随着工业化进程的不断深入, 许多行业排放的废水中含有大量的氮和硫.氮不仅会引起水华或赤潮, 在水体中还会被氧化为硝酸盐和亚硝酸盐, 如摄入过量, 则会导致人体中毒.硫酸盐会降低厌氧段的废水处理效率, 还会释放出气体, 味臭有毒, 且具有强烈的腐蚀性^[1~3].

传统去除硫化物的物理、化学方法运行成本高、二次污染严重、且剩余污泥难处理.而生物同步脱硫、脱氮技术具有条件温和、能耗低、投资少等优势, 是目前最经济有效、可行性高的水体脱氮除硫的方法^{[4, 5]}.同步脱氮除硫技术采用厌氧工艺将废水中的硫酸根离子转化为单质硫达到回收目的, 同时将氨氮转化为氮气达到脱氮目的, 以减轻后续好氧处理工艺脱氮的负担^[6~9].

信号分子是生物体内的某些化学分子, 能够调控细菌生理行为, 影响生物的群集运动、聚集生长、胞外多糖的合成和生物膜形成, 同时影响污泥微生物生态组成与功能, 影响菌群结构和优势菌, 适宜浓度的信号分子可能对生物脱氮除硫起到一定作用^[10~12].目前与生物脱氮相关的主要功能菌是革兰氏阴性细菌, 可以通过分泌AHLs(Acyl-homoserine lactones)信号分子刺激菌群生长和代谢的活性. OHHL(N-3-oxo-hexanoyl-homoserine-lactone)作为AHLs类信号分子能够促进硝化污泥生长、提高微生物生长速率、增强硝化污泥活性^[13].

脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)作为生物处理含硫含氮废水中的主要菌属微生物, 在厌氧条件下不仅可以实现同步脱氮、除硫回收单质硫的目标, 而且该工艺无需对反应器进行曝气, 无需外加有机物作为电子受体, 生成的单质硫可进行资源回收^[14~16].但脱氮硫杆菌也存在对温度、进水硫化物浓度等耐受性不强, 反应所生成的单质硫和氮气产量有待提高等问题, 因此利用脱氮硫杆菌的硫自养反硝化和其他技术相结合, 增强其实际应用潜力十分必要^[17].

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术, 其原理是利用荧光标记好的针对微生物DNA上某一特异序列的探针与活性污泥等混合菌进行杂交, 从而将含有探针序列具有互补序列的细菌检测出来的一种方法^[18].目前已在国内外废水处理领域广泛运用, 不仅可测定不可培养微生物的形态特征, 而且可以原位分析他们的空间及数量分布^[19~23].

本研究向200 mg·L^-1和300 mg·L^-1进水硫化物浓度下, 投加不同浓度梯度的OHHL信号分子, 发现当信号分子OHHL浓度为1.0 μmol·L^-1时, 更有利于脱氮除硫反应的进行.因此在此浓度下加入脱氮硫杆菌, 拟将OHHL信号分子与脱氮硫杆菌自养反硝化作用相叠加, 达到更好地脱氮除硫效果.本实验从不同信号分子浓度中找出了有利于单质硫稳定积累的最佳浓度, 并分析了此信号分子浓度下单独投加OHHL信号分子、单独投加脱氮硫杆菌, 以及同时投加OHHL和脱氮硫杆菌3种情况下的脱氮除硫效果, 发现同时投加信号分子和脱氮硫杆菌的脱氮除硫效果优于其单独投加时的效果, 且单质硫和氮气的产量增加.本实验结合FISH技术检测了各反应器中反应结束后微生物总量, 发现信号分子联合菌相比于单独投加时, 其微生物总数增大, 因此具有较好地脱氮除硫效果.

本实验厌氧活性污泥取自陕西省西安市未央区啤酒路1号西安汉斯啤酒厂污水处理站, 实验接种的脱氮硫杆菌与文献[24]中相同, 采用的信号分子为OHHL.含氮硫的废水由人工合成, 实验用水通过煮沸消除溶解氧的影响, 试剂Na₂S·9H₂O提供S^2-, 作为生化反应的电子供体, 试剂NaNO₃提供NO₃^-, 作为生化反应的电子的受体.

本实验分两部分进行, 第一部分分2组进行, 第1组的进水硫化物浓度为200mg·L^-1, 第2组的进水硫化物浓度为300 mg·L^-1, N/S摩尔比均为0.67.每组设置6个容积为1 L的密闭厌氧反应器, 以蒸馏水为溶剂配制500 μmol·L^-1的OHHL溶液, 向各反应器中分别投加不同体积的信号分子溶液, 使其浓度梯度为1.0、2.0, 2.5、3.0、3.5和4.0 μmol·L^-1, 并在每组各反应器中分别加入200 mL厌氧污泥.第二部分实验分2组, 第1组和第2组的进水硫化物浓度分别为200mg·L^-1和300mg·L^-1, N/S摩尔比均为0.67.每组设置3个反应器, 并在每组各反应器中分别加入200 mL厌氧污泥, 每组反应器中实验设计如表 1所示.各反应器中脱氮硫杆菌菌液D₆₀₀均为0.3, 且其培养环境和生长状态相同.

表 1 (Table 1)

表 1 实验设计1) Table 1 Experimental design 项目 第1组实验设计 第2组实验设计 1号 2号 3号 1号 2号 3号 脱氮硫杆菌/mL 150 — 150 150 — 50 信号分子/μmol·L-1 — 1.0 1.0 — 1.0 1.0 1)“—”表示不添加

表 1 实验设计1) Table 1 Experimental design

通过亚甲蓝分光光度法(HACH DR5000)检测硫化物(S^2--S), 紫外分光光度法(HACH DR5000)检测硝酸盐(NO₃^--N), N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(HACHDR5000)检测亚硝酸盐(NO₂^--N), 阴离子色谱法(戴安娜ICS-1100)检测硫酸盐(SO₄^2--S)和硫代硫酸盐(S₂O₃^2--S).硫酸盐的测定条件如下：AS 23色谱柱, AG 23保护柱, 操作温度30℃, 流速1.0 mL·min^-1, 抑制电流25 mA, 进样量25 μL, 洗脱液浓度4.5 mmol·L^-1 Na₂CO₃和0.8 mmol·L^-1 NaHCO₃.硫代硫酸盐的测定条件如下：抑制电流49 mA, 洗脱液浓度为9.0mmol·L^-1 Na₂CO₃和1.6mmol·L^-1 NaHCO₃.其他测定条件与硫酸盐相同.测定氮气体积(Agilent 6890N气相色谱仪), 柱温为120℃, 检测器温度为160℃, 烘箱温度为100℃.通过碱性亚硫酸盐法确定单质硫(S₀).预先测定样品硫代硫酸盐浓度, 由于单质硫与亚硫酸盐在高pH条件下会转化为硫代硫酸盐, 在样品中加入亚硫酸盐, 以1mol·L^-1的NaOH调节pH, 通过测定反应前后硫代硫酸盐浓度即可间接得到单质硫含量.通过FISH评估来自生物反应器的污泥样品中存在的微生物群体的数量和分布. Amann^[25]描述了样品制备和完整步骤.实验使用由上海生工提供的总菌探针EUB338(GCT GCC TCC CGT AGG AGT), 并通过激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8, Germany)扫描样品.

当进水硫化物浓度为200mg·L^-1时, 由图 1(a)和1(c)可知, 当信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时, 其硫化物的去除效果与其他信号分子浓度下相差不大, 而整个反应过程中其单质硫的产量均高于同时段其他浓度下相应值, 说明此信号分子浓度下有利于硫化物向单质硫的转化.另外, 当信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时, 其单质硫产量在36h时达到最大值为58.32 mg, 且96 h时仍稳定在42.16 mg, 说明信号分子在此浓度下减慢了单质硫转化为硫酸盐的速度, 有利于单质硫的积累.而由图 2(a)和图 2(c)可知, 当信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时, 其硝酸盐氮去除效果和氮气的产量均维持在较高水平.说明在信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时有利于单质硫的积累并能保证较好地脱氮除硫效果.

图 1

Fig. 1

图 1 信号分子对除硫效果与硫转化的影响 Fig. 1 Effects of signal molecules on the removal of sulfur and sulfur transition

图 2

Fig. 2

图 2 信号分子对脱氮效果与氮转化的影响 Fig. 2 Effects of signal molecules on the removal of nitrogen and nitrogen transition

由图 1(b)和1(d)可知, 在进水硫化物浓度为300mg·L^-1的情况下, 当信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时, 其硫化物去除率在整个反应过程中均优于其他信号分子浓度下的相应值, 表现出较好的除硫效果.和进水硫化物浓度为200mg·L^-1的情况类似, 当信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时单质硫的产量相比其他浓度下较高, 在48 h时达到最大值64.96 mg, 且其转化为硫酸盐的速度较慢.另外, 当OHHL信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时, 60 h后, 其出水硝酸盐氮的浓度相比其他浓度快速降低, 且氮气产量均高于其他信号分子浓度下相应值, 说明此信号分子浓度下, 反应后期有利于氮的去除和氮气的产生.

综上, 在200mg·L^-1和300mg·L^-1进水硫化物浓度下, 相比于其他条件, 加入浓度为1.0 μmol·L^-1 OHHL信号分子后, 其硫化物和硝酸盐的去除效果较好, 单质硫的产量相比其他信号分子浓度下较高, 且单质硫向硫酸盐转化的速度减慢, 有利于单质硫的稳定积累.因此, 本研究在OHHL信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1时, 同时投加脱氮硫杆菌, 进行了第二部分的实验, 拟利用脱氮硫杆菌的硫自养反硝化作用和信号分子相结合, 优化脱氮除硫效果.

当进水硫化物浓度为200mg·L^-1时, 由图 3(a)和3(c)可知, 同时添加脱氮硫杆菌和信号分子的3号反应器在整个反应过程中, 其硫化物去除效果均优于其他两组反应器. 36 h时, 3号反应器中硫化物去除率达到98.7%, 比1号反应器(73.5%)高出25.2%, 比2号反应器(75.0%)高出23.7%, 而王爱杰^[26]等人的研究中相同进水硫化物浓度下同时刻硫化物去除率仅为60.3%.相比于单独投加, 同时投加脱氮硫杆菌和信号分子达到相同去除率所需的时间明显缩短, 说明信号分子联合菌使脱硫速率有了很大地提高. 3号反应器中单质硫产量同样在36 h达到最大值67.7 mg, 高于此时刻下仅投加脱氮硫杆菌(57.6 mg)和仅投加信号分子(51.38mg·L^-1)的两个反应器中相应值, 说明同时添加信号分子和脱氮硫杆菌后可能调节了硫化物向单质硫的转化过程, 提高了单质硫的产量.由图 4(a)和图 4(c)可知, 在同时添加OHHL和脱氮硫杆菌3号反应器中, 硝酸盐氮的去除率在整个反应过程中均高于其他两组反应器, 在72h时达到最高为97.8%, 比1号反应器(92.1%)和2号反应器(94.7%)分别高出5.7%和3.1%.而在孙莹^[27]的研究中, 利用脱氮硫杆菌结合黄铁矿进行反硝化脱氮, 在培养基中硝酸盐氮初始浓度为50 mg·L^-1时, 脱氮硫杆菌对氮的去除率最高为76.94%.另外, 3号反应器中氮气的产量在36~72 h中均高于其他两组反应器, 72 h时氮气的产量达到最大值3.57 mmol(80 mL).说明信号分子结合菌提高了硝酸盐的去除速率, 同时增加了氮气的转化量.综合整个脱氮除硫过程可以发现, 当进水硫化物浓度为200mg·L^-1时, 反应36 h时其硫化物几乎完全去除且单质硫产量达到最大, 而硝酸盐的充分去除和氮气的产量最大值则出现在72 h.由图 1(c)可知, 36 h后单质硫的产量基本保持稳定, 72 h时仍保持在59.0 mg, 因此可以通过延长反应时间至72 h, 在硝酸盐氮去除率和氮气产量达到最大的条件下, 同时保证单质硫产量和硫化物的充分去除.

图 3

Fig. 3

红色虚线为3号反应器中单质硫产量最高时相应硫化物的去除率 图 3 信号分子和脱氮硫杆菌对除硫效果与硫转化的影响 Fig. 3 Effects of signal molecules and Thiobacillus denitrificans on the removal of sulfur and sulfur transition

图 4

Fig. 4

图 4 信号分子和脱氮硫杆菌对脱氮效果与氮转化的影响 Fig. 4 Effects of signal molecules and Thiobacillus denitrificans on denitrification and nitrogen transition

由图 3(b)和3(d)可知, 当进水硫化物浓度提高至300mg·L^-1时, 同时投加信号分子和脱氮硫杆菌的3号反应器中硫化物去除率在24~72 h内高于其他两组反应器, 其数值在48 h时达到98.9%, 比仅添加脱氮硫杆菌的1号反应器(93.0%)高出5.9%, 比仅添加信号分子的2号反应器(91.7%)高出7.2%, 且达到相同硫化物去除效果所需的时间明显缩短, 说明同时添加OHHL和脱氮硫杆菌加速了硫化物的去除.另外, 在整个反应过程中, 3号反应器中单质硫的产量均高于其他两组反应器, 且在36 h时达到最大值79.1 mg, 分别高出1号反应器(60.6 mg)和2号反应器(63.0 mg)18.5 mg和16.1 mg, 说明同时添加信号分子和脱氮硫杆菌提高了单质硫的产量, 但此时硫化物去除率仅为84.4%, 即单质硫回收效果最佳时, 其硫化物的去除并不完全.由图 4(b)和4(d)可知, 3号反应器中硝酸盐氮的去除效果在整个反应过程中均优于其他两组反应器, 硝酸盐的去除率在72 h时达到最高为96.9%, 分别高出2号反应器(93.2%)和1号反应器(94.7%)6.4%和2.2%, 且氮气产量均高于其他两组反应器, 在72 h时氮气产量达到最大值4.2 mmol(94.6 mL).说明添加信号分子与脱氮硫杆菌能够加速对硝酸盐氮的去除并提高氮气产量.综合整个脱氮除硫过程可知, 同时投加OHHL和脱氮硫杆菌单质硫产量在36 h达到最大值, 此时硫化物仍有较多残余, 而硝酸盐氮的充分去除的时间则出现在72 h, 因此需要延长反应时间方可达到同时脱氮除硫的效果, 但72 h时其单质硫的产量降低至33.6 mg, 说明此时脱氮硫杆菌的活性降低, 信号分子结合菌对单质硫的提升效果较小, 不利于单质硫的回收.由图 1(d)可知, 单质硫产量较高的另一时刻出现在72 h单独投加2.5 μmol·L^-1 OHHL时, 其产量达到63.1 mg, 且此时硫化物和去除率达到99%, 硝酸盐的去除达到93.9%且氮气产量为3.55 mmol(79.5 mL), 而72 h时信号分子联合菌在对单质硫产量影响不大, 因此单独投加2.5 μmol·L^-1 OHHL, 即能获得较好地同步脱氮除硫效果, 并使单质硫和氮气的产量保持在较高值.

综上, 在进水硫化物浓度为200mg·L^-1和300mg·L^-1时, 同时投加OHHL和脱氮硫杆菌相比于单独投加时, 提高了硫化物和硝酸盐的去除速率, 有利于缩短脱硫的反应时间, 并增加了单质硫和氮气的产量.本文在2.3节中通过FISH技术从生物角度进行其机制的研究.当进水硫化物浓度为200mg·L^-1时, 信号分子联合脱氮硫杆菌使硫化物的去除率提高至98.7%, 单质硫的产量达到67.7 mg.延长反应时间至72 h后, 硝酸盐去除率提高至96.9%, 且氮气产量达到80 mL, 此时单质硫的产量保持在59.0 mg.当硫化物浓度为300mg·L^-1时, 单独投加2.5 μmol·L^-1的信号分子在72 h时其硫化物和去除率达到99%, 硝酸盐的去除达到93.9%, 单质硫和氮气的产量分别达到63.1 mg和79.5 mL.本研究与其他脱氮除硫工艺效果对比如图 5所示.

图 5

Fig. 5

A：本研究, 初始硫化物浓度300mg·L-1；B：本研究, 初始硫化物200mg·L-1；C：文献[28], 初始硝酸盐浓度43.75mg·L-1, 初始硫化物浓度100mg·L-1；D：文献[29], 进水硫化物负荷500 g·(m3·d)-1；E：文献[30], 初始硫化物浓度200mg·L-1；F：文献[26], 初始硫化物浓度400mg·L-1；G：文献[31], 进水硫化物负荷12kg·(m3·d)-1；H：文献[18], 初始硫化物浓度300mg·L-1 图 5 脱氮除硫工艺效果对比 Fig. 5 Comparison of effects on nitrogen and sulfur removal

图 6为进水硫化物浓度为200 mg·L^-1和300 mg·L^-1, 反应36 h时各反应器中总菌的FISH图像.各反应条件下对应的FISH图像的对象数利用Daime软件统计, 对象数的总计可近似认是不同反应条件下大多数细菌相对数量的总和.在进水硫化物浓度为200mg·L^-1和300mg·L^-1时, 同时投加OHHL和脱氮硫杆菌的反应器中, 微生物总和的相对数量最高.当进水硫化物浓度为200mg·L^-1时, 添加1.0 μmol·L^-1 OHHL与脱氮硫杆菌的反应器中, FISH图像中的对象数总和为2 444, 为仅添加脱氮硫杆菌(1 522)的1.6倍, 为仅添加OHHL(1 363)的1.8倍；当进水硫化物浓度为300mg·L^-1时, FISH图像中的对象数总和为2 915, 为仅添加脱氮硫杆菌(1 695)的1.7倍, 为仅添加OHHL(1 726)的1.7倍.这与之前2.2节中所讨论的同时添加OHHL与脱氮硫杆菌反硝化脱硫效果优于单独投加的效果这一结论相一致.说明同时添加OHHL结合脱氮硫杆菌, 促进了系统中微生物总量的积累, 有利于脱氮除硫反应的进行, 从而使反应中硫化物和硝酸盐氮的去除速率提高, 同时单质硫和氮气的产量增加.

图 6

Fig. 6

(a)S2--S=200mg·L-1, 仅脱氮硫杆菌；(b)S2--S=200mg·L-1, 脱氮硫杆菌+1.0 μmol·L-1OHHL；(c)S2--S=200mg·L-1, 1.0 μmol·L-1OHHL；(d)S2--S=300mg·L-1, 仅脱氮硫杆菌；(e)S2--S=300mg·L-1, 脱氮硫杆菌+1.0 μmol·L-1OHHL；(f)S2--S=300mg·L-1, 1.0 μmol·L-1OHHL; 放大倍数：10×200 图 6 脱氮除硫反应中总菌的FISH图 Fig. 6 FISH diagram of total bacteria count in the process of simultaneous removal of nitrogen and sulfur

(1) 当进水硫化物浓度为200mg·L^-1和300mg·L^-1时在OHHL信号分子浓度为1.0 μmol·L^-1条件下, 其单质硫产量相比于其他信号分子浓度下产量较高且保持稳定, 说明此信号分子浓度有利于硫化物向单质硫的转化和单质硫的稳定积累.

(2) 同时投加信号分子和脱氮硫杆菌相比于单独投加时, 微生物总量数量明显增加, 因此反应中硫化物和硝酸盐氮的去除速率均有所提高, 且单质硫和氮气的产量增加.

(3) 当进水硫化物浓度为200mg·L^-1时, 信号分子联合脱氮硫杆菌在延长反应时间至72 h时达到最佳脱氮除硫条件, 此时硫化物的去除率提高至99.8%, 单质硫的产量达到59.0 mg, 硝酸盐去除率提高至96.9%, 且氮气产量达到80.0 mL.当硫化物浓度为300mg·L^-1时, 其最佳脱氮除硫条件为单独投加2.5 μmol·L^-1的信号分子且反应时间为72 h时, 其硫化物和硝酸盐氮去除率分别达到99.0%和93.9%, 单质硫和氮气的产量分别达到63.1 mg和79.5 mL.