短程硝化反硝化是指将NH₄⁺氧化过程控制在NO₂^-阶段, 然后以NO₂^-为电子受体将其反硝化至N₂的过程^[1].相对于传统硝化反硝化工艺, 短程硝化反硝化工艺(SHARAN工艺)具有节省曝气能耗, 降低碳源投加费用, 缩短反应历程等优点^{[2, 3]}.目前以过程控制为手段的SHARAN工艺SBR中试已经实现了长久稳定的维持^[4], 而其中以NO₂^-为电子受体的短程反硝化过程是该工艺的关键步骤之一^[5].该工艺在对工业含氮废水(如焦化厂废水^[6]和催化剂生产废水等^[7])的处理中也得到广泛应用.

重金属作为主要有毒成分之一广泛存在于化工、冶金等工业废水中^[8].微量的重金属是微生物生命活动需要的营养物质, 但过量的重金属对生物具有毒害作用, 不可避免地会导致生物废水处理系统的恶化^{[9, 10]}.而Cu²⁺是工业废水中最常见的重金属离子之一, 关于Cu²⁺对活性污泥系统如缺好氧生物膜系统^[11]、硝化系统^[12]、生物强化除磷系统^{[13, 14]}及反硝化除磷系统^[15]等的影响已有广泛研究, 而有关其对反硝化污泥系统影响的研究还较少.因此, 研究Cu²⁺对以NO₂^-为电子受体反硝化过程的影响对SHARAN工艺处理污水的实际应用具有重要意义.

本研究表明活性污泥细胞外聚合物(EPS)中包含的具有高吸收官能团的高分子量化合物(主要是多糖、蛋白质、腐殖质和DNA)对重金属具有吸附和黏附性质, 其存在的带电荷的部分可作为配体源为金属带电粒子提供结合位点, 因此EPS在一定浓度重金属范围内对于降低其潜在毒性有重要作用^[16].

基于以上背景, 本试验采用SBR考察了Cu²⁺对还原NO₂^-过程的短期毒性作用, 并对Cu²⁺负荷下微生物还原NO₂^-能力进行长期培养驯化, 通过逐步提高污泥对Cu²⁺的耐受浓度考察了长期影响过程中以NO₂^-为电子受体的反硝化污泥对Cu²⁺的耐受度变化, 同时探究了长期影响试验中EPS及污泥性质的变化情况, 以期为短程脱氮工艺的实际应用起到一定指导作用.

本研究分别采用有效体积分别为500 mL试剂瓶和3 L的SBR反应器进行短期和长期试验, 本试验在室温下进行(24℃±3℃), 反硝化过程中通过机械搅拌保证泥水混合均匀.

接种污泥取自北京工业大学A/O短程硝化反硝化中试反应器, 污泥具有良好的短程生物脱氮性能.

短期影响：基于批次试验, 采用8个500 mL试剂瓶考察不同浓度铜离子(0、0.5、1、2、3、5、7和10mg·L^-1)对污泥反硝化过程的短期影响. SBR内污泥浓度均为3 000 mg·L^-1左右, 运行方式为瞬间进水, 一次性投加基质, 稀释后的基质浓度为150mg·L^-1 COD(乙酸钠)和50mg·L^-1 NaNO₂, 缺氧搅拌4 h.批次试验共进行3次, 结果为3次试验结果的平均值.

长期影响：考察Cu²⁺对以NO₂^-为电子受体反硝化污泥的长期驯化过程, 采用1个3 L SBR反应器进行90 d长期试验, 每天运行2个周期, 每周期4 h, 排水比为50%, 污泥浓度不控制, 不单独排泥.运行方式为瞬时进水, 每周期一次性投加基质(成分和浓度同短期影响试验), 根据Cu²⁺的投加浓度将长期试验分为5个阶段(如表 1), 分别对应投加Cu²⁺浓度为0、0.5、1和3mg·L^-1以及系统反硝化效果遭到抑制后停止投加Cu²⁺阶段.

表 1 (Table 1)

表 1 长期影响试验运行阶段 Table 1 Operation stages of the long-term experiment 试验阶段 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 时间/d 1~10 11~25 26~40 41~70 71~90 Cu2+投加浓度/mg·L-1 0 0.5 1 3 0

表 1 长期影响试验运行阶段 Table 1 Operation stages of the long-term experiment

水样经0.45 μm滤膜过滤进行参数测定.其中NO₂^--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定; pH采用德国WTW便携式多功能检测仪(Multi 340i)进行实时监测; MLSS采用滤纸称重法测定; MLVSS采用马弗炉灼烧重量法测定; 通过测定不同时刻的NO₂^--N浓度值, 绘制NO₂^--N浓度随时间的变化曲线图, 计算曲线的斜率与反应器MLVSS的比值, 可求得NO₂^--N比还原速率, 即NO₂^--N反硝化活性; 多糖选用蒽酮比色法测定; DNA以小牛胸腺DNA作为标准物质, 采用二苯胺法测定; 菌群致死率采用LIVE/DEAD BacLight细菌细胞活性测定试剂染色法测定(以细胞膜的完整性为基础), 采用绿色荧光核酸染色剂SYTO^® 9和红色荧光核酸染色Propidium(PI)分别对完好与受损的细胞膜进行标记后, 使用荧光显微镜(OLYMPUS-BX61)对每个污泥样品拍摄30组照片, 并用Image-Pro Plus软件对照片进行处理与分析, 计算出平均细菌死亡率; 胞外聚合物(EPS)采用超声波法分层提取^[17], EPS中蛋白质以牛血清蛋白作为标准物质, 用修正的Folin-酚法测定; 污泥粒径采用Microtrac S3500激光粒度仪测定; SVI采用静沉法测定.

不同浓度Cu²⁺对以NO₂^-为电子受体反硝化污泥活性的抑制作用如图 1(a)所示.从中可以看出, Cu²⁺对反硝化活性表现出明显的抑制作用, 且随着Cu²⁺浓度的升高, NO₂^--N比还原速率呈线性降低, 当Cu²⁺浓度升高至10 mg·L^-1时, NO₂^--N比还原速率降低至0 mg·(g·h)^-1. Cu²⁺对以NO₂^-为电子受体反硝化污泥活性的抑制规律很好地符合Monod方程, 相关系数R²大于0.97^[18]. Monod方程[式(1)]模拟得出Cu²⁺对NO₂^--N反硝化活性的半抑制浓度(EC₅₀)为4.79mg·L^-1.

(1)

图 1

Fig. 1

图 1 不同浓度Cu2+下NO2--N反硝化活性与pH变化 Fig. 1 Specific activity and pH profiles during denitrification of NO2--N at different concentrations of Cu2+

式中, r为抑制率, %; p为当r为50%时的抑制物浓度(即EC₅₀), mg·L^-1; r_max为最高抑制率, %; x为限制物浓度, mg·L^-1.

有研究表明, 以NO₂^-为电子受体反硝化过程是碱度增加、pH值连续升高的过程^[19]. 图 1(b)为不同浓度Cu²⁺下NO₂^-反硝化过程pH值变化曲线.随着反硝化过程的进行, pH值均在不断上升达到最高值后基本不再变化, 但随着浓度的升高, pH值变化曲线的斜率及最高值逐渐降低, 表明Cu²⁺对NO₂^-反硝化活性产生抑制作用的同时也抑制了该过程中pH值的升高, 可用于Cu²⁺对NO₂^-反硝化系统毒性冲击的预警监测.值得注意的是, 彭永臻等^[3]研究发现, 适宜pH下以NO₂^-为电子受体反硝化还原菌活性较强, 因而对ρ(FNA)抑制剂的抵抗能力也较强.本试验中Cu²⁺浓度为10mg·L^-1时, 系统pH维持在6.7左右, 反硝化污泥对ρ(FNA)抑制的抵御能力较弱, 从而发生恶性循环使系统丧失反硝化活性.

Cu²⁺对反硝化活性表现出明显毒性抑制作用的原因可能是当Cu²⁺浓度较高时, 会侵入微生物机体影响其正常的生理代谢功能, 破坏其细胞结构, 最终使生物体表现为中毒甚至死亡^[20].为了探究Cu²⁺对以NO₂^-为电子受体反硝化污泥活性影响的作用机制, 测定了不同浓度Cu²⁺对NO₂^-反硝化污泥的相对细菌致死率(相对于Cu²⁺浓度为0mg·L^-1)^[21], 污泥死亡率与Cu²⁺浓度的关系如图 2所示.从中可以看出Cu²⁺对NO₂^-反硝化污泥的致死作用与Cu²⁺浓度存在明显线性正相关关系(相关系数R²大于0.99), 即Cu²⁺对NO₂^-反硝化污泥毒性造成的细菌致死率随着Cu²⁺浓度增加而升高, 致使系统比NO₂^--N反硝化速率逐渐降低, 根据线性关系可得Cu²⁺对NO₂^-反硝化污泥的半致死率浓度LC₅₀为11.2 mg·L^-1.当Cu²⁺浓度升高至10mg·L^-1时, Cu²⁺对NO₂^-反硝化污泥的相对细菌致死率为45.0%, 即系统中仍有多数细菌存活, 说明NO₂^-反硝化活性在Cu²⁺毒性冲击后有可能得到恢复^[22].

图 2

Fig. 2

图 2 不同浓度Cu2+对NO2--N反硝化污泥的相对细菌致死率 Fig. 2 Relative rate of biocidal cells in NO2--N denitrifying sludge with different concentrations of Cu2+

Cu²⁺对以NO₂^-为电子受体反硝化过程中系统NO₂^--N去除效果与污泥反硝化活性的长期影响如图 3所示.从中可以看出, 接种污泥后成功启动了以NO₂^-为电子受体的反硝化反应器, 反应器稳定运行10 d, 反硝化活性达到13.5 mg·(g·h)^-1, NO₂^--N去除率稳定维持在99%以上后, 开始投加Cu²⁺.投加Cu²⁺浓度为0.5 mg·L^-1和1 mg·L^-1时, 系统NO₂^--N去除率在投加初始均出现明显降低, 出水NO₂^--N浓度升高, NO₂^-反硝化活性分别降低20.1%和23.3%, 但经驯化后系统NO₂^-反硝化性能均能得到恢复, NO₂^--N去除率恢复至99%以上, 且NO₂^-反硝化活性恢复至原有水平.说明当Cu²⁺浓度不大于1mg·L^-1时, NO₂^-反硝化污泥具有良好的耐受性, NO₂^--N去除率与反硝化活性能够随着运行时间的增加得到恢复.然而, 当投加Cu²⁺浓度升高至3 mg·L^-1后, NO₂^--N去除率及反硝化活性同样出现降低, 到第49 d NO₂^--N去除率降低至15.7%后系统NO₂^--N反硝化性能出现逐步恢复至80%左右, 后又开始下降.在第64 d, NO₂^--N去除率降低至10%以下, NO₂^--N反硝化活性降低至2.3 mg·(g·h)^-1, 此时, NO₂^-反硝化性能难以得到恢复, 即在Cu²⁺浓度为3mg·L^-1运行30 d后, 系统崩溃, 几乎丧失了NO₂^-反硝化能力.其原因可能是在阶段初期, 污泥吸附及胞外聚合物络合等作用可以缓解Cu²⁺对污泥活性的抑制作用, 使污泥活性在受到抑制后能够得到恢复, 但随着运行时间的增加, 在长期暴露于高浓度Cu²⁺环境中后, 污泥吸附及胞外聚合物络合等作用达到饱和, 过多的Cu²⁺侵入机体与生物分子(蛋白质、氨基酸和核酸)结合, 生成金属络合物或金属螯合物, 改变生物大分子正常的生理代谢功能, 使生物体表现为中毒现象甚至死亡, 从而使反硝化活性受到累积抑制, 基本失去反硝化能力^[23].为了恢复系统NO₂^-反硝化性能, 在第70 d停止投加Cu²⁺.停止投加Cu²⁺后, 系统NO₂^--N去除率在第14 d得到恢复, 在第84 d, NO₂^--N去除率恢复至99.0%以上并能够维持稳定, 反硝化活性恢复至15.37 mg·(g·h)^-1.

图 3

Fig. 3

图 3 Cu2+长期影响下的NO2--N去除效果及反硝化活性变化 Fig. 3 NO2--N removal performance and changes in denitrification activity under the long-term influence of Cu2+

长期驯化过程中以NO₂^-为电子受体的反硝化性能也和系统污泥生物量及细胞分泌的EPS含量变化有关. 图 4为长期驯化过程中各阶段污泥MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS值变化, 在不投加Cu²⁺的对照阶段, 经过10 d培养, 污泥MLSS、MLVSS均升高, MLVSS/MLSS值在60.0%以上.投加Cu²⁺阶段, 污泥MLSS仍然逐渐升高, 而MLVSS及MLVSS/MLSS值却在逐渐降低, 表明投加Cu²⁺后仍然存在微生物的增殖, 系统污泥MLSS升高, 然而Cu²⁺毒性作用致使较多微生物死亡, 导致MLVSS及MLVSS/MLSS值逐渐降低, 但在阶段Ⅰ和阶段Ⅱ, 系统内仍有足够生物量保证系统反硝化效果能够得到恢复.随着投加Cu²⁺浓度逐渐升高, 至第70 d, 系统MLVSS降低至仅有1 000 mg·L^-1, 但在停止投加后系统MLVSS值升高, 污泥生物量有所恢复, 这也为系统反硝化性能得到恢复提供条件.

图 4

Fig. 4

图 4 长期驯化过程中污泥生物量变化 Fig. 4 Changes in biomass at various stages of the experiment

长期运行过程中各阶段EPS含量变化如图 5所示.从中可看出, 相较于前一个阶段末, 在Cu²⁺投加浓度升高的每个阶段初, EPS含量均出现明显的增高(图 5中虚线圈内所示), 这可能是由于细胞通过分泌EPS来应对Cu²⁺浓度突然升高这一外界环境的变化以维持系统的稳定性^[24].同时, 从开始投加Cu²⁺到Cu²⁺浓度升高到3mg·L^-1的阶段Ⅳ初期, 系统EPS含量均在逐步增加.作为细胞与外界环境之间的扩散屏障, EPS的产生能够作为细菌对自身的保护性反应, 从而维持系统稳定^[25].所以, 在Cu²⁺浓度升高时, 细菌通过分泌更多EPS并且紧密聚集来保护自身, 降低Cu²⁺毒性, 这也解释了在Cu²⁺浓度为0.5和1 mg·L^-1阶段系统反硝化性能能够得到恢复, 对Cu²⁺的耐受性得到提高的原因.而在Cu²⁺浓度升高到3 mg·L^-1后, 细胞通过分泌EPS抵御Cu²⁺毒性, EPS含量出现升高, 但由于Cu²⁺的持续毒性超过系统负荷及EPS保护阈值, 致使过多细菌中毒死亡, 导致系统MLVSS降低, 生物分泌的EPS含量逐渐减少, 对毒性的抵御能力下降, 恶性循环最终导致系统崩溃, 反硝化性能丧失.而在停止投加Cu²⁺的恢复阶段, 随着系统生物量升高, EPS含量也逐渐升高, 系统反硝化性能得到恢复.

图 5

Fig. 5

图 5 各阶段污泥EPS含量变化 Fig. 5 Changes in EFS content at various stages of the experiment

另由图 5可知, 所有EPS层中均以蛋白质为主, 这可能是由于EPS是细胞体与水溶液间的离子传递通道, 而离子的转移过程需要转移蛋白参与, 因而会有大量蛋白质分泌到胞外参与转移过程^[26].而随着Cu²⁺浓度升高, EPS中DNA含量逐渐增加, 这可能是由于Cu²⁺毒性导致细胞膜、细胞壁等细胞结构遭到破坏, 从而导致包括DNA在内的细胞成分的泄漏^[27].

图 6为各阶段污泥平均粒径及SVI的变化.从中可以看出, 污泥平均粒径及污泥沉降性与EPS含量变化呈明显的相关性.阶段Ⅲ末, 随着系统EPS含量的升高, 污泥平均粒径由阶段Ⅰ的79.7 μm升高至103.4 μm, 污泥SVI由64.4 mL·g^-1逐渐降低至45.2mL·g^-1, 沉降性得到明显提高.随后在阶段Ⅳ, 随着污泥EPS的降低, 污泥平均粒径逐渐降低至86.3 μm, SVI上升.在停止投加Cu²⁺的恢复期, 因EPS的含量升高污泥粒径增长至128.2 μm, 污泥SVI降低至27.7mL·g^-1, 污泥沉降性得到明显提高.有研究表明, EPS对颗粒污泥的形成具有积极的作用^[28], 其中起主要作用的是多糖与蛋白, 它们可通过絮凝的方式将细小的颗粒凝聚成较大的污泥颗粒, 使得污泥粒径增加^[29]. EPS对污泥沉降性有明显影响, 这可能与EPS吸附Cu²⁺导致污泥密度增加有关^[30].此外, EPS中负电荷基团(如羧基、羟基和酰胺等)与带有正电荷的Cu²⁺结合可降低污泥间斥力, 也可造成污泥更容易沉降^[31].

图 6

Fig. 6

图 6 各阶段污泥平均粒径及SVI变化 Fig. 6 Variations in the average partial size and the SVI value at various stages of the experiment

(1) Cu²⁺对以NO₂^-为电子受体的反硝化过程具有明显抑制作用, NO₂^--N去除率随Cu²⁺浓度升高呈线性降低, EC₅₀为4.79 mg·L^-1, 这与Cu²⁺对反硝化污泥的细菌致死作用有关, 其LC₅₀为11.2mg·L^-1.

(2) 长期影响试验中, Cu²⁺浓度为0.5和1mg·L^-1时, 能够通过驯化恢复使污泥NO₂^-反硝化活性至原有水平; 而当Cu²⁺浓度升高至3mg·L^-1时, 反硝化污泥活性降低后难以通过驯化恢复, NO₂^--N去除率降低至10%以下, NO₂^-反硝化系统遭到严重破坏, 停止投加Cu²⁺后14 d污泥NO₂^-反硝化能力得到恢复.

(3) 长期驯化过程中, Cu²⁺浓度为0.5和1mg·L^-1时, 细胞EPS含量升高, 对降低Cu²⁺毒害起到重要作用, 能够促使系统NO₂^-反硝化性能得到恢复, 提高污泥平均粒径及污泥沉降性. Cu²⁺浓度升高至3mg·L^-1时, 长时间累积的Cu²⁺超过系统EPS保护阈值, 系统生物量降低, EPS含量减少, 反硝化性能下降.

(4) 通过驯化反硝化污泥能够提高其对Cu²⁺的耐受度.但是, 随着Cu²⁺浓度的增加, 系统处理能力下降, 建议在处理较高浓度的含铜废水时, 根据条件对其进行预处理, 将Cu²⁺浓度降低到系统能够忍受的范围内.