2019, Vol. 40
2. 苏州科技大学环境生物技术研究所, 苏州 215009;
3. 江苏省环境科学与工程重点实验室, 苏州 215009
2. Institute of Environmental Biotechnology, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China;
3. Jiangsu Key Laboratory of Environment Science and Engineering, Suzhou 215009, China
人口的增长和可持续社会的发展, 迫使城市污水处理厂向能源循环型转变[1], 这意味着未来污水处理厂将对有机物及其他资源进行回收[2], 即需要在主流工艺中, 直接对含磷和含碳量低的生活污水进行磷回收.而现有的磷回收技术主要是基于以除磷为主要目的的EBPR(enhanced biological phosphorus remove), 从主流工艺的厌氧段末端上清液、侧流工艺中的厌氧消化池上清液中, 对含高浓度磷酸盐的废水进行磷回收.但只有进水中含有足够的有机物, 尤其是短链可挥发性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)时, 才能获得良好的除磷能力[3, 4], 故有机物的含量将成为其重要限制条件.而生物膜法一定程度上减少了碳源的投加, 还避免了大量剩余污泥的产生[5], 可结合SBR工艺进一步稳定并强化微生物的富集和活化[6, 7]. Kodera等[8]即在200 mg·L-1 COD下90 d获得125 mg·L-1富磷溶液, 但好氧出水上升至2.5 mg·L-1; 而Tian等[9]则消耗800~1 600 mg·L-1的COD获得82 mg·L-1的富磷溶液.
此外, 基于传统除磷理论, 聚磷菌在厌氧状态下吸收有机物, 转化为内碳源PHB, 继而在好氧状态下分解PHB, 以提供能量吸收磷酸盐和自身的生理活动, 其中并未界定好氧段碳源对其的影响.又有研究认为, PAOs在好氧段存在乙酸钠时仍然可以进行释磷, 部分乙酸钠被利用并合成PHB[10], 唐旭光等[11]发现在VFAs足够时, PAOs在好氧段合成PHB的速率明显高于厌氧段.而实际污水处理中, 尤其是在未来资源回收的前提下, 要保证在好氧出水达标, 其进入好氧段的有机物对PAOs的影响并不明确, 所以好氧段碳源浓度对循环交替运行下的聚磷生物膜的影响有待研究.本试验中, 通过改变好氧段碳源浓度, 对循环交替O/A运行模式下的磷溶液去除和富集情况进行研究, 探究了其在同步去除与富集磷的生物膜反应器中进行吸磷和释磷规律, 以及对微生物种群结构的影响, 以期在未来污水处理厂中, 降低磷回收阶段对碳源的需求.
1 材料与方法 1.1 试验装置接种污泥取自苏州市高新区第一污水处理厂, 将悬浮填料浸没在污泥中闷曝24 h使附着.容积为2 L的玻璃反应器置于DF-101s恒温水浴加热磁力搅拌锅中, 保持恒温和底部的匀速搅拌.使用4台DZ-2X水泵和1台BT100-02蠕动泵分别完成好氧、厌氧进出水和厌氧基质的进水, 用一台250 W小型空压机和微孔曝气石提供好氧阶段的曝气, 通过气体转子流量计控制曝气量.运行中各阶段工序皆由电子计时器实现自动切换.试验采用好氧/厌氧(O/A)SBR型运行, 运行周期为4 h好氧+4 h厌氧, 其中包含瞬间进出水.
装置流程如图 1, 好氧阶段由泵1将好氧进水打入反应器, 并由空压机提供曝气条件, 反应结束后, 经泵2将反应器中溶液排出; 厌氧阶段, 泵3将厌氧进水(循环液)打入反应器, 同时由泵5将厌氧基质打入反应器, 反应结束后由泵4将溶液再次打入回收罐.
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a.好氧进水罐; b.厌氧进水/循环罐; c.厌氧基质罐; d.磁力搅拌器; e.空压机; f.泵：好氧进水; g.泵：好氧出水; h.泵：厌氧进水; i.泵：厌氧出水; j.泵：基质进水; g.泵：好氧出水; k.悬浮填料 图 1 试验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of the experimental device |
使用合成废水作为进水, 其中厌氧基质与水以1:9的比例混合.好氧基质：(200、100和0 mg·L-1)COD(CH3COONa, 乙酸钠作为碳源), 30 mg·L-1KH2PO4(5 mg·L-1P)和400 mg·L-1 NaHCO3来获得pH=7.5, 以及矿物质元素[153 mg·L-1 NH4Cl (40 mg·L-1 N), 14 mg·L-1 CaCl2·2H2O、90 mg·L-1 MgSO4·7H2O和3 mg·L-1 EDTA·2Na]和微量元素(0.45 mg·L-1 FeCl3·6H2O、0.045 mg·L-1H3BO3、0.009 mg·L-1CuSO4·5H2O、0.054 mg·L-1KI、0.036 mg·L-1 MnCl2·4H2O、0.018 mg·L-1Na2MoO4·2H2O、0.036 mg·L-1ZnSO4·7H2O和0.045 mg·L-1 CoCl2·6H2O); 厌氧基质：2 000 mg·L-1COD, 与富集液进行1:9的体积混合, 最终厌氧段初始COD为200 mg·L-1, 同样的矿物质元素[8].其中, 好氧阶段DO维持在2~3 mg·L-1, 厌氧阶段通过ORP指示, 维持在-180~-200 mV, 温度维持在15~25℃之间.
1.2.2 测定方法COD和PO43--P采用文献[12]的方法测定; 污泥中P含量采用SMT法测定[13]; DO采用inlab OXI7300溶氧仪测定(德国WTW); ORP和pH采用pHG-826A PH/ORP仪监测(无锡东原).
1.2.3 MiSeq高通量测序分析方法污泥取样来自取泥初期和运行末的生物膜污泥.泥样取出后, 在14 000 g下离心2 min, 去除上清液, 置于-80℃保存.采用试剂盒(Fast DNA Spin kit forsoil, MP, USA)对DNA进行提取.提取后的DNA通过Nanodrop Spectrophotometer ND- 1000 (Thermo Fisher Scientic, USA)测量核酸浓度及纯度, 结果通过1%的琼脂糖电泳检测.
采用细菌16S V4-V5区通用引物, 前端引物519F(5′-CAGCMGCCGCGGTAATW-3′), 后端引物907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′), PCR采用20 μL的反应体系, 2 μL 10×Buffer、2 μL dNTP(浓度为100 mmol·L-1)、1 μL DNA模板(10 ng· μL-1)、每种引物各1 μL(10 μmmol·L-1)、0.2 μL Taq酶和12.2 μL无菌水.扩增程序是PCR扩增采用94℃预变性3 min; 94℃变性40 s, 56℃ 60 s, 72℃ 60 s, 共29个循环, 72℃延伸10 min.扩增产物通过2%琼脂糖电泳检测.
采用Illumina MiSeq测序仪进行PE 300测序.下机数据按照各样本的Barcode序列对原始数据进行拆分; 对单个样本的双端测序结果采用FLASH进行拼接; 对拼接结果进行质控, 采用Uparse去除平均质量分数小于30%的序列并去除嵌合体序列; 采用Uparse对序列按照0.97的相似度聚类获得OTUs(operational taxonomic units), 采用Uclust方法将代表序列比对到Silva数据库进行物种注释.为避免采样效率对微生物群落分析的影响, 对各样本的序列数目按照各样本中最少的序列数进行随机抽样, 随机抽样结果用于下游的物种丰度比较、α多样性与β多样性计算以及其它生态统计分析.
2 结果与讨论 2.1 好氧段碳源对磷吸收的影响成功驯化后的聚磷生物膜在好氧状态下的PO43-变化趋势如图 2所示.从图 2(a)可以看出：在以循环交替式O/A运行下, 由于厌氧循环液中磷酸盐得到不断富集, 其高浓度残留相所导致的实际好氧进水浓度不能维持在配水的5~6 mg·L-1, 继而引起好氧出水也逐渐升高.结合图 2(b)中吸磷浓度的逐渐上升可知, 聚磷生物膜的吸磷能力在不断增强, 但不能抵消循环液高浓度所带来的磷负荷, 而降低好氧段碳源后, 高磷负荷对其影响逐渐削弱, 直至不加好氧碳源, 最后好氧出水可以稳定在0.5 mg·L-1以下, 符合国家《污水综合排放标准》一级.此外, 该体系在每个COD阶段后期都存在一个稳态, 即周期内吸磷浓度及吸磷量几乎维持不变, 后通过改变好氧碳源质量浓度, 第一个周期内, 其性能都有一定的下降, 其可能原因是, 底物浓度的变化引起了诱导酶的变化[14], 从而改变了微生物的特性.在好氧段COD为200、100和0 mg·L-1时, 最大周期内吸磷量分别为14.87、19.04和20.84 mg, 在提高1.28倍后继续提高了1.09倍, 其吸磷速率也得到相应提高[图 2(c)所示], 最大吸磷速率为18.15 mg·(L·h)-1, 是200 mg·L-1COD下14.07 mg·(L·h)-1的1.29倍, 低碳源条件下吸磷时长也相对减少, 在前3 h内已基本完成吸收, 也利于好氧状态下的PAOs在短时间内维持较高的吸磷效果[15].且在生物膜污泥相中, 周期内最大蓄磷含量从23.51 mg·g-1提升到47.62 mg·g-1, 最大污泥吸磷含量也从6.79 mg·g-1增加到21.69 mg·g-1, 性能提升了3.19倍.
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(a) PO43-浓度趋势, (b)吸磷趋势, (c)周期内吸磷速率趋势, (d)周期内污泥中磷酸盐浓度趋势 图 2 好氧段PO43-变化趋势 Fig. 2 PO43- trend diagram under aerobic conditions |
以上性能的提升也在一定程度上反映出PAOs的活性在逐步提升, 且逐渐在该反应器体系中占主导地位.这是因为, 对于一般异养微生物, 其增长模式一般以“直接利用”为主, 即当其处于好氧状态下, 并且具有足够的有机基质下才能成长为优势菌群, 而在此厌氧-好氧交替运行模式下, 普通异养菌便不具备优势, 而随着好氧碳源的减少, 其生长速率更加变慢; 相反, 对于PAOs, 其生长遵循的是“吸收-储存-利用”, 即在厌氧条件下, 利用充足的有机基质进行吸收, 并以胞内聚合物的形式存储于体内, 当其处于好氧条件下, 便直接利用存储的能量供给自身的合成与增殖[16].两相对比, 降低好氧碳源不仅表面上得到富磷浓度的提升, 且可能在根本上导致普通异养菌逐渐被淘汰, PAOs逐渐充分发挥其吸磷功能.
2.2 好氧段碳源对厌氧释磷的影响好氧段碳源的降低促进了厌氧段的释磷. 图 3(a)可以看出：厌氧循环液中磷酸盐浓度得到呈阶梯式不断升高, 且变化明显, 降低好氧碳源大大提升了富集性能, 富集液从25.82 mg·L-1依次上升到38.90 mg·L-1、56.91 mg·L-1, 该质量浓度已可以满足鸟粪石结晶的要求[17].即降低好氧碳源可以释放更多的磷如图 3(b)所示, 从每周期14.75 mg提高到18.41 mg和19.91 mg, 依次提高了1.24倍和1.08倍, 表明好氧段200 mg·L-1 COD很大程度上不利于聚磷菌的释磷, 当降低到100 mg·L-1时厌氧段释磷获得大幅提升, 与不加好氧段碳源差异不大.结合图 2吸磷性能的增幅, 其释磷率较低还受外界高浓度磷酸盐浓度差限制, 所以其液相中周期内释磷浓度又回到初始状态下的5~6 mg·L-1.其相应的释磷速率也得到提高如图 3(c)所示, 最大释磷速率依次为3.78、11.65、13.48 mg·(L·h)-1, 提高了3.56倍, 且低碳源条件下释磷时长也相对减少, 最快在2.5 h时内已基本完成. 图 3(d)生物膜污泥相中, 周期内最大蓄磷含量从20.07 mg·g-1提升到46.62 mg·g-1, 最大污泥释磷含量也从5.13 mg·g-1增加到15.57 mg·g-1, 但对比COD为100 mg·g-1和0 mg·g-1, 发现越到后期磷越难释放到液相, 大部分磷储存在污泥相中.
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(a) PO43-浓度趋势, (b)释磷趋势, (c)周期内释磷速率趋势, (d)周期内污泥中磷酸盐浓度趋势 图 3 厌氧段PO43-变化趋势 Fig. 3 PO43- trend diagram under anaerobic conditions |
此外, 对比分析图 2和图 3吸释磷性能发现, 液相中吸磷量始终大于释磷量, 直到磷酸盐富集液浓度达到稳定状态时, 其吸磷量逐渐与释磷量达到平衡, 依次分别为14.87和14.75、19.04 mg和18.41、20.84和19.91 mg, 但总体上吸磷量大于释磷量; 而在固相中, 污泥中磷含量也由16~17 mg·g-1增加至46~47 mg·g-1, 污泥蓄磷逐渐增强, 这与Kodera等[8]发现生物膜里仍存在大量磷一致, 这可能是由于外界液相中高浓度磷酸盐与胞内形成较大的渗透压, 而聚磷菌在此环境下没有足够的推动力使得磷酸盐释放到外界液相中[18].
综上可知, 随好氧COD的减少, 无论是吸磷速率和释磷速率都得到了相应地提高, 且较郑莹等[19]利用培养的聚磷生物膜中的最大吸磷速率9.25 mg·(L·h)-1和最大释磷速率6.75 mg·(L·h)-1都有了较大的提升, 分别提升了1.96倍和1.99倍, 这同时也反映出在作磷酸盐循环富集时, 更有利于聚磷菌能力的提高[20]; 且高磷条件下尽可能避免了PAOs向GAOs代谢途径的转变[21].这也更符合未来污水处理厂的资源回收特性, 有助于强化对有机物的回收.
2.3 好氧段碳源对聚磷生物膜的微生物分布变化影响降低好氧段碳源浓度有利于聚磷菌的富集, 大大抑制了普通异养菌和硝化菌的生长, 强化了聚磷生物膜的筛选机制.在“门(Phylum) ”与“科(Family) ”水平上, 对不同污泥样品的主导菌群进行分析(如图 4、5所示), 在测到的29个门(Phylum)中, 主要为变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、Ignavibacteriae门、硝化螺旋菌门(Nitrospirae).其中, 作为最丰富的门且是一种潜在的聚磷菌[22, 23], Proteobacteria占比由起始的59.22%增长至83.29%, 增量为24.07%, 远高于普通城市污水处理厂的48.00%[24], 而孟璇等[25]在好氧COD为200 mg·L-1下测序较初始污泥增量为10%, 表明降低好氧碳源可以较大提高变形菌门的富集, 约2.4倍.而对于其他菌门, 拟杆菌门(Bacteroidetes)由4.32%下降至2.79%、放线菌门(Actinobacteria)由2.83%下降至1.16%、Ignavibacteriae门由2.62%下降至0.25%;此外, 作为硝化细菌的硝化螺旋菌门(Nitrospirae)占比较重且变化明显, 由17.59%下降至2.57%.表明在该系统中, 聚磷微生物较硝化生物具有较强的优势, 且以变形菌门为主, 而降低好氧段碳源至0 mg·L-1后, 可以提高变形菌门约2.4倍的富集.
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图 4 门级别的微生物分布 Fig. 4 Biofilm microbial community composition at the phylum level |
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图 5 科级别的微生物分布 Fig. 5 Biofilm microbial community composition at the family level |
而在科的水平上进行微生物分析, 如图 5所示.初始污泥中微生物占比由大到小排序为间孢囊菌科(Ignavibacteriaceae)、未定义的β-变形菌亚门(unclassified β-Proteobacteria)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae).在富集结束后, 具有除磷功能的红环菌科(Rhodocyclaceae)占比最大, 得到了3倍多的富集, 由10.10%增长至33.95%, 增量为23.85%, 为孟璇等[25]增量10.44%的2.28倍. Zilles等[26]的研究也表明, 在高效除磷系统中红环菌科含量较高, 是EBPR系统中的优势聚磷菌.厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)由8.15%增长至23.71%, 属于绿弯菌门, 增量为15.55%, 是孟璇等[27]的试验增量3.10%的5倍.而未定义的β-变形菌亚门(unclassified β-Proteobacteria)由17.19%下降至9.25%、间孢囊菌科(Ignavibacteriaceae)由30.18%下降至10.97%、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae)由10.12%下降至1.04%, 进一步表明在该运行模式下, 不具备除磷功能的细菌大幅地减少.而变形菌门中的红环菌科, 绿弯菌门中的厌氧绳菌科, 其在好氧碳源为0 mg·L-1相对200 mg·L-1分别具有2.28和5倍的富集效果, 聚磷微生物进行了较高效地富集和筛选.
3 结论(1) 好氧段碳源浓度的降低, 有利于吸磷和释磷性能的提升：好氧段COD由200 mg·L-1下降到0 mg·L-1后, 吸释磷速率分别提升1.29倍和3.56倍, 蓄磷量提高2.02倍和2.32倍, 周期释磷量提高3.23和3.03倍; 污泥蓄磷能力提高2.61倍.
(2) PAOs的富集得到了强化：微生物群落演化中的门水平上, 被定义为聚磷菌的变形菌门Proteobacteria占比由起始的59.22%增长至83.29%, 降低好氧碳源可以获得变形菌门约2倍的增幅; 而在科水平, 无论是变形菌门中的红环菌科(10.10%增长至33.95%), 还是绿弯菌门中的厌氧绳菌科(8.15%增长至23.7%), 富集效果分别提高了2.28和5倍, 降低好氧段碳源大大促进了聚磷菌的富集和筛选.
(3) 碳源需求量的减少, 提高了PAOs的性能, 也使得该磷回收工艺在未来污水厂的主流工艺中更具经济可行性.
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