最大值, 较对照组升高16.94%, 当含量达100 mg ·kg-1时显著降低POD活性(P＜0.01).表明中、低含量(0~50 mg ·kg-1)的100 nm PS-MPs显著提高小麦叶片POD活力, 高含量(100 mg ·kg-1)暴露时无明显影响; 5 μm PS-MPs对小麦叶片POD活性的影响总体表现为抑制作用.
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图 3 PS-MPs对土培小麦叶片POD、SOD和CAT活性的影响 Fig. 3 Changes in the POD, SOD, and CAT activity in the leaves of wheat treated with PS-MPs |
在本试验含量范围内, 暴露于2种粒径PS-MPs的小麦叶片, 其SOD和CAT含量变化趋势相一致[图 3(b)和3(c)].体现为SOD活性显著降低(P＜0.01); CAT活性呈先降后升的趋势, 低含量(0~10 mg ·kg-1)显著抑制(P＜0.05), 中、高含量(50~100 mg ·kg-1)处理组的CAT含量与对照组差异不显著(P＞0.05).
POD、SOD和CAT是植物抗氧化系统中的主要酶, 其活性水平能反映植物受外界逆境影响的程度. SOD能催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应, 是生物体内清除自由基的首要物质, CAT和POD是清除H2O2的酶, 三者通过协同作用维持植物体内的自由基含量保持稳态水平, 防止由于自由基引起的植物生理生化上的改变[37].本研究结果显示, 2种粒径处理的小麦叶片SOD活性始终低于对照组, CAT活性呈先降低后升高的趋势.酶活性的短暂升高是使机体免受外界胁迫毒害的调节反应, 而活性下降则表示超出自身调节能力的阈值, 酶受到损伤, 表明PS-MPs对小麦毒性的可能机制涉及氧化应激.
可溶性蛋白是植物体内主要渗透调节物质, 其含量变化可以指示外界胁迫对生物生长发育的影响[38].由图 4可以看出, 叶片可溶性蛋白含量随PS-MPs含量的增加, 呈低含量(1 mg ·kg-1)上升、中含量(10~50 mg ·kg-1)下降、高含量(100 mg ·kg-1)上升趋势.当处理含量为10 mg ·kg-1和50 mg ·kg-1时, 100 nm PS-MPs暴露使小麦叶片可溶性蛋白含量显著降低(P＜0.05), 分别为对照的87.50%和86.18%.
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图 4 2种粒径PS-MPs处理后土培小麦叶片可溶性蛋白含量变化 Fig. 4 Changes in the SP content of the leaves of wheat treated with differently sized PS-MPs |
由图 3可知, 1 mg ·kg-1 PS-MPs暴露引起小麦叶片抗氧化酶活性发现显著改变, 此时可溶性蛋白含量的升高可能是机体抵御氧化胁迫的结果.当PS-MPs含量高于10 mg ·kg-1时, 与对照相比, 光合色素含量随处理浓度的增大而显著降低(图 2), 表明PS-MPs对小麦叶片光合系统产生了损害, 影响植物正常代谢活动, 从而导致可溶性蛋白生成受抑.
2.5 土培试验PS-MPs对小麦淀粉酶活力的影响AMS是分解淀粉提供能量的酶. 2种粒径PS-MPs对土培小麦叶片AMS活力的影响如图 5所示.小麦叶片AMS活力随100 nm PS-MPs含量的升高呈先升后降的趋势, 在10 mg ·kg-1时达到最大值.与对照相比, 中、低含量(0~50 mg ·kg-1)PS-MPs均显著提高了AMS活性(P＜0.01), 高含量(100 mg ·kg-1)处理组与对照无明显差异.经5 μm PS-MPs处理后的小麦叶片, 其AMS活力受到抑制, 在试验浓度范围内小麦叶片AMS活力均显著降低(P＜0.05).说明100 nm PS-MPs促进小麦淀粉分解, 5 μm PS-MPs抑制分解代谢.
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图 5 2种粒径PS-MPs处理后土培小麦叶片淀粉酶活力变化 Fig. 5 Changes in the AMS activity in the leaves of wheat treated with differently sized PS-MPs |
有研究评估了陆生植物生理和生化参数之间的定量关系, 并指出多壁碳纳米管纳米材料对植物生化参数的影响较生理指标更敏感[39], 因此生化参数可能是植物对纳米塑料响应的良好指标[18].本研究发现, 土培试验中, 随着PS-MPs含量的增大, 100 nm PS-MPs处理下的小麦叶片光合色素含量(图 2)和叶片AMS含量(图 5), 与5 μm PS-MPs处理下的小麦叶片光合色素含量(图 2)和可溶性蛋白含量(图 4)变化趋势具有一致性, 均先升高后降低, 且在10 mg ·kg-1处达到最大值, 提示选取植物对微塑料的响应指标还需考虑不同暴露含量及粒径的影响.
本试验结果表明, 纳米级和微米级PS-MPs暴露对小麦生长及其生理生化特性产生了一定影响, 但不同粒径、不同浓度或含量PS-MPs诱导植物产生不同效应的内在机制有待进一步研究, 研究结果为深入了解微塑料对土壤-植物生态系统的影响提供了基础数据和科学依据.
3 结论(1) 水培试验中, 2种粒径PS-MPs在高浓度(200 mg ·L-1)下显著抑制小麦根和茎的伸长, 其中, 5 μm PS-MPs较100 nm PS-MPs表现出更强的生长抑制作用.
(2) 土培条件下, 10 mg ·kg-1 PS-MPs对小麦生长影响最为显著.小麦叶片光合色素、可溶性蛋白含量随PS-MPs暴露含量的增加先升后降, 表明PS-MPs对小麦叶片光合系统产生了损害, 阻碍蛋白质的合成.
(3) 本试验含量范围(0~100 mg ·kg-1)内, 随PS-MPs暴露含量增加, 小麦叶片抗氧化酶活性呈SOD活性下降、CAT先降后升的趋势, 说明PS-MPs对小麦毒性的可能机制涉及氧化应激.
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