环境科学  2019, Vol. 40 Issue (6): 2948-2953   PDF    
引用本文
陈湜, 李正魁, 覃云斌, 丁帮璟, 陈志浩. 农田沟道土壤中锰氨氧化(Mn-ANAMMOX)过程的探究[J]. 环境科学, 2019, 40(6): 2948-2953.
CHEN Shi, LI Zheng-kui, QIN Yun-bin, DING Bang-jing, CHEN Zhi-hao. Insight into the Process of Mn-ANAMMOX in Soils of Agricultural Drainage Ditches[J]. Environmental Science, 2019, 40(6): 2948-2953.
农田沟道土壤中锰氨氧化(Mn-ANAMMOX)过程的探究
陈湜, 李正魁, 覃云斌, 丁帮璟, 陈志浩     
南京大学环境学院, 污染控制与资源化研究国家重点实验室, 南京 210023
收稿日期: 2018-12-10; 修订日期: 2019-01-09
基金项目: 国家水体污染控制与治理重大专项（2017ZX07204-004）
作者简介: 陈湜(1993~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为生态环境修复, E-mail:935438118@qq.com
通信作者: 李正魁, E-mail:zhkuili@nju.edu.cn
摘要: 二氧化锰介导的厌氧氨氧化（锰氨氧化）是最近发现的一种新型微生物脱氮途径，然而很少有研究报道农田沟道中的锰氨氧化过程和反应过程中主要微生物群落锰还原菌.本研究经过340 d锰还原菌富集培养实验，采用同位素示踪技术和高通量测序技术，证实了锰氨氧化在农田沟道土壤中的存在.结果表明，在锰氨氧化过程中可以观察到氨氮的氧化和MnO2的还原，以及NO2-、NO3-、30N2和Mn2+的产生，锰氨氧化平均速率为2.88 mg·（kg·d）-1，氨氮平均去除率为20%，总氮去除率平均可达15%.另外，高通量测序结果表明，经过340 d富集培养实验，在门水平上锰还原菌丰度从原来的27%增加到了70%，其主要的锰还原菌为不动杆菌（Acinetobacter）和地发菌属（Geothrix），相对丰度分别为26.63%和4.07%.实验结果证实了农田沟道中存在二氧化锰介导的厌氧氨氧化过程，可以认为锰氨氧化是微生物脱氮过程的一条重要路径.
关键词: 锰氨氧化      锰还原菌      同位素标记      高通量测序      氮去除     
Insight into the Process of Mn-ANAMMOX in Soils of Agricultural Drainage Ditches
CHEN Shi , LI Zheng-kui , QIN Yun-bin , DING Bang-jing , CHEN Zhi-hao     
State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China
Abstract: Anaerobic ammonium oxidation mediated by MnO2 (termed Mn-ANAMMOX) is a newly discovered microbial nitrogen removal pathway. However, few studies have reported on the Mn-ANAMMOX process and related microbial communities in agricultural drainage ditches. In this study, Mn(Ⅳ)-reducing bacteria (MnBR) enrichment cultivation was carried out for 340 days and an isotope tracing technique and high-throughput sequencing technology were used to provide convincing evidence of the occurrence of Mn-ANAMMOX. The results showed that simultaneous NH4+ oxidation and MnO2 reduction occurred during the reaction, and the production of NO2-, NO3-, 30N2, and Mn2+ was detected. Additionally, the average Mn-ANAMMOX rate, ammonium removal rate, and total nitrogen removal rate were 2.88 mg·(kg·d)-1, 20%, and 15%, respectively. Moreover, high-throughput sequencing results showed that after 340 d in the enrichment cultivation experiments, the abundance of MnBR increased from 27% to 70% at the phylum level, and the major genera of MnBR were determined as Acinetobacter and Geothrix, with relative abundances of 26.63% and 4.07%, respectively. Overall, the occurrence of Mn-ANAMMOX was directly proven during the MnBR enrichment cultivation experiments, and it might play an essential role in the pathway of microbial nitrogen removal.
Key words: Mn-ANAMMOX      Mn(Ⅳ)-reducing bacteria      isotope labeling      high-throughput sequencing      nitrogen removal     

近年来随着氮肥的过量施用, 沟道土壤中的氮素污染日益严重, 形成的地表径流是导致水环境氮污染的主要原因之一.目前土壤环境中最主要的脱氮过程有两类, 一是硝化反硝化, 指微生物将硝酸盐(NO3-)还原为氮气(N2)的过程; 二是厌氧氨氧化, 指微生物利用亚硝酸盐(NO2-)为电子受体, 将氨氮(NH4+)氧化为氮气的过程.根据已有的报道, 厌氧氨氧化的脱氮贡献率在土壤中占1.5%~3.7%[1~3], 对比而言, 硝化反硝化的脱氮贡献率可高达47%~98%[1, 4].近年来, 有研究发现一种新型的微生物脱氮过程, 铁氨氧化(Fe-ANAMMOX), 证实土壤中铁还原微生物可以利用三价铁离子参与厌氧氨氧化过程, 最终生成硝酸盐、亚硝酸盐以及氮气[5~7].

现有研究表明, 在土壤中四价锰有着和三价铁离子相类似的性质.有机氮或是氨氮可以在二氧化锰的参与下发生氧化, 并最终生成硝酸盐、亚硝酸盐以及氮气同时还原四价锰为二价锰, 在实验室和野外实验中均证实了锰氨氧化的这一过程[方程式(1)~(3)][8, 9].

(1)
(2)
(3)

Luther等[8]的研究证实在海洋沉积物中存在锰氨氧化过程, 通过热力学计算结果揭示了氮气产生的可能性. Bartlett等[10]给出了实验室证据证实了缺氧硝化, 在Loch Fyne海湾最深处的锰富集区观察到氨氮的还原以及亚硝酸盐和硝酸盐的积累. Swathi等[11]进行了SBR实验证实SBR反应器中锰氨氧化过程的存在, 在只添加MnO2和NH4+的条件下, 观察到氨氮的去除以及硝酸盐、亚硝酸盐的积累. Javanaud等[12]利用同位素示踪技术研究海底沉积物中锰氨氧化过程, 通过同时添加15NO3-和14NH4+检测到29N2的产生.但是, 目前的国内外研究主要集中在海洋沉积物中锰氨氧化的过程, 对于陆地生态系统中锰氨氧化的研究十分少见, 尚不清楚在农田沟道中是否存在锰氨氧化这一过程.另外, 值得注意的是, 沟道土壤中的铁含量远高于锰, 由于土壤中还存在铁氨氧化, 其产生的硝酸盐、亚硝酸盐或氮气会影响锰氨氧化的观察结果, 因此, 在研究土壤中的锰氨氧化过程中排除环境中铁离子对锰氨氧化的影响显得尤为重要.然而, Thamdrup等[13]的研究结果显示锰氨氧化过程并不显著且没有在实验中检测到NO3-或是15N标记的N2积累.与Luther等[8]的实验不同, Thamdrup等[13]在实验中没有添加新鲜制备的MnO2作为电子受体而是认为海洋底泥中原有的MnO2含量足够供给锰氨氧化反应.但前人的研究表明, 老化的MnO2不起反应, 新鲜的MnO2才具有反应活性[14, 15], 因此是否添加新鲜制备的MnO2可能会对实验产生较大影响.

此外, 有研究表明锰氨氧化是一种微生物过程, 且锰还原类微生物可以利用氨氮为电子供体, 锰氧化物为电子受体, 将高价锰还原为二价锰, 因此锰还原类微生物(即锰还原菌)在锰氨氧化过程中发挥关键作用[10, 12, 14, 16, 17]. Thamdrup等[18]在微生物学水平上分析了海底沉积物中厌氧碳氧化过程的锰还原过程, 采用微生物稀释培养计数法和荧光原位杂交(FISH)实验, 发现主要的锰还原菌为Shewanella. Javanaud等[12]在菌株水平上研究了锰氨氧化反应, 采用分离纯化培养技术分离了海洋沉积物中的微生物, 并将分离的菌株鉴定为Marinobacter daepoensis和Shewanella.但到目前为止有关锰氨氧化过程涉及的锰还原类微生物群落多样性和丰度的研究鲜见报道.

因此, 本研究选取农田沟道作为采样地点, 探究了陆地土壤中锰氨氧化过程.实验中采用适宜微生物生长繁殖的凝胶作为载体富集培养土壤中锰氨氧化相关的微生物[19], 通过添加新鲜制备的MnO2在只存在锰还原菌的条件下探究锰氨氧化过程, 避免了铁离子的干扰.此外, 运用高通量测序来研究土壤的微生物多样性和结构.本文结论对农田沟道中锰氨氧化对氮素去除的作用具有理论及实际意义.

1 材料与方法 1.1 样品采集与测试方法

选取中国江苏省无锡市太湖九里河流域农田沟道(120°51′N, 31°58′E)作为采样地点, 采取表层0~20 cm土层.样品采集后立即运回实验室分两份存贮, 分别用于锰还原菌富集培养实验和微生物群落高通量测序分析.

1.2 锰还原菌富集培养实验

将取自农田沟道的土壤样品用来进行长期培养实验, 整个实验过程在厌氧条件下进行.将20 g新鲜土壤置于装有灭菌培养液的100 mL血清瓶中, 然后用橡胶塞密封并盖上铝帽, 保存在25℃的黑暗环境中在转速150 r·min-1下的恒温摇床内进行连续培养.培养液为：NaHCO3 (600 mg·L-1)、MgCl2·6H2O (16.5 mg·L-1)、KH2PO4 (27 mg·L-1)、CaCl2·2H2O (92 mg·L-1)、0.125 mL的维他命溶液和0.125 mL的痕量元素溶液[20, 21].为了富集培养锰还原菌, 培养液事先通入高纯氦气以去除水中溶解氧, 且血清瓶中还添加了作为微生物载体的多孔凝胶[19].血清瓶进水中添加50 mg·L-1 NH4Cl以及6 mg MnO2, 每5 d换一次水.其中, 添加的MnO2根据Lin等[15]的合成方法在实验室自主制备.经过长时间的换水后, 血清瓶中无土壤残留, 只包含负载了微生物的凝胶载体.本实验同时进行了一组只添加载体凝胶没有微生物存在的空白对照.

1.3 同位素示踪实验

锰氨氧化速率通过同位素示踪技术和膜接口质谱仪(membrane inlet mass spectrometry, MIMS)进行测定, 用以区分不同微生物过程(包括反硝化、厌氧氨氧化和锰氨氧化)所产生的氮气, 与铁氨氧化类似, 30N2可以表征锰氨氧化速率[5~7].在锰还原菌培养实验稳定运行之后, 定期向血清瓶中加入氮同位素15NH4Cl, 使得血清瓶中15NH4Cl-N的浓度为100 μmol·L-1. 5 d后, 在出水中采集15 mL水样并加入100 μL 7mol·L-1 ZnCl2终止微生物活动, 水样通过MIMS分析30N2的产生速率.

1.4 微生物群落结构探究

将原始土壤样品和富集培养后的微生物样品分别采集并于-80℃保存.两份微生物样品送往上海美吉生物公司进行DNA的提取扩增处理, 扩增引物采用高变区通用引物Ⅴ4/Ⅴ5, 其正向引物是515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′), 反向引物是907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)[6], 对各个样品进行PCR扩增处理, 纯化后的PCR样品再进行Illumina MiSeq上机测序.所得到的数据直接采用上海美吉公司的Ⅰ-Sanger云平台分析, 去除低质量序列, 选用相似水平为97%的OTU样本, 最终获得微生物群落结构特征.

1.5 常规测定方法与数据分析

锰还原菌富集培养实验循环周期为5 d, 检测每一次出水中氨氮、硝态氮、亚硝态氮的测定方法分别选用：纳氏试剂分光光度法、盐酸分光光度法以及N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[22], 并采用火焰原子吸收法定期测定出水中Mn2+浓度.数据归纳和图表分析采用Excel和OriginPro 8.1, 数据统计分析采用SPSS 17.0.

2 结果与分析 2.1 空白实验

本实验共持续30 d, 每隔3 d采集一次出水分别测定氨氮、硝态氮、亚硝态氮和锰离子含量, 并更换血清瓶中水样, 重新添加氨氮和MnO2.结果表明, 在没有微生物存在的情况下单独的载体凝胶不能氧化氨氮也不能还原MnO2.出水中各成分含量几乎没有变化, 氨氮浓度几乎没有减少, 同时硝态氮、亚硝态氮和锰离子浓度均低于检测限(图 1).

图 1 只有载体凝胶存在条件下锰还原菌富集培养实验中氮、锰浓度变化趋势 Fig. 1 Changes in the forms and concentrations of nitrogen and Mn in MnBR enrichment cultivation experiments

2.2 锰还原菌富集培养实验中氮和锰浓度的变化

在仅有微生物存在的条件下观测锰氨氧化的反应过程, 本实验结果表明, 出水中氨氮浓度显著下降, 硝酸盐和亚硝酸盐浓度显著上升, 且反应过程中检测到了30N2的产生, 锰离子含量也相对较高.锰还原菌在血清瓶中连续培养340 d, 整个培养可以分为3个阶段, 即启动阶段(0~50 d)、调整阶段(50~240 d)和适应阶段(240~340 d), 出水中各组分的浓度在第二阶段开始测定(图 2).本实验结果表明, 当培养趋于稳定时, 出水的硝态氮浓度为0.1~1mg·L-1, 亚硝态氮浓度约为2~8mg·L-1.在培养240 d后, 氨氮平均去除率超过20%, 总氮平均去除率也高于15%, 总氮去除率最高可达到65.19%.此外, 当整体培养趋于稳定之后, 定期测定出水水样中溶解的氮气, 出水中锰离子含量也定期检测, 结果见表 1.结果表明, 锰还原菌富集培养实验直接观测到了30N2的产生以及MnO2还原, 同时生成硝酸盐、亚硝酸盐, 直接证实了锰氨氧化的存在.

图 2 锰还原菌富集培养实验中不同形式氮浓度变化趋势 Fig. 2 Changes in the forms and concentrations of nitrogen in MnBR enrichment cultivation experiments

表 1 锰还原菌富集培养过程中30N2产量和锰离子含量变化 Table 1 Changes in the production of 30N2 and Mn(Ⅱ) in MnBR enrichment cultivation experiments

2.3 微生物群落结构在锰还原菌富集培养前后的变化

原始土壤样品和锰还原菌富集培养300 d后的微生物群落结构变化如图 3所示.在原始土壤中, 在门水平上最丰富的锰还原菌主要是变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes), 其丰度分别为26.23%和0.77%(图 3).从属水平来看, 土壤样品中包含的最主要的锰还原菌为土杆菌属(Geobacter)和地发菌属(Geothrix), 其相对丰度分别为0.070 5%和0.006 1%(表 2).其余可检测到的锰还原菌属水平微生物分别是脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium)、脱硫单胞菌(Desulfuromonas)、不动杆菌(Acinetobacter)和希瓦氏菌属(Shewanella)[23], 然而锰还原菌属水平微生物的相对丰度非常低, 其含量不足总测序数的1%.此外, 还有一部分微生物(2.34%)属于未分类的门.

图 3 锰还原菌富集培养前后门水平微生物的变化趋势 Fig. 3 Changes in the microbial community relative abundance before and after the MnBR enrichment cultivation at the phylum level

而在锰还原菌富集培养后, 微生物群落结构和原始土壤中的相比发生了显著的变化(图 4).在门水平上, 变形菌门(Proteobacteria)依然是最丰富的微生物门类并且相对丰度提高了20%, 富集培养后变形菌门占总测序数的49.35%.相对丰度第二位的门水平微生物是一组未被分类的菌占总测序数的20.26%.相对而言绿弯菌(Chloroflexi)的相对丰度有所下降, 从原始土壤中的13.96%下降到富集培养后的4.91%(图 3).在属水平上, 不动杆菌(Acinetobacter)和未被分类菌属是含量最丰富的锰还原菌, 分别占总测序数的26.63%和20.26%.另外, 地发菌属(Geothrix)相对丰度也显著增加, 富集培养后占总测序数的4.07%(图 4和表 2).对比锰还原菌富集培养前后的微生物群落结构, 结果表明, 与锰氨氧化相关的微生物在富集培养后显著增加, 而与锰氨氧化无关的微生物在富集培养后大量减少, 锰还原菌富集培养实验成功富集了锰还原菌.

图 4 锰还原菌富集培养前后属水平微生物的相对丰度 Fig. 4 Microbial community relative abundance before and after the MnBR enrichment cultivation at the genus level

表 2 锰还原菌富集培养前后属水平微生物的变化趋势 Table 2 Changes in the microbial community relative abundance before and after MnBR enrichment cultivation at the genus level

3 讨论 3.1 锰氨氧化的产生

由于土壤中铁含量远高于锰, 导致很难观测并区分原位土壤中的锰氨氧化过程, 本实验将土壤中原位微生物负载至凝胶载体, 通过不断添加新鲜制备的二氧化锰, 富集培养锰氨氧化相关的锰还原菌, 以便观察锰氨氧化过程.本研究的实验过程中：①全部实验在厌氧条件下进行, 避免了氧气接触导致硝化过程的干扰; ②实验过程中添加的含氮化合物只有NH4Cl, 避免了其他可能产生氮气的微生物过程(如共脱氮); ③血清瓶进水中不含任何含铁化合物, 出水中也检测不到铁离子的存在, 避免了锰氨氧化过程中受到Feammox的干扰.因此, 血清瓶出水中检测到的NO2-、NO3-和30N2只可能源自锰氨氧化过程, 且对比血清瓶进水和出水, 观察到显著的NH4+氧化和MnO2还原, 直接证实MnO2可以作为NH4+氧化的电子受体.因此, 血清瓶出水中检测到的NO2-、NO3-和30N2可以证实沟道土壤中存在锰氨氧化过程.

3.2 锰氨氧化过程中的Mn(Ⅳ)还原

血清瓶出水中Mn(Ⅱ)浓度平均为2.34 mg·L-1, 然而按照方程式(3)的化学计量数计算, 出水中的锰离子浓度偏低, 不能对应测量得到氮气含量.这里设想了两个可能的原因, 一是MnO2本身的一些固有性质, 包括强氧化活性、表面不均和阳离子交换反应的能力, 可以使其从溶液中吸附各种离子如Na+、K+、Ca2+和Mn2+等[11, 24, 25]; 二是由于锰元素的生物地球化学循环的复杂性, Mn2+浓度的测定相比其他金属离子精确度较低.且Mn(Ⅲ)是微生物Mn(Ⅳ)还原和Mn(Ⅱ)氧化反应的重要中间体, 有关学者在自然界中发现了大量的Mn(Ⅲ/Ⅳ)氧化物[24, 26], 而由于Mn(Ⅲ/Ⅳ)氧化物的不溶性, 在出水中几乎检测不到其存在.鉴于上述原因, 本实验可能低估了出水中Mn(Ⅱ)浓度.

3.3 锰还原菌的多样性及丰度

本实验测量了原始土壤和富集培养300 d后微生物群落组成的变化.在本研究中, 所有测量的微生物序列均被鉴定为细菌, 对比富集培养前后, 微生物群落组成变化显著.富集培养300 d后, 锰还原菌的丰度显着增加, 表明锰还原菌在锰氨氧化中的重要性不容忽视.在门水平上, 变形菌门是锰还原菌中最丰富的门, 分别占原始土壤和富集培养微生物中的30%和50%.在属水平上, 原始土壤中锰还原菌比例很低, 而富集培养后锰还原菌丰度显著增加.不动杆菌属和地发菌属是实验中检测到的最丰富的属级别锰还原菌.

不动杆菌是最丰富的属级别微生物, 占富集培养微生物的所有序列的26.63%.有研究表明, 这种菌属可以在厌氧条件下存活[27, 28].此外据报道, 不动杆菌可以在人工湿地[29]、废水处理系统[30]和中试规模的生物反应器[31]中降解NH4+.在厌氧条件下, 该菌属还可以适应锰作为最终电子受体的能量代谢[28].由于以上原因, 可以解释为什么不动杆菌是富集培养后最丰富的锰还原菌属.本研究中另一个最主要的锰还原菌为地发菌属, 是一种革兰氏阴性严格厌氧菌, 已知其在金属(如锰)的还原中发挥着积极作用[17, 24, 32].地发菌属所占相对丰度为4.07%, 相对于原始土壤中的含量, 富集培养后地发菌属相对丰度增长了6 600%.线粒体(mitochondria)是血清瓶中检测到的第三大丰富的属级别微生物.据报道Mn(Ⅲ)作为线粒体的辅酶金属离子, 通过其还原性, 可以消耗O2-·并促进厌氧环境中缺乏SOD酶的大肠杆菌的生长[33].线粒体的富集一定程度上解释了之前提出的Mn2+浓度远低于预期的问题, 也侧面证实了反应过程中Mn(Ⅲ)的存在.然而, 还有一大部分的序列(20.26%)没有被鉴定为任何的属.据推测, 这些新型的微生物很可能是尚未得到纯培养的细菌, 它们可能在锰氨氧化过程中发挥着非常重要的作用.

4 结论

(1) 本研究选取农田沟道土壤为研究对象, 利用多孔有机聚合物为锰还原菌微生物的生长载体, 持续富集培养来自农田沟道土壤的土著微生物, 在仅有微生物存在的条件下, 证实了锰氨氧化过程.

(2) 在锰还原菌富集的条件下, 锰氨氧化平均速率达到2.88 mg·(kg·d)-1, 氨氮平均去除率20%, 总氮平均去除率15%.锰氨氧化过程中, 可以直接观察到NO2-、NO3-、30N2以及Mn2+的产生, 证实了存在锰氨氧化过程.

(3) 微生物富集培养后, 在门水平上, 主要的微生物是变形菌门(Proteobacteria), 相对丰度为49.35%;在属水平上, 不动杆菌(Acinetobacter)是主要的菌属, 占总测序数的26.26%.

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