2019, Vol. 40
, LI Zai-xing , SUN Yue , HUO Ran , MENG Wen-ru , WANG Ling-xiao , SHEN Shao-heng , YANG Zi-cheng , ZHOU Shi-lei
随着经济的不断发展和城市化进程的加快, 城市水系作为重要的生态屏障, 是城市的重要组成部分.因此, 景观水体作为城市水系的主要部分, 已成为我国城市规划建设的重要内容[1].由于景观水体具有自身面积小、流动缓慢、自净能力不强等特点, 很容易出现水体水质下降的现象[2]; 加之周边环境中大量的氮、磷和有机物等面源污染物输入水体, 造成的水体富营养化, 甚至恶化为黑臭水体.其中, 氮素作为造成富营养化的主要因素, 成为人们研究的主要污染物[3].比如李萍等[4]研究的湿地景观水体, 春季水体中总氮约达5mg·L-1, 为劣V类水体; 于丹等[5]研究的天津市某景观水体发现, 该水体为中-富营养化水平, 春季水体中总氮含量约为1.5mg·L-1, 虽为V类水质, 但远超富营养水平阈值(TN为0.2mg·L-1); 杜奕衡等[6]研究的白洋淀沉积物中大量的铵态氮释放至上覆水中导致富营养化.同时, 国家已经把氨氮作为主要的污染指标列入黑臭水体的污染评价.因此, 开展景观水体的水质特征分析, 尤其是氮素污染特征分析对富营养化控制愈加重要.
众所周知, 反硝化作为氮素去除的关键过程, 已成为研究者开发高效脱氮菌剂的研究热点.其中同源二聚体细胞色素cd1亚硝酸盐还原酶(nirS)由于在反硝化细菌中广泛存在, 并且作为整个反硝化过程的限制步骤, 被众多研究者作为反硝化标识基因[7~10], 比如, 程建华等[9]研究了铜陵市河流沉积物菌群的反硝化群落结构, 结果表明反硝化功能基因以nirS为主, 其丰度平均值为nirK的28.35倍.Kim等[11]的研究表明, nirS编码的亚硝酸盐还原酶较nirK更容易接收电子.康鹏亮等[10]基于nirS研究了湖库沉积物中细菌的反硝化群落结构, 混合菌群种群结构差异显著.综上, 基于nirS基因研究水体中反硝化细菌群落结构, 对开发高效脱氮菌剂具有重要意义.
尤其是在春季, 水体处于温度急剧上升、水质变化较快、水体富营养化未发生的特定时期, 开展该时期的水质特征以及反硝化细菌群落组成的研究, 对日后分离适于该时期的高效脱氮菌提供技术支持.因此, 本研究将从春季典型景观水体水质现状出发, 研究氮素和有机物组成, 并利用分子生物学技术对水体中nirS型反硝化细菌群落结构进行分析, 通过冗余分析(RDA)来探究反硝化细菌群落组成与环境因子的关系, 以期为富集驯化适于春季特定景观水体水质特征的高效反硝化菌提供技术指导.
1 材料与方法 1.1 采样点概况本研究选取石家庄市主城区具有代表性的4个城市景观水体, 景观水体中采样点设置如图 1, 桥西区的裕西公园(YX：38.03°N, 114.41°E)位于石家庄市紧贴西二环的正西方向, 湖面面积60 000 m2; 新华区的水上公园(SS：38.07°N, 114.45°E)位于城市二环内西北方向, 湖面面积113 000 m2; 长安区的长安公园(CA：38.04°N, 114.51°E)位于城市中心, 湖面面积60 000 m2; 裕华区的世纪公园(SJ：38.01°N, 114.53°E)位于城市的东南方向, 湖面面积53 000 m2.公园的补给水一部分为滹沱河流入城区的水, 另一部分为城市污水处理厂和自来水厂尾水.
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图 1 景观水体采样点示意 Fig. 1 Location of sampling sites in park water body |
2018年4月在石家庄市4个典型城市景观水体采集水样, 将每个景观水体中心作为采样点, 采用有机玻璃取水器在每个采样点采集表层水样(水面以下0.2 m)2 L, 装入灭菌塑料瓶中, 置于放有冰袋的箱子中立即运回实验室, 用于各项水质指标的测定和反硝化细菌群落结构分析.
1.3 水质指标测定现场测定景观水体温度、pH和溶解氧(DO)(DS5X便携式分析仪, 美国HACH公司).高锰酸盐指数、总氮(TN)、溶解性总氮(TDN)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)、总磷(TP)、铁(Fe)和锰(Mn)等均参照文献[12]测定(紫外-可见分光光度计, UV-5100).其中, TN采用碱性过硫酸钾消解法, NH4+-N采用纳氏试剂比色法测定, NO3--N采用紫外分光光度法, NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法, TP采用过硫酸钾氧化-钼锑抗分光光度法测定, Fe采用邻菲啰啉分光光度法, Mn采用高碘酸钾氧化分光光度法.NH4+-N、NO3--N、NO2--N和TDN的水样预处理为经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤.醋酸纤维滤膜经过3次超纯水煮沸, 每次沸腾0.5 h以去除杂质[13].此外, 取1 000 mL的各景观水体水样经0.22 μm醋酸纤维膜负压过滤, 收集滤膜, 置于10 mL的无菌离心管中, 于-80℃的超低温冰箱中保存至DNA提取.
1.4 三维荧光光谱分析将所取景观水体水样过0.45 μm醋酸纤维膜后保存, 待用.荧光光谱测定仪器为日立公司生产的Hitachi F-7000型荧光光度计, 仪器基本设置参数如下：150 W氙灯为激发光源, 9PMT电压设为700 V; 激发和发射单色仪的狭缝宽度均设为10 nm, 扫描速度为2 400 nm·min-1, 扫描光谱进行仪器自动校正.激发波长(Ex)范围为220~400 nm, 步长5 nm; 发射波长(Em)范围为250~550 nm, 步长1 nm.以Milli-Q水作空白, 样品所测数据均扣除空白值.
荧光指数(FI)是指样品Ex=370 nm, Em在470 nm与520 nm波长处荧光强度的比值[14], 作为衡量CDOM来源及降解程度的指标.自生源指数(BIX)为Ex=310 nm、Em在380 nm与430 nm处荧光强度比值[15], 是评价CDOM腐殖化程度的重要指标, 能一定程度上反映CDOM输入源特征.HIX是Ex=254 nm, Em在435~480 nm荧光强度积分值除以300~345 nm与435~480 nm间荧光强度积分值之和[16], HIX指数越高则表示DOM腐殖化程度越高.新鲜度指数(β：α)为Ex=310 nm, Em=380 nm处荧光强度与420~435 nm区间最大荧光强度的比值[15], 可为定量评估水体生物活性提供依据.
1.5 水体反硝化细菌群落结构测定 1.5.1 样品总DNA提取在超净工作台, 分别取1 L的水样经0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤, 采用水体DNA提取试剂盒(Water DNA Kit, Omega, USA)提取水体微生物总DNA.利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测抽提总DNA, 测量DNA浓度(NanoDrop 2000), 保存在-20℃待用.
1.5.2 高通量测序采用通用引物(Cd3Af/R3cd)反硝化细菌功能基因nirS进行PCR扩增, 修饰后的通用引物Cd3Af/R3cd含有不同的标签从而区分不同样品.PCR反应体系为20 μL：DNA模板10 ng、FastPfu缓冲液4 μL、dNTPs 2 μL(2.5 mmol·L-1)、FastPfu聚合酶0.4 μL、Forward Primer 0.8 μL(5 μmol·L-1)、Reverse Primer 0.8 μL(5 μmol·L-1)、用ddH2O补足至20 μL[17].PCR反应参数：95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 35个循环, 72℃延伸10 min(上海美吉生物公司).
1.5.3 生物信息处理利用Trimmomatic质控软件和FLASH拼接软件, 将高通量测序得到的双端序列数据, 通过PE reads之间的overlap关系, 将成对的reads拼接(merge)成一条序列, 同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤, 根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列, 并校正序列方向, 获得优化序列196 167条.通过Silva数据库对所得数据进行比对, 根据分类注释结果对物种组成进行分类, 合并丰度小于1%的数值, 再通过Mothur按97%序列相似度划分成可操作分类单位(OTU), 进而分析α多样性、物种组成、样本比较分析.
1.6 数据处理采用Excel 2016进行数据处理, Origin 8.0软件进行图形绘制与分析, 利用Canoco5.0软件, 将统计的OTU数据和环境因子导入, 进行主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA).
2 结果与讨论 2.1 景观水体水质特征不同景观水体的pH和DO均处于地表水I类水体, 其他理化指标具有一定的差异.比如, 透明度是城市黑臭水体的特征指标之一, SS的透明度要比其他3个公园的大, 但是还远低于黑臭水体的界定标准; 另外SJ中金属铁和锰的含量较其他要高, 结果如表 1所示.以下从营养盐成分、有机物和反硝化细菌群落结构进行具体分析.
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表 1 不同景观水体物理化学指标 Table 1 Physicochemical parameters of park water bodies of different types |
2.1.1 氮素组成分析
4个景观水体总氮含量范围是4.43~13.83 mg·L-1, 远超地表水V类水体阈值.如图 2所示, 其顺序为YX>CA>SJ>SS.其中YX主要氮素组成为硝氮和有机氮; SS和CA的氮素组成相似, 均以硝氮为主, 氨氮和有机氮含量相对较少; SJ中氨氮和硝氮含量相当, 有机氮占小部分.Bronk等[18]的研究表明, 有机氮是水体营养物质循环和生命过程中的一个重要环节, 对细菌的生物活动产生重要影响; 水体中有12%~72%的溶解有机氮能迅速被生物所利用, 而浮游植物吸收的无机氮中有25%~41%是以溶解有机氮的形式释放.从氮素占比结构上看, YX、SS和CA的水质中硝氮含量较高, 其中YX中硝氮含量最高, 达7.12 mg·L-1, SJ水质中氨氮和硝氮占比较平衡.与国内其他一些城市的景观水体相比, YX与合肥市的黑池坝水体水质相当, SS、CA和SJ比银河和雨花塘污染稍严重[19], YX与东莞燕岭湿地春季景观水中的TN含量相当[4], 氮源含量完全可以满足藻类生长的需要, 一旦物理条件合适, 富营养化现象发生的概率大大升高.
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图 2 不同景观水体中氮素组成 Fig. 2 Nutrient salt content of the different park water bodies |
(1) 三维荧光光谱特征分析
McKnight等[20]指出FI＞1.9表示CDOM(有色溶解性有机物)源于细菌和藻类的胞外释放以及渗出液, 具有显著的内源产生特征[21], 4个景观水体的FI范围为2.41~3.06之间(表 2), 平均值为2.64, 说明各水体的CDOM为生物活动产生、具有很强的自生源特征.肖隆庚等[22]指出, BIX大于1.0为生物细菌活动产生, 且有机质为新近产生.4个景观水体的BIX均大于1.0(表 2), 平均值为1.13, 其自生源组分特征明显, 生物细菌活动活跃, 且水体中表现出一定的新生自生源CDOM, 与江俊武等[23]研究夏季的太湖结果相似(BIX为1.16).Zhang等[24]指出当1.5＜HIX＜3时, CDOM呈微弱腐殖质特征及有重要的近期自生源.4个景观水体的HIX范围在1.53~2.74之间(表 2), 平均值为2.06, YX的CDOM腐殖化程度明显高于其他3个公园水体.总体来看, 4个公园1.5＜HIX＜3, CDOM由生物活动产生, 呈弱腐殖质和自生源特征, 说明水体中生物细菌活动较强.本研究中新鲜度指数范围在1.00~1.12之间, 均值为1.04, 与周石磊等[25]的研究结果相一致.综上得出, 在不同的景观水体中, CDOM呈现出低腐殖化, 强自生源特征.
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表 2 景观水体CDOM荧光参数特征 Table 2 Chromophoric dissolved organic matter and fluorescence parameter characteristics of park water bodies |
(2) 有机物含量分析
高锰酸盐指数通常被作为直接表示水体中有机物相对含量的指标.4个景观水体中高锰酸盐指数分别为4.66、9.90、9.18和9.42 mg·L-1, 其中YX为Ⅲ类水, SS、CA和SJ为Ⅳ类水水质, 且YX较其他公园高锰酸盐指数含量低.高锰酸盐指数较高, 水中溶解氧消耗速率较快, 将会更易于造成水质恶化的现象.但与东莞燕岭湿地景观水体[4]、合肥景观水体[19]和济南市区的10个主要景观水体[26]相比, 本研究水体中高锰酸盐指数的含量较低.有研究表明[27], 在水体富营养化程度较低时, COD对其贡献较大, 而当富营养化程度加重时, 来自营养盐的贡献更为突出.
通过对水体中有机物的分析得出, 溶解性有机物主要来自水体微生物的贡献, 4个景观水体的溶解性有机物在性质上确定为强自生源、弱腐殖质特征, 高锰酸盐指数主要反映有机物的含量, 4个景观水体的有机物特征和含量存在差别, 因此有必要进一步解析环境对微生物群落的影响.
2.2 反硝化细菌群落分析 2.2.1 反硝化细菌群落多样性分析采用对测序序列随机抽样的方法, 4个样品的稀释曲线在97%相似性水平下, 以抽到的序列数与它们所能代表的数目构建稀释曲线, 随着测序序列数量的进一步增大, 各景观水体中OTU数目的增加趋于平缓(图 3), 并且覆盖度达到99%, 测序量能够覆盖样本中的绝大部分物种, 两者共同说明了对环境样本微生物群落的检测比率接近饱和, 获取了绝大多数样本信息, 基本能够反映景观水体的微生物群落组成.
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图 3 不同景观水体OTU稀释曲线 Fig. 3 OTU rarefaction curves for the different landscape water bodies |
通过ACE、Chao1、Shannon指数、Simpson指数和覆盖度等α多样性指数分析微生物群落的丰富度和多样性.4个景观水体中涵盖36个种和1 376个OTUs, 由表 3得出, ACE和Chao1指数用来计算群落中OTU的数目, 两种计算方法反映出的变化趋势基本一致.Shannon指数反映的4个公园水体变化顺序为：SJ>YX>CA>SS, 同Simpson指数结果相一致.
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表 3 不同景观水体反硝化菌群多样性指数分析 Table 3 Denitrifier community diversity index for the different landscape water bodies |
2.2.2 反硝化细菌群落组成及差异分析
本研究共获得景观水体细菌群落4门、7纲、13目、16科和23属.反硝化细菌门水平组成主要来自变形菌门, 还有部分未知细菌[图 4(a)], 变形菌门在诸多反硝化细菌多样性中占据着优势地位[28~30].张雅洁等[31]研究的北海湖微生物群落结构中, 变形菌门是冬季的第一优势菌门, 随温度升高, 到春季变形菌门的优势作用降低, 放线菌门和拟杆菌门的相对丰度明显升高, 表明温度在一定程度上影响着细菌多样性.在纲水平上不同公园细菌组成不同[图 4(b)], YX中未知细菌相对丰度较大; SS中γ-变形菌纲相对丰度较大; CA中α-变形菌纲相对丰度较大; SJ中未知细菌、unclassified_Proteobacteria、β-变形菌纲和α-变形菌纲相对丰度较大.这与郑林雪等[29]的研究结果一致, 即绝大多数被确认的反硝化菌集中分布于α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲.通过对不同景观水体反硝化细菌群落属水平组成分析[图 4(c)], 4个景观水体的细菌群落结构差异显著, 在属分类水平上主要有15个属, 包括β-变形菌纲脱氯菌属(Dechloromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产黄杆菌属(Rhodanobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、陶厄氏属(Thauera), 此外, unclassified_Bacteria、unclassified_Proteobacteria、environmental_samples均有较高丰度.康鹏亮等[32]研究西安市景观水体发现, 副球菌属、假单胞菌属和红长命菌属为优势菌属.鲍林林等[33]对北运河沉积物的研究发现假单胞菌、陶厄氏属和盐单胞菌属是主要的反硝化菌, 上述反硝化菌对氮素去除均有较大贡献[34].SS的优势菌属为假单胞菌(Pseudomonas)60.48%.CA的优势菌属为红杆菌属(Rhodobacter)46.94%, 杨浩等[35]分析窖水中的微生物群落多样性时发现, Rhodobacter是具有好氧反硝化功能的优势菌, 李小义等[36]从污泥中分离出的菌株中也对Rhodobacter进行了相关报道.YX的优势菌属为unclassified_Bacteria 53.52%, SJ的优势菌属为unclassified_Bacteria 36.19%、unclassified_Proteobacteria 23.44%.此外, 所研究景观水体中的变形菌门(unclassified_Proteobacteria)细菌和unclassified_Bacteria占有较大的比例, 变形菌门多具有好氧反硝化生态功能的细菌以及在未分类的细菌领域还有待探索[13, 37].
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(a)不同景观水体反硝化细菌群落门水平组成, (b)不同景观水体反硝化细菌群落纲水平组成(c)不同景观水体反硝化细菌群落属水平组成, (d)不同景观水体OTU分布韦恩图 图 4 景观水体物种组成及比较分析 Fig. 4 Species composition and comparative analysis of the park water bodies |
通过韦恩图较直观地反映物种的差异及重叠情况[图 4(d)].其中, YX独有265个OTUs; SS独有71个OTUs; CA独有127个OTUs; SJ独有213个OTUs.4个公园都存在的OTUs为126个.4个公园所含OTUs数目关系为：SJ>YX>CA>SS, 这同ACE和Chao1指数分析的结果相一致.寇文伯[38]对于鄱阳湖细菌群落的研究得出, OTUs的个数和细菌相对丰度之间具有显著相关性, 相对丰度高的细菌比相对丰度低的有更多的OTU, 即优势菌群的基因型多样性更高.很明显本研究中4个景观水体的OTU数目和多样性指数的关系符合该结论.同时这也验证了Cohan等[39]提出的细菌多样性是细菌在生境中生态成功的关键的假说.
通过PCA主成分分析发现[图 5(a)], 4个景观水体中反硝化细菌组成具有明显差异, PC1轴和PC2轴可以解释总变异的81.24%, 能够很好地反映总体的变化.nirS型反硝化细菌变异主要发生在PC1轴上, YX、SS位于第Ⅲ象限, SJ位于第Ⅳ象限, CA位于第Ⅱ象限, 通过PCA发现, YX和SS差异较小, 而CA与其他公园水体具有明显差异.再通过降趋对应分析(DCA), 计算得水体微生物群落中最大梯度长度值为0.208, 因此选择冗余性分析(RDA)进一步开展环境因子与微生物群落的多元统计分析.
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图 5 景观水体中反硝化细菌菌群的PCA和RDA分析 Fig. 5 PCA and RDA analysis of the denitrifying bacteria communities in the landscape water bodies |
微生物的群落结构和环境因子对其的影响密不可分, 根据微生物群落结构和环境因子的RDA分析结果指出[图 5(b)], 氨氮(r=0.969 9)、亚硝氮(r=0.880 1)和总磷(r=0.857 3)与轴1呈正相关, 硝氮(r=-0.861 4)和溶解氧(r=-0.833 0)与轴1呈负相关.因此对体系中微生物群落结构影响最大的是氨氮, 其次是亚硝氮和硝氮, 总磷和溶解氧次之.β-变形菌纲脱氯菌属(Dechloromonas)、陶厄氏属(Thauera)、食酸菌属(Acidovorax)、unclassified_Rhodobacteraceae和unclassified_Bacteria与高锰酸盐指数、氨氮、亚硝氮和总磷呈显著正相关, 与pH、硝氮、总氮和溶解氧呈显著负相关.康鹏亮等[32]研究的西安景观水体中的优势菌属Dechloromonas和Thauera与总氮、硝氮和溶解氧等呈负相关, 这与本研究相一致.unclassified_Burkholderiales、unclassified_Betaproteobacteria、unclassified_Rhodocyclales受环境因子的影响较小.磁螺菌属(Magnetospirillum)、产黄杆菌属(Rhodanobacter)和environmental_samples与硝氮、总氮和溶解氧呈显著正相关, 假单胞菌属(Pseudomonas)、unclassified_Proteobacteria与总磷正相关, 与pH、高锰酸盐指数呈负相关.
总体来看, 氨氮、亚硝氮、总磷、硝氮和溶解氧对4个景观水体微生物多样性影响较大, 氮素的不同形态影响着脱氮微生物群落结构和功能[40].邵基轮等[41]研究的好氧反硝化菌Burkholderia sp. YX02在反应器中的微生物群落结构也受不同形态的氮素的影响较大, 氨氮、亚硝氮促进β-变形菌纲脱氯菌属(Dechloromonas)和陶厄氏属(Thauera)等细菌的相对丰度.Zhao等[42]的研究发现, 太湖流域沉积物反硝化速率随氨氮含量的增加而升高, 硝氮抑制磁螺菌属(Magnetospirillum)和产黄杆菌属(Rhodanobacter)等细菌的相对丰度, 总磷的含量促进优势菌属假单胞菌的丰度, 而其他优势菌属受环境因子的影响较小.微生物群落结构与非生物因素的关系密不可分, 且响应更为复杂, 所以阐明其作用机制, 从而更好地为城市水系的治理和修复筛选好氧反硝化菌, 还需全面而深入地研究.
3 结论(1) 水质特征表明4个景观水体氮素含量较高, YX主要由硝氮和有机氮组成; SS和CA主要由硝氮组成; SJ主要由氨氮和硝氮组成.水体中CDOM均呈现强自生源、弱腐殖质特征.
(2) 高通量测序结果显示裕西公园水体的优势菌种为(unclassified_Bacteria)53.52%;水上公园水体的优势菌种为假单胞菌(Pseudomonas)60.48%;长安公园水体的优势菌种为红杆菌属(Rhodobacter)46.94%;世纪公园水体的优势菌种为(unclassified_Bacteria)36.19%、(unclassified_Proteobacteria)23.44%.PCA分析表明4个典型景观水体中反硝化细菌种群结构存在显著差异.
(3) RDA分析得出, 裕西公园中的细菌与硝氮、总氮和溶解氧正相关; 水上公园中的细菌与透明度和总磷正相关; 长安公园中的细菌与高锰酸盐指数、氨氮和亚硝氮正相关; 世纪公园中的细菌与pH、硝氮、总氮和溶解氧呈显著负相关.
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