2019, Vol. 40
2. 桂林理工大学岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心, 桂林 541004;
3. 桂林理工大学广西矿冶与环境科学实验中心, 桂林 541004;
4. 桂林理工大学广西环境污染控制理论与技术重点实验室, 桂林 541004
, JIN Zhen-jiang1,2,3,4
, YUAN Wu1 , CHENG Yue-yang1 , QIU Jiang-mei1 , LIANG Jin-tao1 , PAN Fu-jing1,2,3,4 , LIU De-shen1,2,3,4
2. Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China;
3. Guangxi Scientific Experiment Center of Mining, Metallurgy and Environment, Guilin 541004, China;
4. Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China
湿地是由陆地生态系统和水体生态系统相互作用而形成的自然综合体[1], 是陆地生态系统碳的重要储存库[2], 因此, 湿地碳库的变化对全球气候变暖、维护生态平衡有着极其重要的意义[3].土壤微生物不仅是湿地土壤的重要组成部分, 而且对土壤物质循环起着重要的推动和调控作用[4].细菌是微生物中重要类群之一, 其群落结构与土壤的理化性质和环境因子息息相关[5].而土地利用方式会对土壤性质和环境产生显著影响[6], 因此带来细菌群落结构的演变, 这将直接影响土壤物质循环的过程.
解析湿地系统土壤微生物群落结构的方法多种多样[7], 这些方法主要包括BIOLOG平板分析法[8], 磷酸脂肪酸(PLFA)法[9], 群落水平分解代谢谱[10], 聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)法[11]和基于16S rDNA与功能基因的RT-qPCR法[12].这些方法分析湿地系统不同土地利用类型下土壤微生物群落结构, 发现土地利用改变了天然湿地土壤微生物生物量、微生物的碳源代谢多样性和微生物群落结构与多样性.近年来, 高通量测序技术得到了快速的发展, 为深入研究湿地系统土壤微生物的群落结构与组成在不同分类水平上的变化提供了更加准确和全面的途径.
桂林会仙岩溶湿地是我国中低纬度低海拔地区面积最大、最具代表性且保存最好的天然湿地[13], 近年来, 由于气候变化与人为的围垦和破坏, 会仙湿地面积目前仅为6.3 km2[14].其中部分湿地被利用为农作用地.在会仙岩溶湿地系统内, 稻田的pH和土壤总有机碳等指标与天然湿地比较接近, 而显著高于旱地[15]; 且与旱地相比, 稻田具有较高的土壤微生物生物量和微生物功能活性[6].另外, 有人对会仙湿地中不同类型土壤的养分含量[15]、微生物活性[6]和土壤酶活性[6]做了研究, 湿地底泥可培养微生物[7]和产甲烷菌群落组成与活性[16]也有报道.但是, 对于岩溶天然湿地土地利用方式改变后, 土壤细菌群落结构在不同分类水平上的变化, 还未见报道.
因此, 本文以起源于会仙湿地系统内的天然湿地、稻田和旱地的表层土壤为研究对象, 通过高通量测序的方法, 对不同土地利用方式的土壤细菌群落进行分析比较, 探讨这3种土地类型下土壤细菌的群落结构特征与理化因子的关系, 以期为会仙湿地系统的保护提供参考.
1 材料与方法 1.1 样品采集与前处理会仙岩溶湿地位于广西桂林市临桂区东南部的会仙镇, 距桂林市区约35 km.桂林市地处低纬度, 为亚热带季风气候.年平均降水量1 915.2 mm, 年平均气温为18℃. 2017年8月, 选取具有代表性的天然湿地(nature wetland, NW)、稻田(paddy field, PF)和旱地(dry land, DL), 采集耕层土壤(0~20 cm).每种土地利用方式选取3个样地.在每块样地中, 随机选取3个采样点, 采集3个等量土壤样品均匀混合为1个样本.样品带回实验室后, 去除植物根系和石块等杂物, 放入－80℃冰箱储存, 以备提取土壤微生物DNA和进行微生物分析; 一部分测定含水率后, 在阴凉处自然风干后研磨, 分别过0.85、0.25和0.15 mm筛后于阴凉处保存, 用于测定土壤理化性质.
1.2 土壤理化性质土壤理化性质的分析方法参照文献[17]进行.其中, 土壤含水率采用烘干法; pH采用无CO2蒸馏水做浸提剂, 按照土水1 :2.5的比例浸提, 用精密pH计(型号：IS128C)测定; 土壤有机碳(SOC)采用浓硫酸-重铬酸钾外加热法; 溶解性有机碳(DOC)采用水土振荡提取法; 土壤总氮(TN)采用浓硫酸消煮-凯氏定氮法; 碱解氮(AN)采用碱解扩散法; 阳离子交换量(CEC)EDTA-铵盐快速法; 土壤速效磷(AP)采用盐酸-氟化铵法; 土壤总磷(TP)采用碳酸钠熔融法; 交换性钙镁采用ICP-OES法.土壤理化性质见表 1.
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表 1 3种土地利用方式土壤的理化性质 Table 1 Soil physical and chemical properties under three land-use types |
1.3 高通量测序
(1) DNA提取及高通量测序
采用DNA快速提取试剂盒(Power Soil, Mo Bio公司)提取土壤总DNA, 使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA.对16S rDNA V4区域进行扩增, 引物序列为515F(5′-GTGYCAGCCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).每个样本进行3个重复, 每个PCR反应终止于线性扩增期, PCR结束后将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 检测后按照操作步骤使用OMEGA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物, TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段.测序由成都罗宁生物公司使用Illumina MiSeq PE250平台进行, 双端测序得到的PE reads首先是由FLASH进行拼接, 同时对序列质量进行质控, 在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤, 得到可供后续分析的高质量目标序列.
(2) OTUs聚类
在97%的相似性水平上使用UPARSE算法进行OTUs的聚类, 挑选出OTUs的代表性序列, 使用Uchime去除嵌合体, 使用Silva等数据库进行物种分类信息的划分.
(3) 多样性指数分析
单样本的多样性分析(α多样性)可以反映细菌群落的丰度和多样性, 通过Chao指数、Ace指数来分析样品中细菌群落的丰富度, Shannon指数和Simpson指数来分析样品中细菌群落的多样性(Simpson指数与细菌多样性呈反比, 值越大, 多样性越低), 序列数和OTUs个数均可以显示土壤细菌群落的丰度与多样性.
1.4 数据分析利用EXCEL 2003进行数据处理, 用SPSS 19.0软件进行差异显著性分析和主成分分析.利用ORIGIN 9.5绘制微生物群落在门和纲水平上的丰度图.将数量大于总OTUs数0.3%的OTUs界定为优势OTUs, 利用R语言绘制优势OTUs的聚类热图.为了进一步分析土壤微生物与环境因子之间的关系, 采用本文中测得的所有土壤理化因子数据作为环境变量和优势OTUs作为微生物变量, 用Canoco5绘制冗余分析(RDA).
2 结果与分析 2.1 3种利用类型下土壤细菌α多样性的特征本研究中, 共获得347 038条序列、18 356个OTUs.它们分属于细菌的49门、145纲、325目、628科、1 231属和1 533种. 3种土地利用下土壤细菌的α多样性见表 2, 从中可以看出, 会仙湿地3种土地利用下, 稻田土壤细菌的Shannon指数显著高于天然湿地和旱地, 天然湿地土壤细菌的Simpson指数显著低于稻田和旱地, 其它的多样性指数没有显著差异.
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表 2 3种土地利用下土壤微生物多样性指数 Table 2 Microbial diversity index under three land-use types |
2.2 3种利用类型下土壤细菌的群落组成特征
如图 1(a)和1(b)所示, 本研究中得到的OTUs所属的相对丰度大于1%的8个门约占到所有细菌的85%~93%.其中, 天然湿地的Firmicutes(厚壁菌门)显著高于稻田和旱地, 稻田的Chloroflexi(绿弯菌门)显著高于天然湿地和旱地, 稻田和旱地的Acidobacteria(酸杆菌门)显著高于天然湿地, 稻田的Nitrospirae(硝化螺旋菌门)显著高于旱地, 旱地的Bacteroidetes(拟杆菌门)显著高于天然湿地和稻田, 旱地的Actinobacteria(放线菌门)显著高于稻田且显著低于天然湿地. Proteobacteria(变形菌门)和Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)在3种土地利用方式土壤中相对丰度没有显著差异.
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(a)~(d)中的不同字母表示数值在0.05水平上的差异显著性 图 1 3种土地利用方式土壤细菌门和纲水平OTUs丰度以及与土壤因子的关系 Fig. 1 OTU abundance of soil bacteria at the phylum and class levels, and its relationship with soil factors under three land-use types |
如图 1(c)和1(d)所示, 3种土地利用方式土壤中检测到的相对丰度大于1%的10个主要菌纲占到所有细菌的80%~91%.其中, 天然湿地和旱地的α-Proteobacteria(α-变形菌纲)显著高于稻田, 稻田的δ-Proteobacteria(δ-变形菌纲), Anaerolineae(厌氧绳菌纲)和Nitrospira(硝化螺旋菌纲)显著高于旱地, 稻田和旱地的Acidobacteria(酸杆菌纲)显著高于天然湿地, 旱地的Actinobacteria(放线菌纲)显著高于稻田且显著低于天然湿地. β-Proteobacteria(β-变形菌纲)、γ-Proteobacteria(γ-变形菌纲)、Clostridia(梭菌纲)和Gemmatimonadetes(芽单胞菌纲)在3种土壤中相对丰度没有显著差异.
如图 1(e)和1(f)所示, 对3种土地利用土壤理化因子和优势门、纲分别做冗余分析, 可以看到3种土地利用下的土壤能够很好地区分开.其中, 酸杆菌门、拟杆菌门和酸杆菌纲与DOC、AP、交换性镁、AN和TN呈显著正相关(P < 0.05);绿弯菌门和δ-变形菌纲与TN、AN和SOC呈显著正相关(P < 0.05);厌氧绳菌纲与SOC、pH和交换性钙呈显著正相关(P < 0.05);放线菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌纲和梭菌纲与C/N和CEC呈显著正相关(P < 0.05);芽单胞菌门、芽单胞菌纲和α-变形菌纲与CEC呈显著正相关.总之, 影响3种土地利用下土壤细菌群落结构的土壤因子有pH、SOC、TN、AN、交换性镁、交换性钙、DOC和AP.
2.3 聚类分析在本研究中, 天然湿地的优势OTUs有15个, 它们分别有8个属于变形菌门, 6个属于放线菌门, 1个属于芽单胞菌门; 其中, 2个属于α-变形菌纲, 2个属于β-变形菌纲, 3个属于γ-变形菌纲, 1个属于δ-变形菌纲, 6个属于放线菌纲, 1个属于芽单胞菌纲.
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Ⅰ:界; Ⅱ:门; Ⅲ:纲; Ⅳ:目; Ⅴ:科; Ⅵ:属; Ⅶ:种 图 2 基于细菌群落OTUs丰度的热图 Fig. 2 Heatmap based on OTUs abundance |
稻田的优势OTUs有12个, 它们分别有6个属于变形菌门, 6个属于酸杆菌门; 其中, 1个属于α-变形菌纲, 3个属于β-变形菌纲, 1个属于γ-变形菌纲, 1个属于δ-变形菌纲, 5个属于酸杆菌纲, 1个属于全噬菌纲.
旱地的优势OTUs有11个, 它们都属于变形菌门, 其中, 有5个属于α-变形菌纲, 3个属于β-变形菌纲, 2个属于γ-变形菌纲, 1个属于δ-变形菌纲.优势OTUs的分布结果显示了3种不同土地利用方式下, 土壤细菌在不同分类水平上具有显著差异.
对优势OTUs进一步地分类发现, 天然湿地的主要优势菌属是Sphingomonas(OTU2和59)、Micromonospora(OTU5、24和50487)、Gemmatimonas(OTU1)和Stenotrophomonas(OTU8);稻田的主要优势菌属是Lysobacter(OTU4和115)和Aquabacterium(OTU33);旱地的主要优势菌属是Sphingomonas(OTU85、157和2916)、Rhodanobacter(OTU19和52)和Phenylobacterium(OTU60).
2.4 细菌群落结构与土壤理化因子的RDA分析图 3分别为优势菌与理化性质的冗余分析(RDA)和优势OTUs与理化性质相关性的热图.
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图(a)中1~36的编号与图(b)中的序号相对应 图 3 基于优势OTU与环境因子的冗余分析 Fig. 3 RDA based on dominant OTU and environmental factors |
图 3(a)直接反映了细菌群落分布与环境因子的关系, 显示不同土地利用下的的细菌类别与环境因子的关系差异较大.其中Lysobacter和Aquabacteriu与pH、SOC、AN和TN显著正相关(P < 0.05), Phenylobacterium、Rhodanobacter、Massilia和Pseudomonas与交换性镁、DOC、AP和CEC显著正相关(P < 0.05), Methyloversatilis、Hyphomicrobiaceae、Sphingomonas、Ramlibacter、Micromonospora、Nocardioides和Streptomyces与CEC和C/N显著正相关(P < 0.05), Gemmatimonas和Stenotrophomonas与pH、SOC、C/N、交换性钙和TP显著正相关(P < 0.05).因此, 影响优势OTUs的主要土壤因子为pH、SOC、TN、AN、交换性镁、交换性钙、DOC和AP.
3 讨论 3.1 土地利用变化对会仙湿地系统土壤细菌优势门和纲的影响土壤微生物多样性指数表示生物群落中的物种多寡, 数值越大表示物种越丰富; 优势度指数越大, 生物群落内的优势种越突出, 生物种群丰度和多样性指数高是生态环境健康稳定的重要表现[18].由表 2可知, 稻田的Shannon指数大于天然湿地和旱地, 而天然湿地的Simpson指数显著低于稻田和旱地, 说明在这3种土地利用方式下的土壤中, 天然湿地和稻田的细菌多样性均高于旱地, 这与对鄱阳湖湿地围垦和退耕后土壤细菌多样性变化的研究结果相一致[19].在这个研究中, 细菌多样性为天然湿地>稻田>旱地, 这是因为施肥等管理方式会导致细菌多样性下降, 而稻田相比旱地, 具有含量较高的碳源和氮源, 故稻田土壤细菌多样性较高.结果表明, 改变湿地的土地利用方式会改变土壤的理化性质等环境因子, 从而改变土壤微生物的群落结构[20~22].在本研究涉及的会仙岩溶湿地系统中, 3种土地利用方式下土壤中检测到的主要门有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门和拟杆菌门共8个门.其中, 前4个菌门为土壤中最优势的菌门, 占细菌群落总量的79.28%~84.41%, 这也与已有的关于土壤细菌群落结构的研究结果是一致的[11, 23, 24].不同的土地利用方式下土壤细菌群落物种组成相似, 但不同分类水平上的相对丰度均存在差异, 可能是因为植被类型的不同以及水分和营养条件的改变[24~26].在本研究中, 天然湿地的优势菌门为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门, 稻田和旱地的优势菌门均为变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门, 但丰度有所差异.通过RDA分析[图 1(e)]发现, 变形菌门细菌的丰度与CEC和C/N呈显著正相关; 放线菌门细菌的丰度主要受C/N的影响; 酸杆菌门细菌的丰度与DOC、AP、TN、AN和交换性镁显著正相关; 绿弯菌门细菌的丰度与SOC、TN和AN显著正相关.酸杆菌门的细菌被分为26个亚群, 不同的亚群, 甚至同一个亚群的不同菌种对土壤因子的响应也存在差异[27].在本研究中, 酸杆菌优势的亚群为GP4、GP6、GP7、GP17和酸杆菌目(GP1)(图 4), 其中GP4细菌的丰度与TN、AN和交换性镁呈显著正相关, GP6、GP7和GP17细菌的丰度与pH、SOC、TN和AN呈显著正相关, 酸杆菌目细菌的丰度与pH呈显著负相关.在本研究中, 虽然变形菌门在3种土地利用方式的土壤中差异并不显著, 但是α-变形菌纲和δ-变形菌纲在3种土地利用方式土壤中的丰度有所差异.通过RDA分析[图 1(f)]发现, α-变形菌纲主要受CEC的影响, δ-变形菌纲与SOC、TN和AN呈显著正相关.这说明不同的土地利用方式明显地改变了土壤的理化性质, 从而影响了土壤细菌在门和纲水平上的群落结构特征.
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图(a)中的不同字母表示数值在0.05水平上的差异显著性 图 4 酸杆菌门优势亚群相对丰度以及与土壤因子的关系 Fig. 4 Relative abundance of dominant subgroups of Acidobacteria and their relationship with soil factors |
在本研究所涉及的稻田优势OTUs中, OTU23、29、79、103、88和45属酸杆菌纲, OTU63属全噬菌纲, 它们均属于酸杆菌中的4个亚群(GP4、6、7和17).分析表明它们与pH、SOC、TN、AN和交换性镁呈显著正相关.这表明在岩溶区湿地的稻田中, 酸杆菌门的细菌受这些土壤因子的敏感调节.这个结论同交换性镁和pH与酸杆菌门这4个亚群的丰度呈显著正相关关系的结论[27]是一致的.尽管OTU4和115同属溶杆菌属(Lysobacter), 但是OTU4在稻田中的丰度显著高于天然湿地和旱地, 而OTU115在天然湿地土壤中的丰度较高.有研究表明, 溶杆菌属可以在厌氧情况下分解土壤中的有机物[28].稻田和天然湿地同为长期淹水状态, 具备良好的厌氧条件, 表明溶杆菌属的细菌可能在这两种土地利用方式的土壤有机质降解中具有重要的作用. 图 3中显示的稻田土壤中OTU33等15个OTUs的丰度与SOC、AN和TN等多个土壤因子呈显著的正相关关系, 表明稻田中较高的碳氮含量能够显著促进这些细菌的生长.
在天然湿地的优势OTUs中, OTU5、50487和24为小单孢菌属(Micromonospora), 属于放线菌门. RDA分析显示, 小单孢菌属与C/N呈显著正相关. Zvyagintsev等[29]在对俄罗斯的一个盐碱土壤细菌群落的分析中发现, 小单孢菌属为嗜碱性放线菌, 施肥能够增加稻田的TN和TP含量而降低C/N, 进而影响了小单孢菌属的丰度[30].此外, 还有研究表明, 小单孢菌属与铜等重金属含量呈正相关关系[31].在本研究所涉及的会仙天然湿地, 尽管铜等重金属含量高于广西土壤背景值[32], 但是小单孢菌属与这些重金属的关系需要进一步地研究. OTU1为芽单胞菌属, 属于芽单胞菌门.在本研究中, 芽单胞菌属与土壤的C/N呈显著正相关.对澳大利亚的一个稻田土壤的研究发现, 施加较高C/N的有机肥料后, 芽单胞菌属的丰度显著较高[33].在我国黄土高原, 天然植被在被扰动后, 土壤C/N显著升高, 芽单胞菌属丰度也得到了显著地升高[34].这与本研究的结果是一致的, 说明在会仙岩溶湿地中, C/N对芽单胞菌丰度的影响较大. OTU2、28、59、85、157和2916属于α-变形菌纲的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas), 为本研究中3种土地利用下土壤中丰度最高的菌属, 且天然湿地和旱地的丰度显著高于稻田.其中, OTU2和59为天然湿地的优势OTUs; OTU85、157和2916为旱地的优势OTUs; OTU28在3种土地利用方式土壤中无显著差异.由图 3(b)知, OTU2和59与C/N、CEC和交换性钙呈显著正相关, OTU28与SOC、AN和TN呈显著正相关, OTU85、157和2916则主要受CEC、AP和交换性镁的影响, 这些相关性表明鞘氨醇单胞菌属这些优势细菌受环境岩溶中众多重要生态因子的调节.
在旱地的优势OTUs中, OTU120属于黄色杆菌科(Xanthobacteraceae), 通过RDA分析发现, 其丰度主要受AP、DOC和交换性镁的影响. OTU203属于Massilia属, 属于β-变形菌纲, 其丰度与CEC、AP、DOC和交换性镁呈显著正相关. Massilia是一种旱地常见的根际微生物, 与旱地的耕作和施肥等管理方式有关[35, 36], 表明速效养分能够促进Massilia细菌的生长. OTU19和52属于产黄杆菌属(Rhodanobacter), 与AP、DOC和交换性镁呈显著正相关.这与马垒等[37]和林业春等[38]的研究结果不同, 因为这两篇文章的研究结果来自旱地, 而本文中稻田和天然湿地均为湿地, 表明产黄杆菌属的细菌还受到土壤水分、通气状况等因子的影响. OTU60属于苯基杆菌属(Phenylobacterium), 在我国宁夏银北的盐碱地中, 种植锦鸡儿[Caragana sinica (Buchoz) Rehd]能够显著降低土壤pH, 但苯基杆菌属丰度显著升高[39], 这与本研究中苯基杆菌属与pH呈显著负相关的结果是一致的.此外, 在对饱水木器漆中微生物群落的研究中发现, 水样品中苯基杆菌属丰度显著低于木样品[40].这些研究均表明苯基杆菌属对较低pH的旱地土壤具有良好的适应性.
4 结论(1) 在会仙湿地系统中, 天然湿地的优势菌门为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门; 稻田和旱地的优势菌门均为变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门, 但丰度有所差异.天然湿地的优势菌纲为α-变形菌纲、β-变形菌纲和放线菌纲; 稻田的优势菌纲为酸杆菌纲、β-变形菌纲和δ-变形菌纲; 旱地的优势菌纲为α-变形菌纲、β-变形菌纲和酸杆菌纲.
(2) 优势OTUs中, 天然湿地的主要优势菌属是Sphingomonas(OTU2和59)、Micromonospora(OTU5、24和50487)、Gemmatimonas(OTU1)和Stenotrophomonas(OTU8);稻田的主要优势菌属是Lysobacter(OTU4和115)和Aquabacterium(OTU33);旱地的主要优势菌属是Sphingomonas(OTU85、157和2916)、Rhodanobacter(OTU19和52)和Phenlobacterium(OTU60).
(3) 土地利用变化引起的环境因子的变化, 并显著改变了会仙湿地土壤细菌群落结构, 主要影响细菌群落结构的土壤因子有pH、SOC、TN、AN、交换性镁、交换性钙、DOC和AP.
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