N、P的排放易引发水体的富营养化, 利用微生物脱氮可以高效率、低成本地去除污水中的氮元素.金属冶炼、印染、造纸和石油化工等行业产生大量的含Ca²⁺废水, 这些Ca²⁺进入污水处理厂与活性污泥相互作用, 影响微生物的脱氮性能和沉降性能.城市污水处理厂中的Ca²⁺浓度一般在30~60 mg·L^-1范围内^[1].目前, 有3种理论用于解释Ca²⁺促进絮凝的作用机制：压缩双电层理论、海藻酸盐理论和二价阳离子架桥理论(divalent cation bridging theory, DCBT).随着Ca²⁺浓度的增加, 双电层的尺寸减小, 降低了颗粒之间的斥力, 促进聚集^[2].胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)是微生物生长过程中分泌的代谢产物, 覆盖在细胞表面, 其组成、结构的变化可以间接反映微生物的生命活动^[3]. EPS的化学组成复杂(包含蛋白质、碳水化合物、腐殖质和脱氧核糖核酸等), 表面带有大量的负电基团, DCBT广泛用于揭示二价离子与微生物分泌的EPS之间的相互作用. Ca²⁺与EPS上带负电的官能团架桥, 形成EPS-Ca²⁺-EPS结构, 促进生物絮凝, 改善污泥沉降性和脱水性. Ca²⁺以磷酸盐、碳酸盐形式在活性污泥絮体中形成Ca固体沉淀, 增加了污泥中的无机组分^{[4, 5]}.同时, Ca²⁺对污染物去除率产生影响.张兰河等^[6]通过逐渐提高SBR反应器进水Ca²⁺浓度, 发现高浓度Ca²⁺的添加导致系统COD、氨氮去除速率降低. Yu等^[7]采用7个平行SBR反应器分析Ca²⁺对SBR污泥系统的影响时发现, 随着Ca²⁺浓度的增大, 污染物去除率提高；当Ca²⁺浓度达到150 mg·L^-1时, 污染物去除率达到最大.

硝化是传统生物脱氮过程中的关键步骤, 由氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)和亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria, NOB)共同作用实现.硝化微生物的生长速率低, 对pH、溶解氧和温度等环境条件敏感, 硝化作用一般被认为是生物脱氮的控制步骤^[8]. Ca²⁺作为一种无机盐离子, 参与微生物细胞结构组成、能量转移和控制原生质胶态, 进入活性污泥中的Ca²⁺能够引起硝化菌活性和絮凝沉降性的改变.污泥絮凝沉降性能的好坏通常是影响污水处理厂稳定运行的关键因素^[9].关于Ca²⁺对污泥硝化活性和硝化污泥沉降性能的影响研究尚少.

本研究考察Ca²⁺对活性污泥脱氮特性、EPS组成和结构的影响, 分析了Ca²⁺和污泥絮凝沉降性之间的响应关系, 探索Ca²⁺对硝化菌活性和脱氮微生物絮凝性的影响, 有助于深入识别Ca²⁺在生物脱氮过程中的调节机制, 提升污水生物处理系统的稳定性和脱氮效率.

1 材料与方法 1.1 实验装置

SBR实验装置示意如图 1所示. SBR反应器由有机玻璃制成, 有效容积为4 L, 在反应器一侧设置3个取样口, 底部设置排泥口.好氧反应阶段采用气泵曝气, 反应器底部设有曝气头, 通过转子流量计调节曝气强度, 控制DO为5~6.5 mg·L^-1.采用机械搅拌器, 保证缺氧阶段泥水充分混合.反应器运行温度控制在(20±2)℃. SBR反应器每个运行周期采用进水5 min→曝气4 h→搅拌2 h→沉降0.5 h→排水5 min→闲置5.5 h的运行方式.污泥龄为14 d, MLSS维持在2 500 mg·L^-1.反应器每个运行周期进水3 L, 活性污泥沉降结束后排出相同体积的出水.通过投加CaCl₂调控进水Ca²⁺浓度分别为0.45、0.65、0.9、1.1、3和5 mmol·L^-1, 每个浓度条件下反应器连续运行30 d以上.

本实验用水采用模拟城市污水, 配水成分为：葡萄糖(0.28 g·L^-1)、碳酸氢钠(0.172 g·L^-1)、氯化铵(0.1 g·L^-1)、硫酸镁(0.05 g·L^-1)、磷酸二氢钾(0.02 g·L^-1)、氯化钙(0.01 g·L^-1), 同时投加氯化钴(0.000 42 g·L^-1)、三氯化铁(0.000 37 g·L^-1)、钼酸钠(0.000 15 g·L^-1)、硫酸锰(0.000 13 g·L^-1)和硫酸铜(0.000 1 g·L^-1)等微量元素.

1.2 分析项目和检测方法

COD采用多参数水质测定仪(兰州连华环保科技有限公司, 5B-3B)测定, TN采用紫外可见智能型多参数水质测定仪(北京连华永兴科技发展有限公司, LH-3BA)测定, NO₂^--N、NO₃^--N、NH₄⁺-N、SVI、MLSS和MLVSS均采用国家标准方法测定. pH采用梅特勒Five Easy Plus^TM台式pH计测定, DO采用维赛Pro 20型溶氧仪测定.

比氨氧化速率(SAOR)计算公式：

(1)

式中, SAOR为比氨氧化速率, g·(g·d)^-1；[NH₄⁺-N]_s为曝气开始时NH₄⁺-N浓度, mg·L^-1；[NH₄⁺-N]_e为曝气结束时NH₄⁺-N浓度, mg·L^-1；MLVSS为污泥浓度, mg·L^-1；t为曝气反应时间, min.

比硝态氮产生速率(SNaPR)计算公式：

(2)

式中, SNaPR为比硝态氮产生速率, g·(g·d)^-1；[NO₃^--N]_s为曝气开始时NO₃^--N浓度, mg·L^-1；[NO₃^--N]_e为曝气结束时NO₃^--N浓度, mg·L^-1；MLVSS为污泥浓度, mg·L^-1；t为曝气反应时间, min.

比亚硝态氮产生速率(SNiPR)计算公式：

(3)

式中, SNiPR为比亚硝态氮产生速率, g·(g·d)^-1；[NO₂^--N]_s为曝气开始时NO₂^--N浓度, mg·L^-1；[NO₂^--N]_e为曝气结束时NO₂^--N浓度, mg·L^-1；MLVSS为污泥浓度, mg·L^-1；t为曝气反应时间, min.

根据Pai^[10]提出的方法分析硝化菌活性.在初始COD(葡萄糖)、NH₄⁺-N(NH₄Cl)和NO₂^--N(NaNO₂)分别为20、10和5 mg·L^-1的条件下, 对配制的溶液进行曝气, 使DO接近饱和, 加入待测活性污泥.溶解氧仪通过打孔的橡胶塞插入锥形瓶内, 密封锥形瓶, 在测量过程中利用磁力搅拌器对泥水进行混合, 每隔30 s记录系统内DO值, 根据溶解氧变化曲线计算得到总比耗氧速率(SOUR)；向混合液中投加NaClO₃抑制硝酸菌活性, 得到异养菌比耗氧速率(SOUR_H)与AOB比耗氧速率(SOUR_AOB)之和；再向混合液中投加烯丙基硫脲(ATU)抑制亚硝酸菌活性, 得到SOUR_H, SOUR_NOB=SOUR－(SOUR_H+SOUR_AOB).

粒径采用粒径测定仪(Ambivalue, LFC101)进行测定.污泥形态采用荧光倒置生物显微镜(Eclipse Ti-S, Nikon, 日本)进行分析.采用Wilén等^[11]提出的方法检测污泥重絮凝能力.污泥亲疏水性利用接触角测定仪(上海中晨数字技术设备有限公司, JC2000D1)测定.运行周期结束后取样分析, 重复测定3次得到平均值.

1.3 EPS的提取与分析

采用修正的热提取法分层提取EPS^[12].反应器每个运行周期结束时取污泥混合液, 4℃下4000 g离心5 min, 上清液采用0.45 μm滤膜过滤后保存；沉淀污泥采用70℃、0.05%的NaCl溶液重新悬浮至原来的体积, 漩涡混合器混合1 min, 4℃下4000 g离心10 min, 上清液采用0.45 μm滤膜过滤得到LB-EPS；沉淀污泥重新悬浮至原来体积, 60℃下水浴加热30 min, 在4℃下4000 g离心15 min, 利用0.45 μm滤膜过滤得到TB-EPS. EPS总量以总有机碳(total organic carbon, TOC)表示, 采用TOC分析仪(liqui TOCⅡ, elementar, 德国)测定.采用考马斯亮蓝法和蒽酮-硫酸法分别检测蛋白质(PN)和多糖(PS)含量.

采用荧光分光光度计(RF-6000, 日本)分析EPS组成, 激发和发射波长扫描范围均为220~550 nm, 测定间隔为5 nm, 扫描速度为2 400 nm·min^-1, 激发和发射光谱通带均设置为5 nm.将EPS进行真空冷冻干燥后与KBr以1:100比例在玛瑙研钵中混合均匀；取150 mg混合物压片, 采用FTIR(Tensor 27, 德国布鲁克公司, 分辨率0.5 cm^-1)分析基团的变化.

2 结果与讨论 2.1 Ca²⁺对脱氮性能的影响

Ca²⁺对SBR工艺脱氮性能的影响, 如图 2所示.当进水Ca²⁺浓度低于3 mmol·L^-1时, COD和NH₄⁺-N去除率保持稳定, 分别为95%和97%；随着进水Ca²⁺浓度由0.45 mmol·L^-1增加至3 mmol·L^-1, TN去除率由60%升高至72%, TP去除率由56%升高至69%.当Ca²⁺升高至5 mmol·L^-1时, COD、NH₄⁺-N和TN去除率分别下降为85%、80%和56%, TP去除率下降为64%.较低浓度的Ca²⁺(≤3 mmol·L^-1)提高了TN和TP的去除能力, 然而较高浓度的Ca²⁺(>3 mmol·L^-1)降低了有机物降解和脱氮除磷能力.低浓度的金属离子能够激发微生物代谢活性, 提高污染物去除能力；微生物为了适应高浓度的金属离子, 调节自身代谢系统, 减缓微生物新陈代谢作用, 生物活性下降, 降低污染物去除能力^[13].姜元臻^[14]等研究发现, 低浓度Ca²⁺能够促进脱氢酶活性的提高, 超过一定范围后, 脱氢酶活性随离子浓度增加反而下降.

为了进一步考察Ca²⁺浓度对硝化作用的影响, 分析不同Ca²⁺浓度下SAOR、SNiPR和SNaPR的变化. 图 2(d)表明, 当进水Ca²⁺浓度低于0.9 mmol·L^-1时, SAOR和SNaPR分别稳定在0.055 g·(g·d)^-1和0.028 g·(g·d)^-1, 系统保持较高的硝化速率.当Ca²⁺浓度为1.1 mmol·L^-1和3 mmol·L^-1时, SAOR和SNaPR达到最大, 分别为0.073 g·(g·d)^-1和0.04 g·(g·d)^-1. SAOR和SNaPR升高的原因：①作为微生物生长的重要无机盐, 低浓度的Ca²⁺刺激了微生物生命活动, 提高了硝化菌的活性, 反应速率增大^[15]. ②Ca²⁺通过与污泥间的架桥作用, 促进污泥絮体形成和维持絮体结构的稳定性(图 3)；污泥絮体再利用网捕、卷扫等作用吸附有机物, 提高污染物处理效果^{[2, 16]}.当Ca²⁺浓度达到5 mmol·L^-1时, SAOR和SNaPR下降至0.054 g·(g·d)^-1和0.02 g·(g·d)^-1.在反应过程中, SNiPR一直维持在较低水平[ < 0.01 g·(g·d)^-1], 这表明NO₂^--N产生量少, 低浓度的Ca²⁺未对NOB的活性产生抑制, 硝化反应类型为全程硝化.

硝化微生物活性的变化如图 4所示.随着Ca²⁺浓度的升高, SOUR_AOB和SOUR_NOB均呈先缓慢升高后下降的规律.当Ca²⁺由0.45 mmol·L^-1上升至3 mmol·L^-1时, SOUR_AOB由6.3 mg·(g·h)^-1升高至10.4 mg·(g·h)^-1, SOUR_NOB由2.3 mg·(g·h)^-1升高至3.7 mg·(g·h)^-1.当Ca²⁺为5 mmol·L^-1时, 硝化污泥的活性减弱, SOUR_AOB和SOUR_NOB分别下降至9.1 mg·(g·h)^-1和2.1 mg·(g·h)^-1. Ren等^[17]通过研究Ca²⁺在好氧颗粒污泥的空间分布及其对好氧颗粒污泥生物活性的影响时发现, CaCO₃沉淀积聚在污泥颗粒中心, 细胞拥挤在外层并聚集成簇, 累积较多Ca成分的颗粒, 生物活性低.本研究还发现, 当进水Ca²⁺浓度升高至5 mmol·L^-1时, MLVSS/MLSS保持在低值, 高浓度Ca²⁺增加了活性污泥中的无机成分, 导致硝化微生物产生更多的EPS(见2.2.1节). EPS与Ca²⁺发生相互作用后在污泥絮体中形成沉积, 并围绕在细菌周围, 不利于氧气和污染物的传质, 生物活性下降, SOUR_AOB和SOUR_NOB降低.

2.2 Ca²⁺对EPS组成和结构的影响 2.2.1 Ca²⁺对EPS组成的影响

EPS是微生物生长过程中分泌的黏性物质, 是微生物的新陈代谢产物.不同Ca²⁺浓度下EPS、LB-EPS和TB-EPS的变化规律, 如图 5(a)所示.当Ca²⁺浓度从0.45 mmol·L^-1增加至5 mmol·L^-1时, EPS含量从68 mg·g^-1增大至95.74 mg·g^-1. EPS受进水Ca²⁺浓度的影响, Ca²⁺浓度的增大导致更多EPS产生, EPS与Ca²⁺结合的几率升高, 更容易形成大而密实的污泥絮体^[18].这主要有2方面原因：①当微生物受到高浓度Ca²⁺废水冲击时, 可通过自身的调节机制平衡细胞内外渗透压和保护细胞内的原生质, 细胞通过聚集低分子量物质(如氨基酸、糖和甘氨酸三甲基内盐等)形成新的胞外保护层, 调节自身新陈代谢^{[19, 20]}. ②一部分微生物在受到高浓度离子冲击下, 难以维持细胞渗透压, 大量细胞出现自溶, 释放出大量的EPS, 导致EPS含量增加^[21].随着Ca²⁺浓度的增大, LB-EPS/EPS从35%降低至25%. Li等^[22]的研究表明, LB-EPS对污泥絮凝产生负面影响, 过量的LB-EPS减弱了细胞之间的相互附着, 导致絮凝性变差.因此, 随着Ca²⁺浓度升高, LB-EPS/EPS的降低可能是污泥絮凝性改变的主要原因. 图 5(b)表明EPS中PN和PS含量的变化.随着Ca²⁺浓度的增大, LB-EPS和TB-EPS中PN均升高, PN一直是EPS紧密层和松散层中的主要成分.当微生物受到外界离子胁迫时, 微生物主要通过分泌PN应对外界离子的胁迫^[23]. PN参与二价阳离子的架桥, 其中氨基酸、羧基和DNA中的磷酸基是主要参与架桥的基团^{[24, 25]}.随着Ca²⁺浓度的升高, 细胞分泌更多PN释放到EPS中, 为Ca²⁺提供更多可结合的位点. TB-EPS中PN含量是LB-EPS中PN含量的1~2倍, 而TB-EPS中PS含量远高于LB-EPS(是LB-EPS中PS含量的6倍). Higgins等^[24]的研究发现, 阳离子促进PN的产生, PS变化较小, 保持在较低水平. Nguyen等^[9]的研究发现, Ca²⁺的加入降低了上清液中PS的含量, 加快了细菌基质的聚集速率. Ca²⁺的存在聚合了原本松散的PS和细菌基质, 导致TB-EPS中的PS含量高. PN/PS被认为是决定污泥表面性质的重要参数^[26]. LB-EPS中PN/PS变化较大(2.2~9.4), TB-EPS中PN/PS维持在1.25左右.这也证实了与TB-EPS相比, LB-EPS与活性污泥絮凝性高度相关^[27].

2.2.2 Ca²⁺对EPS结构的影响

Ca²⁺与EPS中带负电的基团产生键合作用.当Ca²⁺浓度分别为0.45、1.1、3和5 mmol·L^-1时, LB-EPS和TB-EPS的红外图谱如图 6所示. 3 000~3 700 cm^-1处出现的较宽吸收峰由O—H伸缩振动和N—H伸缩振动导致. 1 620~1 670 cm^-1处出现的吸收峰是由C=O的伸缩振动引起, 基团类型属于PN肽键中的酰胺Ⅰ, 并存在β-sheets蛋白质二级结构, 这有利于促进生物絮凝^[28].随着Ca²⁺浓度的增加, LB-EPS和TB-EPS在1 630 cm^-1附近的谱带强度增加, 污泥的絮凝性得到提高.同时还发现, TB-EPS的峰强度变化大于LB-EPS, 表明Ca²⁺更易与TB-EPS中的酰胺Ⅰ基团键合. 1 047~1 110 cm^-1处产生的吸收峰与碳水化合物中常见基团O—H和C—O的伸缩振动有关, 碳水化合物组成的变化在污泥颗粒化过程中起着重要作用^[29]. LB-EPS和TB-EPS中的吸收峰, 波长主要集中在3 400、1 600和1 100 cm^-1附近, 表明EPS的主要成分为PN和PS.随着Ca²⁺浓度的增加, LB-EPS和TB-EPS中的吸收峰强度增加, 但吸收峰位置未发生变化.

EEM能够反映有机物组成和结构的变化.不同Ca²⁺浓度下, LB-EPS和TB-EPS的EEM光谱, 如图 7所示. LB-EPS荧光光谱中主要存在溶解性微生物副产物区峰A(E_x/E_m：270~290 nm/320~350 nm)和芳香类蛋白质区峰B(E_x/E_m：220~230 nm/330~350 nm).随着Ca²⁺浓度的增加, EPS中芳香类蛋白质增加, 酪氨酸具有稳定的长链环状结构, 可以提高污泥絮体的稳定性^[30]. TB-EPS的光谱中除蛋白质特征峰外, 还存在腐殖酸峰C(E_x/E_m：270~275 nm/440~465 nm)和类富里酸峰D(E_x/E_m：310~330 nm/410~450 nm), 这两类物质与微生物细胞的结合紧密.在低浓度Ca²⁺条件下, 硝化速率低, 生物活性弱, EPS和PN、PS含量低, 大分子有机物分解形成腐殖酸类物质.与0.45 mmol·L^-1 Ca²⁺浓度下的荧光峰位置相比, 当Ca²⁺浓度分别为1.1、3和5 mmol·L^-1时, LB-EPS和TB-EPS中的峰A沿E_x方向均红移10 nm, 这是由于羰基取代基、羟基、烷氧基、氨基和羧基基团的数量增加^[31].同时, LB-EPS和TB-EPS中峰B均沿E_x红移10 nm, 链结构中芳香环和共轭键等基团数量增加^[32]. Ca²⁺对细菌代谢产物产生较大的影响, 随着Ca²⁺浓度的增加, EPS中芳香类蛋白质增加, 污泥絮体更加稳定.

2.3 Ca²⁺对污泥絮凝沉降性能的影响

污泥的絮凝性采用FA表征, 污泥沉降性采用污泥容积指数(SVI)表征. 图 8表明, 随着Ca²⁺浓度的升高, 污泥的平均粒径由64.9 μm增至155.1 μm, SVI由45 mL·g^-1下降至30 mL·g^-1, 污泥沉降性能得到了明显改善.随着进水Ca²⁺浓度增加, FA升高并保持在30%左右, 污泥絮凝性提高.同时, Ca²⁺浓度的加大使污泥形态由结构松散的絮状污泥变成大而密实的污泥颗粒(图 3).结合2.2.1节, 由LB-EPS中PN和PS变化可知, PN的增加为Ca²⁺提供了更多可供结合的位点, 形成EPS-Ca²⁺-EPS三维结构, 促进活性污泥絮体的形成和稳定.另外, 加入Ca²⁺会中和细菌表面的负电荷, 减少细胞间的静电斥力, 进而促进污泥颗粒化；投加的Ca²⁺作为颗粒中心形成诱导核, 促进微生物凝聚. 表 1为硝化污泥接触角的变化情况.随着进水Ca²⁺浓度增大, 污泥接触角由58.42°升高至75.55°, LB-EPS中PN/PS升高, 这表明污泥表面性质发生改变, 疏水性增强；疏水性的增大有利于提高污泥的絮凝能力, 形成更大结构更紧凑的污泥絮体.

通过对污泥形态和性能分析可知, Ca²⁺对硝化污泥生物絮凝性和沉降性具有促进作用. Ca²⁺浓度的增加导致EPS和PN增多, 接触角变大, LB-EPS中PN/PS升高, 而EPS中主要组分及基团未发生明显变化, EPS-Ca²⁺-EPS结构的形成和LB-EPS/EPS的减少是改善污泥生物絮凝性的主要原因；污泥由松散集聚的絮体逐渐变为大而密实的污泥颗粒, 污泥粒径增大, 无机成分增加, 改善了污泥的沉降性能.

3 结论

(1) 低浓度Ca²⁺(＜3 mmol·L^-1)促进了污泥硝化作用, 当Ca²⁺为3 mmol·L^-1时, TN去除率为72%, SAOR和SNaPR分别达到0.073 g·(g·d)^-1和0.040 g·(g·d)^-1, SOUR_AOB为10.4 mg·(g·h)^-1, SOUR_NOB为3.7 mg·(g·h)^-1；高浓度Ca²⁺抑制了污泥系统硝化作用. SNiPR一直维持在较低水平, 脱氮类型为全程硝化反硝化.

(2) 当Ca²⁺浓度由0.45 mmol·L^-1增加至5 mmol·L^-1时, FA升高并维持在一定水平, 污泥粒径持续增大, SVI下降. Ca²⁺的增加对污泥絮凝性和沉降性均有改善, EPS-Ca²⁺-EPS结构的形成和LB-EPS/EPS的减小是促进污泥絮凝的主要原因, 无机组分的升高和污泥粒径的增大是改善沉降性的主要原因.

(3) Ca²⁺浓度的增大对基团类型未产生影响, LB-EPS和TB-EPS的主要基团相同, Ca²⁺增强了一些基团的伸缩振动. Ca²⁺浓度对LB-EPS中的荧光物质成分无影响, TB-EPS中存在腐殖酸类物质.