环境科学  2019, Vol. 40 Issue (8): 3713-3721   PDF    
异养硝化细菌Acinetobacter junii NP1的同步脱氮除磷特性及动力学分析
杨垒1,2, 陈宁1,2, 任勇翔1,2, 崔珅1,2, 汪旭晖1,2, 肖倩1,2, 郭淋凯1,2     
1. 西安建筑科技大学陕西省环境工程重点实验室, 西安 710055;
2. 西安建筑科技大学西北水资源与环境生态教育部重点实验室, 西安 710055
摘要: 针对传统生物脱氮除磷过程存在工艺流程复杂、抗冲击负荷能力差、基建与运行费用高等问题,以具有高效脱氮除磷功能的异养硝化细菌Acinetobacter junii NP1为研究对象,开展其同步脱氮除磷性能、影响因子及动力学分析.结果表明,菌株NP1具有高效的异养硝化能力,氨氮最大去除率达99.12%,反应过程只有少量的硝化中间产物积累,并且能够耐受较高的氨氮负荷.菌株NP1同时具有良好的好氧反硝化特性,能够利用亚硝酸盐和硝酸盐进行生长代谢,最大去除率分别为91.40%和95.10%.此外,菌株NP1异养硝化过程还伴随着同步的聚磷作用,适当的氮磷比有利于氮磷的同步去除,当氮磷比为5 :1时,最大氨氮和磷酸盐去除率分别为99.21%和88.35%.菌株NP1生长特性符合Logistic模型(R2>0.99),氮素和磷酸盐降解过程则与修饰的Compertz模型相匹配(R2>0.99),拟合所得氮和磷酸盐最大转化速率Rm为:氨氮>硝氮>亚硝氮,迟滞时间t0为:硝氮>亚硝氮>氨氮.通过基质降解动力学以及氮磷去除率分析,最佳条件是碳源为琥珀酸钠、C/N=10、T=30℃以及r=160 r·min-1.
关键词: 琼氏不动杆菌      动力学      异养硝化      好氧反硝化      同步脱氮除磷     
Simultaneous Nitrogen and Phosphorus Removal and Kinetics by the Heterotrophic Nitrifying Bacterium Acinetobacter junii NP1
YANG Lei1,2 , CHEN Ning1,2 , REN Yong-xiang1,2 , CUI Shen1,2 , WANG Xu-hui1,2 , XIAO Qian1,2 , GUO Lin-kai1,2     
1. Shaanxi Key Laboratory of Environmental Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China;
2. Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Ministry of Education, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China
Abstract: Due to the problems of traditional biological nitrogen and phosphorus removal, including long process duration and high infrastructural and operational costs, the simultaneous nitrogen and phosphorus removal capabilities, influencing factors and kinetic characteristics were systematically studied using the heterotrophic nitrifier Acinetobacter junii NP1 which possesses efficient simultaneous nitrogen and phosphorus removal ability. The results showed that strain NP1 exhibited efficient heterotrophic nitrification ability with a maximum ammonia removal rate of 99.12%. Furthermore, only small amounts of nitrification intermediates were accumulated during the reaction process. Strain NP1 also adapted well to higher ammonia nitrogen loading. In addition, strain NP1 had efficient aerobic denitrification characteristics, and could utilize nitrite and nitrate for growth and metabolism, achieving a maximum removal rate of 91.40% and 95.10%, respectively. The heterotrophic nitrification process of strain NP1 was accompanied by simultaneous phosphorus accumulation, and the appropriate ratio of nitrogen to phosphorus was beneficial for the simultaneous removal of nitrogen and phosphorus. When the ratio of nitrogen to phosphorus was 5:1, the maximum ammonia nitrogen and phosphate removal rates reached 99.21% and 88.35%, respectively. The bacterial growth process of stain NP1 matched the Logistic model (R2>0.99), and the nitrogen and phosphate degradation conformed to the Compertz model (R2>0.99). The maximum conversion rates of nitrogen and phosphate (Rm) obtained by model fitting were in the order ammonia>nitrate>nitrite, and lag time (t0) was in the order nitrate>nitrite>ammonia. According to the analysis of the degradation kinetics of the matrix and the removal rate of nitrogen and phosphorus, the optimal conditions were found to be sodium succinate, C/N=10, T=30℃, and r=160 r·min-1.
Key words: Acinetobacter junii NP1      kinetic      heterotrophic nitrification      aerobic denitrification      simultaneous nitrogen and phosphorus removal     

目前传统的生物脱氮除磷技术主要是基于好氧硝化-缺氧反硝化以及生物强化除磷理论, 污水厂现行主流的生物脱氮除磷工艺大多采用A2O工艺, 不过此工艺存在占地面积大、工艺流程复杂、运行费用高等缺点.近年来越来越多的异养硝化细菌被发现, 主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)[1]、产碱菌属(Alcaligenes)[2]、芽孢杆菌属(Bacillus)[3]和不动杆菌属(Acinetobacter)[4]等.有研究发现, 大部分异养硝化细菌能够同步进行有机物降解、硝化和反硝化作用, 在生活污水、工业废水、高氨氮养猪废水等有良好的处理效果[5, 6].同时, 一些特殊的异养硝化细菌具有良好的极端环境适应能力和同步去除其它污染物的功能, 研究发现菌株Pseudomonas stutzeri YG-24[7]Bacillus cereus GS-5[8]具有高效的异养硝化、好氧反硝化和聚磷能力, 能够同步去除实际生活污水中的碳、氮、磷污染物.目前, 异养硝化细菌的研究主要集中在新型菌株的筛选和脱氮机理方面, 关于异养硝化细菌的同步脱氮除磷过程还处于初步研究阶段, 对于脱氮除磷特性、影响因子及动力学特性等方面的认识还不全面.因此, 加强兼具同步脱氮除磷功能异养硝化细菌的筛选及其脱氮除磷特性的研究, 对丰富生物脱氮除磷理论及指导工程实践具有重要意义.

本文以异养硝化细菌Acinetobacter junii NP1为研究对象, 开展其生理生化特性、脱氮除磷性能和影响因子分析, 并通过Logistic和Compertz模型分别模拟NP1的菌体生长特性与脱氮特性.

1 材料与方法 1.1 培养基

异养硝化培养基(g·L-1):琥珀酸钠5.62, (NH4)2SO4 0.47, K2HPO4·3H2O 0.15, 维氏盐溶液50 mL, pH=7.0.

亚硝酸盐培养基(g·L-1):琥珀酸钠5.62, NaNO2 0.49, K2HPO4·3H2O 0.15, 维氏盐溶液50 mL, pH=7.0.

硝酸盐培养基(g·L-1):琥珀酸钠5.62, KNO30.72, K2HPO4·3H2O 0.015, 维氏盐溶液50 mL, pH=7.0.

维氏盐溶液(g·L-1):MgSO4·7H2O 2.5, NaCl 2.5, MnSO4·4H2O 0.05, FeSO4·7H2O 0.05.

1.2 菌株的分离与鉴定

取养猪废水处理厂活性污泥, 在异养硝化固体培养基进行稀释涂布和多次划线分离, 挑选不同类型单菌落进行异养硝化和聚磷能力测试[9].将筛选出的具有较高异养硝化和聚磷能力的菌株用甘油冷冻法保存.

对纯化后的菌株通过高分辨冷场发射扫描电镜, 观察菌体特征和细胞个体形态, 进行形态学观察; 菌株的生理生化特性依据文献[10]的方法分析; 分子生物学鉴定采用上海生工生物技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取DNA, 将提取菌株的DNA进行PCR扩增, 反应引物为正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3′和反向引物1492R:5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′.采用琼脂糖凝胶电泳分离检测PCR产物, 产物的测序由上海生工生物技术有限公司完成.所得同源性最高的序列与GenBank中已登录的16S rRNA序列进行核苷酸同源性比较, 然后应用MEGA 5.0软件构建该菌株系统发育树.

1.3 菌株NP1的异养硝化与好氧反硝化特性分析

选取琥珀酸钠为碳源, 氮源分别采用氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐, 初始浓度均为100 mg·L-1.菌液接种量为1%, 在C/N为10、温度为30℃、转速为160 r·min-1(溶解氧浓度约为5.0 mg·L-1)条件下培养48 h, 定时测定其D600、氮素及磷酸盐浓度.

1.4 环境因子对菌株NP1异养硝化过程同步脱氮除磷性能的影响

分别研究碳源、温度、转速、C/N对氨氮和磷酸盐去除效果的影响.碳源包括蔗糖、柠檬酸钠、乙酸钠和琥珀酸钠; 温度分别为10、20、30和37℃; 摇床转速分别为80、120、160和200 r·min-1; C/N分别为2、5、10和15.固定单一影响因子变化, 其余反应条件不变, 分别为氨氮浓度100 mg·L-1、C/N=10、温度30℃以及转速160 r·min-1.将处于对数生长期的菌液以1%接种量接种到100 mL不同高压灭菌培养基中, 分别装于250 mL锥形瓶中, 摇床培养48 h, 定时取样测定其D600、氨氮及磷酸盐浓度.

1.5 生长及氨氮降解动力学分析

采用Logistic模型[5, 11]拟合菌株NP1异养硝化-好氧反硝化过程菌株生长特性.采用修饰过的Compertz模型[5, 12]对菌株NP1的异养硝化-好氧反硝化氮素和磷酸盐降解过程进行拟合.

1.6 分析方法

NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和PO43--P浓度均采用标准方法测定[13]; 菌体生长吸光度(D600)采用吸光度法测定; 动力学拟合采用软件Oringin 9.1.

2 结果与讨论 2.1 菌株的鉴定

菌株NP1菌落表面光滑、呈乳白色、直径约2 mm、不透明.革兰氏染色为阴性, 菌株呈杆状, 无鞭毛, 大小为0.4 μm×(1.0~1.5) μm.扫描电镜照片如图 1所示.

图 1 菌株NP1扫描电镜照片 Fig. 1 Scanning electron micrograph of strain NP1

经过16S rRNA测序比对, 初步确定分离菌株NP1为不动杆菌属(Acinetobacter).将菌株NP1与同源性较高的不动杆菌和其他异养硝化细菌进行系统发育分析(图 2), NP1与Acinetobacter junii strainWS14的相似性为100%, 进一步表明菌株NP1为Acinetobacter junii.

图 2 菌株NP1的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain NP1

2.2 菌株NP1异养硝化-好氧反硝化特性 2.2.1 异养硝化特性

图 3(a)所示, 菌株NP1经过6 h的停滞期后, 开始迅速生长, 24 h后达到稳定, 最大D600为1.224, 生长过程中最大比生长速率为0.34 h-1和最大氨氮降解速率为7.73 mg·(L·h)-1, 与菌株Acinetobacter sp. T1(0.101 h-1)[14]Bacillus strains(0.43 h-1)[15]相当.采用Logistic模型模拟菌株NP1异养硝化过程的生长特性, 拟合结果R2大于0.99, 说明该模型适应于菌株NP1的生长规律. 图 3(b)表示菌株NP1的氨氮降解过程和中间产物变化情况, 氨氮在24 h内快速降解, 反应过程氨氮最大去除率为99.12%, 总氮降解趋势与氨氮几乎一致, 最大去除率为98.73%.反应过程中生成微量的硝化中间产物(亚硝氮和硝氮), 但均快速降解.与此同时, 菌株生长过程中的内源氮的含量逐渐增大, 根据氮平衡分析, 内源氮含量约占去除总氮的53%.反应30 h后氨氮浓度逐渐增加, 表明此时菌群进入内源呼吸期, 之前用于细胞合成的氮源又再次分解为氨氮回到水中.由图 3(c)可见, 采用修饰过的Compertz模型对菌株NP1异养硝化过程的氨氮降解情况进行模拟, 拟合所得R2大于0.99, 表明菌株NP1的氨氮降解特性通过该模型能得到充分表征.

图 3 菌株NP1以氨氮为唯一氮源时的异养硝化特性 Fig. 3 Heterotrophic nitrification characteristics of strain NP1 with ammonia nitrogen as the sole nitrogen source

不同起始氨氮浓度的降解情况从图 3(d)可知, 氨氮起始浓度为50 mg·L-1时, 在24 h内基本完全降解, 氨氮最终去除率为99.83%, 由于氮源不足, 生长受到一定限制, 最大D600只有0.723.起始浓度为200 mg·L-1时, 菌体生长显著提高, D600最大为1.812, 48 h后氨氮降解至1.23 mg·L-1, 氨氮最终去除率为99.31%.起始浓度为500 mg·L-1和1 000 mg·L-1时, 菌体生长良好, 最大D600为1.917和1.864, 培养48 h后氨氮分别降至206.46 mg·L-1和436.15 mg·L-1, 氨氮最终去除率分别为58.42%和53.14%.故氨氮起始浓度较低时, 菌株长势良好, 氨氮基本完全降解, 但随着起始浓度的增加, 菌株则需要更长的适应时间.通过表 1可知, 随着起始浓度的增高(50~200 mg·L-1), t0从4.13 h上升到8.60 h, Rm由6.40 mg·(L·h)-1增加至12.86 mg·(L·h)-1, 说明在上述起始浓度范围内, 随着氨氮浓度的升高, 菌株NP1适应期延长, 但氨氮降解速率明显提高.起始浓度提高至1000 mg·L-1时, Rm显著提高, 这与宋宇杰[16]和Joo[17]等的研究发现Acinetobacter sp. Y1和Alcaligenes faecalis sp. No.4在高氨氮浓度下仍具有良好的异养硝化特性的结论一致.以上结果表明菌株NP1在高氨氮负荷下仍具有较高的异养硝化能力, 能够适应较宽范围的氨氮负荷, 具有处理高浓度氨氮废水的潜能.

表 1 菌株NP1在不同初始氨氮浓度下的氨氮降解动力学参数与最终去除率 Table 1 Kinetic parameters and final removal efficiencies of ammonium by strain NP1 under different initial ammonium concentrations

2.2.2 好氧反硝化特性

图 4可见, 菌株NP1能够利用亚硝酸盐和硝酸盐作为单一氮源进行生长代谢, 菌株生长良好, D600均在24 h左右取得最大值1.167和1.107, 这与菌株Enterobacter cloacae HW-15[18]Pseudomonas LHJ-1[19]等一致.如图 4(a)所示, 亚硝酸盐为唯一氮源时, 最大降解速率为7.53 mg·(L·h)-1, 总氮和亚硝氮最终去除率分别为88.31%和91.40%, 内源氮占去除总氮的47.74%, 反应过程几乎无中间产物生成.这与菌株Bacillus strain N31[20]Acinetobacter sp. YY-5[21]好氧反硝化过程没有明显的硝氮和亚硝氮积累的结论一致.当硝酸盐为唯一氮源时, 硝氮和总氮最终去除率分别为95.10%和86.24%, 内源氮占去除总氮的46.12%, 最大降解速率为7.87 mg·(L·h)-1.硝氮降解过程中, 9 h后存在亚硝氮累积现象, 最大累积量为8.52 mg·L-1, 表明菌株在以硝酸盐进行好氧反硝化过程中, 亚硝氮转化不及时造成明显积累, 这与菌株YL[22]的好氧反硝化特性一致.

图 4 以亚硝酸盐和硝酸盐为唯一氮源时菌株NP1的好氧反硝化性能 Fig. 4 Capabilities of aerobic denitrification by strain NP1 when nitrite and nitrate were used as sole N-source

表 2所示, Compertz模型可以较好地拟合菌株NP1异养硝化-好氧反硝化过程中氮素的降解情况, 拟合所得氮素最大降解速率Rm为:氨氮>硝氮>亚硝氮, 迟滞时间t0为:硝氮>亚硝氮>氨氮.以氨氮为氮源时, 氮素的去除率最高, 降解速率最大, 停滞时间最短, 其原因可能是反应过程中的氨氧化酶活性高于好氧反硝化酶活性, 以及高浓度的硝酸盐和亚硝酸盐更容易抑制菌株活性[9].

表 2 菌株NP1在不同氮源条件下氮磷的动力学参数与最终去除率 Table 2 Kinetic parameters and final removal rates of nitrogen and phosphorus by strain NP1 with different nitrogen sources

2.3 同步脱氮除磷特性

菌株NP1在不同氮源下的氮和磷降解过程如图 5所示, 随着菌株NP1的生长, 氮素和磷酸盐在培养过程中同步降解.当氨氮作为氮源时, 磷酸盐的最大去除率高于其他两种氮源, 即:氨氮(88.30%)>硝氮(79.70%)>亚硝氮(72.80%), 这与Enterobacter cloacae HW-15[18]等菌在不同氮源下磷酸盐的去除规律相同.由拟合结果可知, 氮源为氨氮时磷酸盐降解速率Rm为1.28 mg·(L·h)-1, 停滞时间t0为4.59 h, 而硝氮和亚硝氮氮源中的Rm分别为0.48 mg·(L·h)-1和0.41 mg·(L·h)-1, t0分别为8.90 h和5.60 h, 此结果与氮素降解动力学一致, 表明异养硝化过程更利于磷酸盐的同步去除.

图 5 菌株NP1分别以氨氮、亚硝氮、硝氮作为单一氮源时的同步脱氮除磷特性 Fig. 5 Simultaneous nitrogen and phosphorus removal by strain NP1 when ammonia, nitrite, and nitrate were used as the sole nitrogen source

氮源是菌株NP1生长代谢的重要因素, 缺乏氮源会限制菌体生长繁殖, 同时也会降低对磷的摄入.如图 6(a)所示, 当氮源浓度为0 mg·L-1时, 菌株NP1几乎没有生长, 磷的去除率只有7.3%.随着氮源浓度的增加, 菌株NP1的生长量明显增加, 最大D600值为1.141, 氮磷的去除率也显著增长.当氮源浓度为50~200 mg·L-1时, 氨氮基本完全降解, 同时磷酸盐的去除率持续增加, 分别为45.89%、88.35%和90.02%.但是, 当氮源浓度增加到500 mg·L-1时, 磷酸盐的去除率没有变化, 而氨氮的去除率下降到58.63%, 这可能因为磷酸盐的含量不足所致.同时, 磷源也是细菌生长元素之一, 由图 6(b)可以看出, 在无磷环境中, 菌株NP1生长缓慢, 最大D600值为0.131.随着磷浓度的增加, 菌株NP1在48 h内的生长量明显增加, 在10~100 mg·L-1时最大D600值分别为1.144、1.141、1.157、1.815, 并且氨氮的去除率明显提高.但当磷浓度为50和100 mg·L-1时, 磷酸盐的去除率只有44.65%和21.72%.因此, 适当的氮磷比有利于氮磷的同步去除, 当氮磷比为5:1时, 最大氨氮和磷酸盐去除率分比为99.21%和88.35%.

图 6 菌株NP1同步脱氮除磷过程中氮磷相互影响特性 Fig. 6 Interaction characteristics of nitrogen and phosphorus during simultaneous nitrogen and phosphorus removal by strain NP1

2.4 环境因子对菌株NP1脱氮除磷特性及氨氮降解动力学分析 2.4.1 碳源

图 7(a)所示, 当碳源为蔗糖时, 菌株NP1生长缓慢, D600最高值仅为0.166, 氮磷降解效果较差, 反应完成后氮和磷酸盐去除率仅为28.06%和24.26%;当碳源是柠檬酸钠、乙酸钠和琥珀酸钠时, 菌株NP1生长良好, D600最高值分别为1.144、1.356和1.224, 氨氮基本完全去除, 磷酸盐去除率分别达到87.68%、83.26%和88.35%.这说明菌株NP1对有机酸的利用率高于大分子糖类[23].就氨氮降解情况而言, 根据拟合结果(表 3), 碳源为蔗糖时, 氨氮最大转化速率Rm为0.31 mg·(L·h)-1, 这与Yang等[23]发现Bacillus subtilis A1能够利用葡萄糖进行生长代谢结论不同.碳源为有机酸时, 琥珀酸钠的Rm为9.29 mg·(L·h)-1, t0为4.24 h, 与柠檬酸钠和乙酸钠相比, 是最理想的异养硝化碳源.这与菌株Pseudomonas sp. N6[24]Diaphorobacter sp. PD-7[25]更容易利用小分子碳源一致.

图 7 环境因子对菌株NP1生长及同步脱氮除磷特性影响 Fig. 7 Effect of environmental factors on growth and simultaneous nitrogen and phosphorus removal by strain NP1

表 3 菌株NP1在不同环境条件下的氨氮降解动力学参数 Table 3 Kinetic parameters of ammonium degradation by strain NP1 under different environmental conditions

2.4.2 温度

图 7(b)所见, 温度为10℃时, 菌株NP1几乎不生长, 经过48 h反应后, 氮磷的去除率仍较低, 氨氮和磷酸盐最终去除率只有18.37%和15.20%.根据氨氮降解动力学分析, Rm=0.68 mg·(L·h)-1, t0=8.33 h, 菌株NP1需要更长的时间以适应低温环境.随着温度升高, 菌体生长量和氮磷去除率增加, 当温度为30℃时, 菌株生长和氮磷去除达到最大, D600=1.224, 氨氮和磷酸盐去除率分别为99.24%和88.35%.在37℃时, 氨氮和磷酸盐浓度去除率降低, 但Rm取得最大值20.09 mg·(L·h)-1, 这可能因为随着温度升高, 生长初期促进菌株生长代谢, 后期导致生物活性物质变性, 细胞功能下降甚至死亡, 从而导致最终去除率降低[22, 26].由表(3)可知, 随着温度的升高, Rm明显增加, t0随着温度升高而降低, 说明在一定范围内, 温度越高越有利于接种菌株初期生长.菌株NP1的最佳反应温度为30℃, 这与大多数异养硝化菌的最佳温度(30~37℃)相同[22].

2.4.3 转速

摇床转速与培养基中DO密切相关, 转速越大, DO浓度越高.随着转速的增加, 菌体的生长与氮磷去除均有所提高.在4种转速条件下, 除80 r·min-1以外, 氨氮和磷酸盐的最终去除率都在99%和80%以上.低转速下氮和磷的不完全去除可能是因为转速太低, DO不足所致.就氨氮降解情况而言, 如表 3所示, Rm随着转速的升高显著增加, 高转速条件有利于氨氮的快速转化, 此结果可能与高转速时较快的基质转移速率相关[27, 28].综上所述, 转速为160 r·min-1最为经济.

2.4.4 C/N

在低C/N条件, 菌株生长缓慢, 氨氮和磷酸盐去除效果差.在C/N=2时, 最大D600为0.41, 氨氮和磷酸盐去除率均低于40%, 这主要是由于碳源不足抑制菌体的生长代谢和基质降解[29, 30].当C/N为10和15时, 菌株NP1生长良好, 氮磷的去除性能明显提高, 最大D600为1.191和1.201, 氨氮和磷酸盐的最终去除率分别为99.17%、88.38%和99.09%、86.30%.由氨氮拟合结果可见(表 3), Rm随着C/N的提高而增加, 当C/N为10和15时, Rm分别为9.29和12.61 mg·(L·h)-1, t0分别为4.24和8.20 h.相比较, C/N=15时的氨氮最大转化速率比C/N=10时略有增加, 但停滞时间也有所延长, 氨氮最终去除率无明显变化.因此, 确定最佳的C/N为10.

3 结论

(1) 菌株NP1具有高效的异养硝化能力, 氨氮最大去除率达99.12%, 反应过程只有少量的硝化中间产物累积, 并且能够耐受较高的氨氮负荷.同时, 菌株NP1具有良好的好氧反硝化特性, 能够利用亚硝酸盐和硝酸盐进行生长代谢, 最大去除率分别为91.40%和95.10%.

(2) 菌株NP1异养硝化过程还伴随着同步的聚磷作用, 适当的氮磷比有利于氮磷的同步去除, 当氮磷比为5:1时, 最大氨氮和磷酸盐去除率分别为99.21%和88.35%.

(3) 菌株NP1生长特性符合Logistic模型(R2>0.99), 氮磷降解过程则与修饰的Compertz模型相匹配(R2>0.99), 拟合所得氮和磷酸盐最大转化速率Rm为:氨氮>硝氮>亚硝氮, 迟滞时间t0为:硝氮>亚硝氮>氨氮.

(4) 菌株NP1同步脱氮除磷最适宜的条件为碳源是琥珀酸钠、C/N=10、T=30℃以及r为160 r·min-1.

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