2019, Vol. 40
四环素(Tetracycline)作为一种广谱性抗生素被广泛用于临床医学和动物生长促进剂[1].检测结果表明动物排泄物中仍含有60%~90%的四环素[2], 致使环境中残留大量的四环素, 形成新的污染物; 特别是其还会导致耐药菌的产生, 危害人类的健康[3].污泥作为污水处理的终端副产物, 污水中蓄积的四环素亦会富集在污泥中[4], 影响其最终处理处置[4~6].
蚯蚓堆肥技术是一项绿色可持续的污泥资源化技术.有研究表明蚯蚓的活动可显著提高污泥减量化的效果、加快污泥稳定化的过程[7]; 且其堆肥产物(蚯蚓粪)富含植物可利用的氮磷钾以及多元化的农业益生菌, 被誉为是有机肥中的黄金[8].硝化作用是污泥蚯蚓堆肥氮素转化的重要途径之一, 也是评价堆肥稳定化的重要指标之一[7, 9].氨氧化古菌和细菌(AOA和AOB)是氨氧化过程的主导者, 决定了硝化作用的速率[10, 11].有研究表明, AOA和AOB的活力与其生长的环境条件(pH、温度、有机质、有毒有害物等)密切相关[10, 12].相关学者研究证实抗生素如四环素[13]、罗红霉素[14]的含量显著影响活性污泥中AOA和AOB的丰度和种群结构, 进而影响硝化速率.因此, 污泥中每日变化的四环素含量亦可能会对蚯蚓堆肥氨氧化微生物产生一定的影响, 进而影响污泥蚯蚓粪肥的利用价值.然而, 国内外学者对此研究较少.
本研究通过在城市污泥中添加不同含量的四环素, 揭示其对蚯蚓堆肥过程的硝化速率、氨氧化微生物的丰度和群落结构的影响, 旨在为明确四环素对氨氧化过程的影响机制以及提升污泥蚯蚓粪的利用价值.
1 材料与方法 1.1 实验材料选用赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)作为堆肥蚓种.实验前用新鲜污泥进行驯化, 而后随机挑选健康有活力的蚯蚓进行堆肥实验.选用底部开孔的长方形塑料箱(长46 cm×宽17 cm×高13 cm)作为蚯蚓堆肥反应器.脱水污泥取自兰州市安宁七里河污水处理厂的污泥脱水车间.随后将新鲜污泥用铁丝网制成粒径为5 mm的污泥颗粒.供试污泥理化性质如下：pH为6.8, 含水率为78.4%, 有机质为66%, 硝氮为0 mg·L-1, 总氮为60.97 g·kg-1, 四环素含量为3.68 mg·kg-1.四环素采用分析纯(99.9%, Ruibio, 德国).
1.2 实验方法有研究表明, 粪肥中四环素含量高达327 mg·kg-1[15], 同时蚯蚓也会对污泥中的四环素有一定的吸收作用, 因此本实验分别向4 kg新鲜颗粒污泥中投加0、400、2 000和4 000 mg的四环素粉末.分别均匀搅拌后, 再次造粒, 投入各反应器作为供试基质, 形成0、100、500和1 000 mg·kg-1这4个处理, 其分别用A0、A1、A5和A10表示.随后向各反应器内接种100条体重为0.3~0.4 g的赤子爱胜蚓进行蚯蚓堆肥.各处理均设置3组平行.反应器上覆盖保鲜膜, 每隔一周喷洒自来水以保持湿度.蚯蚓堆肥实验在室温下进行60 d.实验结束后, 取出堆肥样品, 剔除蚯蚓及其卵.所取样品一式两份, 一份自然风干后研磨过80目筛, 置于4℃冷藏保存; 另一份保存在-20℃的冰箱中.
1.3 分析方法 1.3.1 理化性质分析参考市政污水处理厂国标测定方法对样品进行理化性质分析(CJ/T 221-2005).将干样与去离子水(干样/水=1 g/50 mL)均匀混合后测定pH值(雷磁PHS-3C, 中国)以及电导率(雷磁DJS-1, 中国).上述混合液稀释20倍后, 过0.45 μm滤膜, 用离子色谱仪(岛津, 日本)测定硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐以及磷酸盐.总碳和总氮采用元素分析仪测定(Yanaco CHN CORDER MT-6, 日本).四环素利用高效液相色谱仪(岛津, 日本)测定[16].
1.3.2 DNA提取和荧光定量PCR将平行样品混合, 用DNeasy® Power Soil® Kit(QIAGEN, 德国)试剂盒提取总DNA.采用高通量荧光定量PCR仪(ABI, VIIA@7, 美国)对AOA和AOB的amoA基因拷贝数进行测定. AOB的正向引物(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′), 反向引物(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′); AOA的正向引物(5′-ATGGTCTGGCTWAGACG -3′), 反向引物(5′-GCCATCCATCTGTATGTCCA-3′). 10 μL的荧光定量PCR体系为：5 μL的荧光染料Roche FastStart Universal SYBR Green Master (ROX), 10 μmol上下游引物各0.75 μL, DNA模板0.5 μL, DNA-free超纯水3 μL.反应条件为：95℃预变性10 min; 95℃变性15 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 均进行40个循环.采用合成的质粒作为标准曲线, 克隆载体：PUC57.用DNA-free超纯水作为阴性对照, 每个样品做3次重复.
1.3.3 PCR和高通量测序采用融合了Illumina测序平台的氨氧化细菌的引物amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′), 以及氨氧化古菌的引物Arch-amoAF (5′-STAATGGT CTGGCTTAGACG-3′)和Arch-amoA (5′-RGCGGCC ATCCATCTGTATGT-3′), 进行PCR扩增.高保真酶采用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer(New England Biolabs, 美国). 50 μL PCR反应体系为：25 μL的Mix Buffer, 3 μL DMSO, 1 μmol上下游引物共3 μL, 5 ng·μL-1的DNA模板10 μL, DNA-free超纯水9 μL. PCR反应条件：98℃预变性30 s; 98℃变性15 s, 58℃退火15 s, 72℃延伸15 s, 均进行30个循环; 72℃终延伸1 min. PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳后, 利用AXYGEN Gel Extraction Kit (250)(Axygen, 美国)胶回收试剂盒对其回收.用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermofisher, 美国)对回收的文库进行定量并检测后, 用高通量测序仪(X-10, Illumina)测序.测序结果用Cutadapt软件对低质量部分剪切后, 序列通过UCHIME Algorithm和数据库Gold database进行比对, 检测嵌合体序列, 最终得到有效的测序数据.
1.3.4 数据处理硝化速率用每日硝氮生成率表示.采用STATISTICA 10.0进行不同处理间显著性差异分析以及主成分分析, 显著性水平为0.05.使用MEGA 7.0软件对氨氧化微生物DNA测序数据进行聚类, 并用HemI 1.0软件进行物种丰度分析. AOA和AOB的测序结果分别上传至DDBJ数据库, 并分配序列号LC379797~LC379872和LC379974~LC379989.香农-威纳(Shannon-Wiener)多样性指数以及辛普森(Simpson)多样性指数计算方式见文献[17].
2 结果与讨论 2.1 四环素对污泥蚯蚓堆肥硝化速率的影响如图 1所示, 随着四环素含量的增加, 污泥蚯蚓堆肥系统的硝化速率呈现先增后减的变化趋势.与A0相比, A1、A5的硝化速率均略有提升, 但不显著(P>0.05);而A10的硝化速率显著降低了20.23%(P < 0.05).这一结果表明, 低含量四环素在一定程度上可提升污泥蚯蚓堆肥过程的硝化速率, 而高含量四环素对硝化速率有显著抑制作用.实验发现, A1、A0、A5和A10组中蚯蚓生物量增长率分别为5.3、3.3、3.0和1.8 mg·d-1, 因此A1组最高的硝化速率可能与其较高的蚯蚓生物量有直接关系.本研究中低含量四环素刺激生长, 可能与四环素作为动物生长剂有关[18].李娟英等[13]的研究表明四环素类和磺胺类抗生素对活性污泥的硝化速率均有抑制作用, 含量越高抑制作用越强. Zhang等[19]的研究表明低含量(5 μg·L-1和50 μg·L-1)的四环素和磺胺甲唑对活性污泥氨氮的去除效率没有显著抑制作用, 而高含量(10 mg·L-1)的抗生素可显著降低(P < 0.05)污泥氨氮的去除率.但本实验发现对硝化速率有显著抑制作用的抗生素含量要达到1 000 mg·kg-1, 其含量远高于其他学者的研究.这可能是由于蚯蚓的存在可在一定程度上降解四环素, 分担了抗生素对微生物的抑制作用[20].同时也跟污泥蚯蚓堆肥中的氨氧化菌群的耐药性有关. Huang等[21]发现污泥蚯蚓堆肥系统中含有大量的四环素抗性基因.
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A0、A1、A5和A10分别表示四环素添加含量为0、100、500和1 000 mg·kg-1, 下同; 相同的小写字母表示各组之间无显著性差异(P > 0.05) 图 1 四环素含量对污泥蚯蚓堆肥硝化速率的影响 Fig. 1 Effects of tetracycline concentrations on the nitrification rate of sludge vermicomposting |
由表 1可知, 污泥蚯蚓堆肥过程中AOA的amoA基因数量均显著高于AOB的amoA基因数量, 且AOA/AOB的值为2.26×103~7.56×103, 说明污泥蚯蚓堆肥硝化过程中AOA占主导地位. Huang等[9]的研究也发现AOA在果蔬蚯蚓堆肥体系氨氧化过程中占据主导地位.与A0相比, A1中AOA和AOB数量分别显著增加了50.17%和65.11%(P < 0.05), 说明低含量的四环素可以增加蚯蚓污泥堆肥中的amoA基因数量.这可能是因为AOA和AOB可将低含量的四环素作为碳源和氮源吸收利用[22], 从而提升AOA和AOB的数量. A1中较高的蚯蚓生物量也是其丰度显著增加的原因; 曹佳等[23]发现蚯蚓做穴、排粪等活动会改善微生物的生存环境, 从而促进微生物生长; Huang等[9]也发现蚯蚓可显著提升果蔬堆肥体中AOA和AOB的数量.
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表 1 四环素含量对污泥蚯蚓堆肥中AOA和AOB基因数量的影响1) Table 1 Effects of tetracycline concentrations on the gene numbers of AOA and AOB during sludge vermicomposting |
相比而言, A10与A0的结果无显著性差异(P > 0.05).然而, A5组的AOA及AOB数量较A0相比分别显著下降了50.67%和76.96%(P < 0.05).本研究发现, A0、A1、A5和A10的磷酸盐含量分别为107.98、124.85、151.21和118.57 mg·kg-1.相比而言, A5组的较高的磷酸盐含量可能是导致amoA基因数量发生变化的原因. Herfort等[24]的研究表明高含量的磷酸盐会降低北海中泉AOA的amoA基因数量; 同时程林等[25]的研究也发现氮肥会增加AOB的多样性, 而磷肥则会使AOB的多样性降低.本研究A5中较低的amoA基因数量而表现出较高的硝化速率可能与反应体系的环境因子以及AOA和AOB的种群多样性有关.
2.3 四环素对AOA和AOB群落多样性的影响一般而言, Shannon指数越大表示物种多样性越高, Simpson指数越大表示物种间均匀度越好.由表 2可见, AOA的Shannon指数和Simpson指数均随四环素含量的升高而降低, 说明高含量的四环素会降低AOA的多样性.相比于A0中的AOB, A1中的Shannon和Simpson指数均有所下降; 而A5和A10的Shannon和Simpson指数均升高.本研究结果和高景峰的相似[14].
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表 2 四环素含量对污泥蚯蚓堆肥中AOA和AOB的α多样性的影响 Table 2 Effects of tetracycline concentrations on the α diversities of AOA and AOB during sludge vermicomposting |
AOA和AOB的β多样性见图 2.如图 2(a)所示, A1与A0在第一主成分轴上呈正相关关系, 且同处第四象限, 表明二者的AOA种群结构差异较小.说明低含量四环素对AOA的种群结构影响较弱.但A10和A5则与A0在第一主成分上表现出负相关关系, 表明高含量四环素对AOA的群落结构影响较大.另外, 从AOB主成分分析结果看出[图 2(b)], A10和A5在第一、二主成分上均和A0呈负相关关系, 说明高含量四环素对二者的AOB群落结构影响较大. A1在第二主成分轴上与A0呈负相关关系, 且距离较远, 表明低含量亦对AOB的群落结构有较强的影响.因此, 相比于AOA, AOB的群落结构可能对四环素的响应更为敏感, 这可能与蚯蚓堆肥体中AOA对抗生素的耐药性强于AOB有关[26].
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图 2 基于主成分分析的四环素含量对污泥蚯蚓堆肥中AOA和AOB的β多样性的影响 Fig. 2 Effects of tetracycline concentrations on the β diversity of AOA and AOB during sludge vermicomposting as assessed by principal component analysis |
由AOB聚类结果可知[图 3(a)], 污泥蚯蚓堆肥中的AOB包含亚硝化螺菌属(Nitrosospira)以及亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)两大类. Huang等[9]在果蔬蚯蚓堆肥体系中也检测到相同的AOB类群.另外, 仅有3个OTU(OTU2、OTU3和OTU4)属于亚硝化单胞菌属, 其它OTU均属亚硝化螺菌属, 说明亚硝化螺菌属在AOB中占主导地位.由OTU热图可见[图 3(b)], OTU2的丰度最高, 表明其为污泥蚯蚓堆肥系统中最具有优势的AOB菌种.与A0相比, A1中OTU2、OTU4及OTU3的丰度较A0分别提升了5.45%、53.04%和41.98%, 说明低含量四环素可提升亚硝化单胞菌属的丰度.亚硝化单胞菌属为革兰氏阴性细菌, 可将CO2和有机物作为碳源, 混合营养生长[27].
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图 3 四环素含量对污泥蚯蚓堆肥中AOB物种群落组成及丰度的影响 Fig. 3 Effects of tetracycline concentrations on the community composition and abundance of AOB during sludge vermicomposting |
对于亚硝化螺菌属而言, A5和A10的丰度比A0的分别下降了1.26%~92.58%和1.40%~77.36%, 可见高含量四环素能降低亚硝化螺菌属的丰度.同时, 与A0相比, OTU10和OTU13在A1处理后丰度分别提升了74.3%和22.94%, 说明低含量四环素可选择性提升亚硝化螺菌的丰度.但Du等[6]的研究表明, 低含量四环素(5 mg·L-1)的加入会使活性污泥中亚硝化螺菌的生长受到抑制.而本研究中的选择性提升可能是与引入了蚯蚓有利于硝化细菌的生长有关[7].同时Huang等[9]发现蚯蚓的引入增加了亚硝化螺菌属的丰度.这与本研究的结果一致.
已有研究表明, AOA可划分为海洋类群group Ⅰ.1a及group Ⅰ.1a-associated、土壤类群group Ⅰ.1b和嗜热型ThAOA这4个类群[28].如AOA聚类树所示[图 4(a)], 污泥蚯蚓堆肥中可将AOA分为两大类：group Ⅰ.1b和group Ⅰ.1a.在所有的OTU中, 有18个归类为group Ⅰ.1b, 可见其为污泥蚯蚓堆肥中的AOA优势菌属.由物种丰度热图可知[图 4(b)], OTU8为极优势菌种, 属Nitrososphaera; 且随着四环素含量的升高, OTU8的丰度逐渐增加.相比之下, 同属的OTU22、OTU4、OTU25、OTU2、OTU6和OTU17均有类似的现象, 表明高含量的四环素可以增加Nitrososphaera的丰度. Nitrososphaera存在于土壤及低盐环境中[29], 是酸性土壤中AOA在氨氧化过程中的主要参与者.
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图 4 四环素含量对污泥蚯蚓堆肥中AOA物种群落组成及丰度的影响 Fig. 4 Effects of tetracycline concentrations on the community structure and abundance of AOA during sludge vermicomposting |
Nitrososphaera与Candidatus Nitrososphaera gargensis是同一属下的不同种菌类, 均归类为古菌土壤类群group Ⅰ.1b.与其不同的是, 同属Candidatus Nitrososphaera gargensis的OTU13和OTU11为化能自养型AOA[30], 随着四环素含量的增加, 其丰度均呈下降趋势.另外, OTU21、OTU7、OTU16、OTU23及OTU3均属奇古菌门Thaumarchaeota, 自养生长[31]; 随着四环素含量的增加, 其丰度均呈下降趋势, 说明高含量四环素可降低Thaumarchaeota的丰度.因此, 可推测四环素对自养型AOA有一定的抑制作用.抗生素的加入致使微生物所处的环境体系以及生长所需碳源和氮源发生变化, 降低微生物对碳源和氮源的利用能力[32].但对于四环素如何改变堆肥环境, 抑制自养AOA, 仍需进一步研究.
3 结论(1) 四环素含量对污泥蚯蚓堆肥体中的AOA和AOB的归趋呈现出不同的影响模式.
(2) 高含量四环素降低氨氧化主导者AOA的种群多样性和改变其种群结构, 抑制污泥蚯蚓堆肥体中的硝化速率.
(3) 低含量四环素显著增加污泥蚯蚓堆肥中AOA和AOB的数量, 提升污泥蚯蚓堆肥过程的硝化速率.
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