N₂O是一种重要的温室气体. 2011年, 大气中N₂O浓度已高达324 μg·m^-3, 是1750年的1.2倍^[1].施肥及高强度的农业活动使得农田土壤成为N₂O的重要排放源.在稻田土壤中, N₂O的产生主要来自于反硝化作用.反硝化作用是由许多厌氧或兼性厌氧微生物参与的将NO₃^-转化为N₂O/N₂的一系列酶催化过程.这些酶主要由功能基因narG/napA(硝酸还原酶)、nirK/nirS(亚硝酸还原酶)、norB(一氧化氮还原酶)和nosZ(氧化亚氮还原酶)编码.土壤性质如土壤质地、pH、含水量、土壤N的种类等的变化均可影响反硝化微生物, 进而影响反硝化速率^[2~4].因此, 可采取措施改变微生物的生存环境, 减缓N₂O排放的微生物过程.

生物质炭是生物质(包括作物秸秆、木屑等)在缺氧条件下热解炭化产生的一类高度芳香化的固态难溶性物质^[5].生物质炭具有碱性、多孔性、高比表面积和含有大量表面负电荷及高电荷密度等特点^[6], 添加到土壤中, 可通过改变土壤性质来影响反硝化微生物的生长及N₂O的排放^[7~10].近年来, 不少学者开展了生物质炭对反硝化功能微生物及N₂O排放影响的研究^{[8, 11]}. Chen等^[12]通过培养试验, 在Cd污染的水稻土中添加生物质炭, 发现生物质炭增加了亚硝酸还原酶功能基因(nirK和nirS)和氧化亚氮还原酶功能基因(nosZ)的丰度, N₂O排放较对照增加了10倍多, 其将其归因于生物质炭本身含有的可溶性有机碳及NO₃^--N和增加的土壤pH. Liu等^[11]利用煤矿塌陷区土壤进行小麦盆栽试验, 发现添加4%的生物质炭可增加nirK和nirS基因丰度, 同时还增加了nirK基因的群落多样性, 但对nirS基因群落多样性并无影响.冗余分析(RDA)结果表明, nirK基因群落多样性的增加与土壤NO₃^--N、有效磷和pH有关, 而nirS基因群落多样性仅与土壤NO₃^--N有关. Harter等^[13]则认为生物质炭可作为电子穿梭体, 促进土壤中电子向反硝化微生物转移, 虽然对nirK和nirS基因无影响, 但增加了nosZ基因的丰度和活性, 促进了N₂O向N₂的转化, 使得N₂O排放较对照降低了47%~96%. Anderson等^[14]利用高通量测序技术分析发现, 生物质炭添加对具有narG功能基因的分支杆菌Mycobacterium和具有nosZ功能基因的慢生根瘤菌Bradyrhizobium具有促进作用.也有研究证明, 生物质炭添加对参与反硝化作用的nirK、nirS和nosZ基因丰度均无影响^[15].

综上所述, 前人多以室内培养、盆栽等人工控制试验条件下开展生物质炭对土壤反硝化微生物的效应研究, 而自然条件下的大田环境, 因受多种因素的影响, 与人工控制试验差异较大.基于此, 本研究利用田间原位试验, 开展了生物质炭对亚热带双季稻田休闲季和水稻季土壤反硝化功能微生物的影响, 拟探明生物质炭对稻田反硝化过程调控的机制, 以期为生物质炭在亚热带双季稻田N₂O减排中的应用提供理论基础.

本研究的试验小区位于湖南省长沙县中国科学院亚热带农业生态研究所长沙农业环境观测研究站(113°19′52″E, 28°33′04″N), 海拔80 m.本区域为典型的亚热带湿润季风气候, 年平均温度为17.5℃, 年均降雨量为1 330 mm, 且多集中在3~8月(占全年降雨量的60%以上), 无霜期为274 d.土壤为花岗岩发育的麻沙泥水稻土.生物质炭产自河南商丘三利新能源有限责任公司, 为小麦秸秆在350~550℃条件下制成.供试土壤和生物质炭的基本理化性质见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 土壤及生物质炭基本理化性质1) Table 1 Basic properties of soil and biochar 项目 总碳/g·kg-1 总氮/g·kg-1 总磷/g·kg-1 总钾/g·kg-1 pH 容重/g·cm-3 灰分/% 砂粒/% 粉粒/% 黏粒/% 土壤 18.9 2.1 0.39 28.4 5.4 1.2 — 42.4 30.4 27.2 生物质炭 418.3 5.8 0.58 9.2 9.3 0.18 37.2 — — — 1)“—”表示未测

表 1 土壤及生物质炭基本理化性质1) Table 1 Basic properties of soil and biochar

本试验小区面积为35 m²(7 m×5 m).设置3个处理：①无生物质炭添加(CK); ②添加24 t·hm^-2生物质炭, 相当于0~20 cm土层重的1%(LC); ③添加48 t·hm^-2生物质炭, 相当于0~20 cm土层重的2%(HC).每个小区内安置1个面积为0.4 m²的底座, 用于温室气体的采集.生物质炭只在2012年早稻季开始前添加, 以后不再添加.每个处理3个重复, 随机设置.

2013年晚稻品种为T优207, 氮肥施用量按照当地常规施肥施用, 总施氮量为150 kg·hm^-2, 分3次施入土壤, 即水稻移栽前的基肥, 追肥分两次, 即分蘖肥和穗肥, 其比例为5:3:2.而磷肥(过磷酸钙, P₂O₅, 40 kg·hm^-2)、钾肥(硫酸钾, K₂O, 100 kg·hm^-2)和锌肥(硫酸锌, ZnSO₄·7H₂O, 5 kg·hm^-2)则以基肥一次性施入土壤.水分管理为间歇灌溉, 即淹水-晒田-淹水的干湿交替, 病虫害防治及其他的田间管理均采用常规管理模式.休闲季不进行农事活动. 2013年晚稻季田间管理具体措施：7月16~17日翻地, 7月18日施肥, 7月19日移栽秧苗, 行距和株距均为20 cm, 底座内插9穴, 7月26日喷施除草剂, 8月3日按照45 kg·hm^-2的施肥量(以N计)追施分蘖肥, 8月21日烤田, 8月25日喷洒杀虫剂, 9月3日复水, 9月7日按照30 kg·hm^-2的施肥量追施穗肥. 9月25日进行收获前排水, 10月22日收获水稻.

分别于2013年4月22日(即休闲季结束时, 整个休闲季土壤性质较一致)和2013年8月22日(晚稻季排水第2 d, 土壤干湿状况较能代表整个水稻季的平均状况)采集土壤样品.在每个小区内按照“S”型取5个点, 采集0~20 cm耕层土壤, 混合后作为1个样品.将土壤样品中的根系和石子等挑出来, 并将其充分混匀, 实验室4℃保存.另取其中200 g左右迅速用锡箔纸包好, 放入灭菌的袋子中, 投入到液氮中, 运送至实验室, -80℃冰箱保存备用.

气体采用静态暗箱法采集, 采样箱箱体(长×宽×高=64 cm×64 cm×120 cm)由不锈钢制成, 外覆绝热泡沫材料, 箱体内部顶端安装有2个风扇, 采样时将其打开可混匀箱体内的气体, 箱子侧面安装有风扇电源线接头、温度表接头以及样品采集管接头.为防止采样时对采样点周围水稻及土壤的破坏和影响, 在采样点附近架了1个栈桥.采样时, 将采样箱扣在底座上.采样一般在上午的09:00~11:00, 因N₂O排放通量受土壤温度的影响较大, 此时段的温室气体排放通量接近一天的平均值^[16].采样时, 每隔10 min采集一次样品, 连续采集5次, 即在0、10、20、30和40 min时分别从采样箱内用注射器抽取60 mL的气体, 然后注入12 mL的真空瓶中待测.水稻季和休闲季均一周采一次样, 遇到重要事件如施肥、烤田和复水等, 加大采样频率为每2~3 d一次.休闲季采样时间段为：2012年11月1日~2013年4月21日; 晚稻季采样时间段为：2013年7月20日~10月22日.在气体采集的同时, 温度计(JM624, Tianjin Jinming Instrument Co. Ltd., China)测定土壤温度、箱体内温度, 用尺子测定水深.

取80 mL的0.5 mol·L^-1 K₂SO₄加到30 g土中, 振荡1 h后过滤.滤液用连续流动分析仪(Tecator FIA Star 5000 Analyzer, Foss Tecator, Sweden)测定土壤中的铵态氮(NH₄⁺-N)和硝态氮(NO₃^--N)含量; 取滤液用TOC仪(TOC-VWP, Shimadzu Corporation, Japan)测定土壤中的可溶性有机碳(DOC)的含量.土壤微生物生物量氮(MBN)采用“氯仿熏蒸-0.5 mol·L^-1K₂SO₄提取法”测定^{[17, 18]}：称取相当于烘干重20 g新鲜土样, 在真空干燥器中用氯仿蒸气在25℃下避光熏蒸培养24 h, 熏蒸后反复抽真空以除去残留氯仿, 再加入80 mL 0.5 mol·L^-1 K₂SO₄溶液振荡1 h后过滤; 取10 mL提取液, 加CuSO₄溶液和浓硫酸消化后采用连续流动分析仪分析测定其中的N^[18].以熏蒸与不熏蒸土样提取的氮的差值除以转换系数(K_N=0.45)来计算土壤MBN.用不熏蒸土样提取的氮减去无机氮中的铵态氮即为可溶性有机氮(DON); 土壤含水量采用烘干称重法测定.土壤pH值测定：蒸馏水(土水比1:2.5)浸提30 min, 用Mettler-toledo320 pH计测定.

N₂O用气相色谱仪(Agilent 7890A, Agilent Technologies, USA)测定.电子捕获检测器(ECD)用于测定N₂O浓度, 检测温度为350℃, N₂为载气. N₂O排放通量根据盖箱时箱体内气体浓度变化的线性关系(当5次气体的线性回归系数小于0.90, 则舍弃该通量值)、箱体高度、箱体内温度及压强来计算^[19], N₂O累积排放量通过每两次采样的通量平均值与采样时间间隔的乘积来计算^[16].

土壤中微生物的总DNA用DNA提取试剂盒(PowerSoil^TM DNA Isolation Kit, Mo Bio Laboratories Inc., CA)提取, 使用Nanodrop ND-1000核酸分析仪测定DNA浓度和纯度, 置于-20℃保存.

构建narG、nirK和nosZ基因标准曲线参见Chen等^[20]的方法：首先构建克隆文库, 然后选择阳性克隆子, 吸取10 μL菌液于5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中, 37℃摇床培养10 h, 提取重组质粒, 测量OD值, 换算成拷贝数. 10倍梯度稀释作为标准曲线的模板.标准曲线的范围为10²~10⁸之间.拷贝数计算：

实时荧光定量PCR(qPCR)分析：所用仪器为ABI 7900(Applied Biosystem). narG、nirK和nosZ的反应体系为：5 ng DNA模板, 0.4 μL上游引物(narG-571F^[20]、nirK-876F^[21]和nosZ-1126F^[22]), 0.4 μL下游引物(narG-773R、nirK-1040R和nosZ-1381R), 5 μL SYBR-GreenⅡ(Takara), 0.2 μL Rox参比染料(Takara), 补充ddH₂O至10 μL. narG、nirK和nosZ的片段长度分别为256、165和203 bp. narG和nosZ的扩增程序相同：95℃预变性30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 72℃ 10 s, 40个循环; 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 90℃ 15 s溶解曲线. nirK的扩增程序：95℃预变性1 min, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环; 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 90℃ 15 s溶解曲线.

末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析.narG基因反应体系为50 μL：上下游引物各2 μL(145F, 773R)^[20], 25 μL PCRmix, DNA模板140 ng, 补充ddH₂O至50 μL.反应程序为：95℃预变性5 min, 95℃ 30 s, 60℃ 45 s, 72℃ 1 min, 2个循环; 95℃ 30 s, 55℃ 45 s, 72℃ 1 min, 10个循环; 95℃ 30 s, 50℃ 45 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃延伸15 min. nirK和nosZ基因反应体系均为50 μL：上下游引物各2 μL(nirK-F1aCu/nirK-R3Cu^[21]和nosZ-1121F/nosZ-1662R^[20]), 25 μL PCRmix, DNA模板60 ng, 补充ddH₂O至50 μL.反应程序为：95℃预变性3 min, 94℃ 30 s, 65℃ 45 s, 72℃ 45 s, 10个循环; 94℃ 30 s, 55℃ 45 s, 72℃ 45 s, 35个循环; 72℃延伸15 min. narG、nirK和nosZ片段长度分别为629、472和411 bp. narG、nirK和nosZ上游引物的5’端均被羧基荧光素(FAM, carboxyfluorescein-5-succimidyl ester)标记.所使用的PCR仪器为Eppendorf-6321. PCR产物先经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离, 利用DNA凝胶纯化试剂盒(天根)回收纯化目的片段, 然后对回收的片段进行酶切, 其中narG基因使用Rsal酶, nirK使用TaqI酶, nosZ使用CfoI酶, 酶切产物送上海桑尼生物科技有限公司进行T-RFLP分析, 分析仪器为ABI 3100基因分析仪(ABI Prism 3100 Genetic Analyzer).

运用SPSS 20.0分析软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA, 置信水平95%)和相关性分析. T-RFLP数据采用Primer5进行群落相似性分析, 同时利用R语言分析软件中曼特尔-亨塞尔检验(Mantel test)分析微生物群落组成与土壤因子之间的相关性, 利用Canoco 4.5软件对微生物群落结构组成进行主成分分析(PCA).

各处理的土壤性质如表 2所示, 生物质炭提高了休闲季土壤pH, 增幅为0.2~0.8个单位, 且随着生物质炭添加量的增加, pH逐渐提高, 与对照相比, HC显著提高了土壤pH(P < 0.05).休闲季, LC和HC的NH₄⁺-N含量分别较对照增加了21.1%和32.5%, HC和CK之间差异显著(P < 0.05), 但生物质炭却降低了水稻季NH₄⁺-N含量(P < 0.05), 降幅达48.8%~60.1%.生物质炭增加了休闲季土壤NO₃^--N含量, 且随着添加量的增加而增加, 各处理之间均差异显著(P < 0.05), 而水稻季各处理之间均未表现出显著差异性(P>0.05).虽然LC和HC增加了土壤DOC(休闲季和水稻季)和DON含量, 但各处理之间差异性均不显著(P>0.05).与对照相比, 休闲季LC和HC的MBN含量分别增加了16.7 mg·kg^-1和13.1 mg·kg^-1.

表 2 (Table 2)

表 2 生物质炭对土壤性质的影响1) Table 2 Effects of biochar amendment on soil chemical properties 季节 处理 土壤性质 pH NH4+-N/mg·kg-1 NO3--N/mg·kg-1 DOC/mg·kg-1 DON/mg·kg-1 MBN/mg·kg-1 CK 5.8±0.1b 3.6±0.4b 0.1±0.0c 48.2±0.9a 3.8±0.8a 41.2±2.9b 休闲季 LC 6.0±0.3b 4.4±1.1ab 0.1±0.0b 49.2±8.6a 5.2±0.9a 57.9±7.3a HC 6.6±0.1a 4.8±0.0a 0.2±0.0a 48.5±3.8a 4.3±0.6a 54.3±8.7ab CK — 7.8±2.1a 0.2±0.1a 38.2±2.8a — — 水稻季 LC — 4.0±0.7b 0.3±0.1a 41.2±3.1a — — HC — 3.1±0.6b 0.2±0.0a 43.4±2.9a — — 1)“—”表示未测; 不同字母表示各指标休闲季或水稻季分别在P < 0.05水平下处理间差异显著

表 2 生物质炭对土壤性质的影响1) Table 2 Effects of biochar amendment on soil chemical properties

如图 1所示, 2012~2013年休闲季各处理的N₂O累积排放量分别为0.12、0.15和0.15 kg·hm^-2, 与对照相比, 生物质炭对休闲季N₂O排放并无显著影响.但在水稻季, HC较对照增加了N₂O累积排放量(P < 0.05), 增幅达32.8%, LC和CK之间无显著差异(P>0.05).

图 1

Fig. 1

不同字母表示休闲季或水稻季分别在P < 0.05水平下处理间差异显著 图 1 休闲季和水稻季各处理的N2O累积排放量 Fig. 1 Cumulative N2O emissions in the fallow and rice seasons

生物质炭对休闲季和水稻季参与反硝化过程的主要功能基因丰度的影响见图 2.生物质炭处理增加了休闲季narG基因拷贝数(P < 0.05), 增幅分别为60.8%和52.8%, 而水稻季生物质炭并未对narG基因丰度产生影响(P>0.05).生物质炭不影响休闲季nirK基因丰度, 但在水稻季, HC较对照增加了nirK基因拷贝数23.5%(P < 0..05).生物质炭增加了休闲季和水稻季nosZ基因的拷贝数(P < 0..05), 增幅分别为24.8%、39.5%和36.1%、30.7%, 而LC和HC之间无显著性差异(P>0.05).水稻季的narG和nosZ基因丰度均较休闲季有所降低, 但对于nirK基因丰度, 水稻季高于休闲季.

图 2

Fig. 2

不同字母表示休闲季或水稻季分别在P < 0.05水平下处理间差异显著 图 2 生物质炭对反硝化功能基因丰度的影响 Fig. 2 Effects of biochar amendment on the abundances of denitrification functional genes

生物质炭改变了休闲季和水稻季narG、nirK和nosZ基因的群落结构(图 3). narG、nirK和nosZ的末端限制性片段(T-RFs)相对丰度变化及相似性分析显示(图 4), 休闲季和水稻季narG基因群落在76%相似性水平下被分成两簇, 水稻季HC一簇, 其他处理一簇, 在83%相似水平下, 休闲季HC一簇, 水稻季CK、LC及休闲季CK、LC一簇, 在86%相似水平下又被分为两簇, 水稻季CK一簇, 水稻季LC和休闲季CK、LC一簇, 然后在90%相似水平下被分成两簇, 水稻季LC一簇, 休闲季CK、LC一簇, 最后二者又在91%相似水平下被分为两簇, 表明生物质炭, 尤其是水稻季HC, 改变了narG基因群落结构. nirK基因群落在70%相似性水平下, 被分为两簇, 水稻季的CK一簇, 其他处理一簇, 在86%相似性水平下又分为两簇, 休闲季LC、HC一簇, 休闲季CK和水稻季LC、HC一簇, 然后在88%相似水平下被分为两簇, 休闲季CK一簇, 水稻季LC、HC一簇, 最后分别在91%和93%相似水平下, 水稻季和休闲季的LC和HC又各分为两簇, 说明生物质炭影响了nirK基因群落组成.在61%相似水平下, nosZ基因群落被分为两簇, 休闲季HC一簇, 其他处理一簇, 在63%相似水平下, 又分为水稻季CK一簇, 水稻季LC、HC和休闲季CK、LC一簇, 然后在78%相似水平下, 水稻季的LC一簇, 水稻季HC和休闲季CK、LC一簇, 在79%相似水平下被分为两簇, 水稻季HC一簇, 休闲季CK、LC一簇, 最后二者又在83%相似水平下被分为两簇, 故生物质炭改变了nosZ基因的群落结构.

图 3

Fig. 3

图 3 不同处理的反硝化微生物群落结构组成PCA分析 Fig. 3 PCA of denitrification community structures analysis for treatments

图 4

Fig. 4

CK-F、LC-F、HC-F、CK-R、LC-R和HC-R分别表示休闲季和水稻季的CK、LC和HC处理; 不同颜色图标数字表示T-RFs片段长度(bp) 图 4 不同处理的反硝化功能基因群落结构组成及相似性分析 Fig. 4 Community structures and similarities of denitrifying function genes for different treatments

相关性分析表明(表 3), 休闲季, narG基因丰度与NH₄⁺-N呈显著正相关(P < 0..05), nosZ基因丰度与pH和NH₄⁺-N呈显著正相关(P < 0..05), 与NO₃^--N呈极显著正相关(P < 0..01).水稻季, nirK基因丰度与N₂O排放呈显著的正相关(P < 0..05), nosZ基因丰度与NH₄⁺-N呈极显著负相关(P < 0..01).

表 3 (Table 3)

表 3 土壤性质、N2O排放与反硝化功能基因丰度的相关性分析1) Table 3 Correlations between soil chemical properties as well as cumulative N2O emissions and denitrifying function genes abundances narG nirK nosZ pH NH4+-N NO3--N DOC DON MBN N2O 休闲季 narG 1 nirK -0.3 1 nosZ 0.8* -0.4 1 pH 0.4 -0.2 0.7* 1 NH4+-N 0.7* -0.5 0.8* 0.7* 1 NO3--N 0.4 -0.0 0.9** 0.9** 0.7* 1 DOC 0.0 0.2 0.1 -0.2 -0.5 0.0 1 DON 0.4 -0.3 0.4 0.2 0.5 0.1 0.0 1 MBN 0.7 -0.3 0.5 0.2 0.4 0.5 0.2 0.2 1 N2O 0.5 0.2 0.2 0.1 0.2 -0.1 -0.3 -0.4 0.5 1 水稻季 narG 1 nirK -0.1 1 nosZ 0.3 0.4 1 NH4+-N -0.4 -0.3 -0.8** — 1 NO3--N -0.3 -0.6 0.1 — 0.2 1 DOC -0.2 0.3 0.5 — -0.5 0.3 1 N2O 0.0 0.7* 0.1 1 -0.3 -0.5 0.2 — — 1 1) “—”表示未分析; *表示在P < 0..05水平下显著相关, **表示在P < 0..01水平下极显著相关, 下同

表 3 土壤性质、N2O排放与反硝化功能基因丰度的相关性分析1) Table 3 Correlations between soil chemical properties as well as cumulative N2O emissions and denitrifying function genes abundances

曼特尔-亨塞尔检验结果表明(表 4), 休闲季, pH和NO₃^--N与narG和nosZ基因群落均存在极显著正相关(P < 0..01), 而NO₃^--N和MBN与nirK基因群落存在显著正相关(P < 0..05, P < 0..01).水稻季, narG基因群落与N₂O排放呈极显著正相关(P < 0..01), NH₄⁺-N与nirK和nosZ基因群落均存在极显著正相关(P < 0..01), DOC与nirK基因群落之间呈显著正相关(P < 0..05).

表 4 (Table 4)

表 4 土壤性质、N2O排放与反硝化功能基因群落结构的相关性分析1) Table 4 Spearman's correlations between soil chemical properties as well as cumulative N2O emissions and denitrification microbial community structure determined by Mantel test 季节 功能基因 pH NH4+-N NO3--N DOC DON MBN N2O narG 0.7** 0.2 0.8** -0.2 -0.2 0.2 -0.1 休闲季 nirK 0.2 0.3 0.5* -0.1 0.0 0.6** -0.1 nosZ 0.7** 0.3 0.8** -0.2 -0.2 0.1 -0.1 narG — 0.2 -0.1 0.3 — — 0.6** 水稻季 nirK — 0.7** -0.1 0.3* — — -0.1 nosZ — 0.6** -0.1 0.2 — — 0.3 1) N2O表示休闲季/水稻季的N2O累积排放量

表 4 土壤性质、N2O排放与反硝化功能基因群落结构的相关性分析1) Table 4 Spearman's correlations between soil chemical properties as well as cumulative N2O emissions and denitrification microbial community structure determined by Mantel test

生物质炭添加可改善土壤性质^[23].生物质炭表面含有一定量的碱性物质, 如碳酸盐、有机阴离子等, 故一般呈碱性^[24].有研究表明, 生物质炭添加到土壤中可显著提高土壤pH, 有效降低土壤酸度^[25].在本研究中, 亚热带稻田土壤呈酸性(pH=5.4), 添加生物质炭后, 提高了休闲季土壤pH, 且添加量越大, 效果越好.生物质炭具有发达的孔隙结构和巨大的比表面积^[26], 因而具有较强的吸附性, 可吸附土壤中的营养元素及各种离子(如NH₄⁺和NO₃^-等), 降低土壤中NH₄⁺-N和NO₃^--N含量^[27].在本研究中, 由于生物质炭本身无机氮含量较高(NH₄⁺-N含量为109.9 mg·kg^-1和NO₃^--N含量为3.6 g·kg^-1), 添加到土壤后, 增加了休闲季土壤NH₄⁺-N和NO₃^--N含量, 这与王月玲等^[28]的研究结果一致.但本研究于2012年早稻开始前添加生物质炭, 到2013年晚稻季, 生物质炭本身的无机氮基本被完全消耗或转化, 又由于生物质炭的吸附作用, 导致水稻季生物质炭处理较对照降低了NH₄⁺-N含量.生物质炭添加并没有显著影响休闲季土壤可溶性有机氮含量, 说明增加的无机氮没有向有机氮转化, 而是参与到土壤硝化和反硝化过程中, 或被微生物吸收利用, 转化为微生物生物量氮.生物质炭本身含有易分解的有机质、N、P、K养分及Ca、Mg、Al、Fe等微量元素^[29], 可为土壤微生物生长提供营养, 从而促进其生长、繁殖, 进而增加土壤微生物的生物量^[9].

目前, 关于生物质炭对土壤反硝化作用影响的研究较多, 但结果不一, 至于其作用机制, 研究者的观点也不尽相同^[9].在本研究中, 生物质炭添加增加了稻田休闲季narG基因丰度、水稻季nirK基因丰度及休闲季和水稻季nosZ基因丰度, 改变了nirK、nirS和nosZ基因的群落结构, 这与Anderson等^[14]的研究结果一致, 但与Liu等^[11]的研究结果相反.生物质炭可通过影响土壤理化性质, 如pH、含水率、土壤N的种类(NH₄⁺-N/NO₃^--N)及有效性等, 来影响土壤反硝化微生物^{[14, 30]}.生物质炭可吸附土壤中的NH₄⁺-N和NO₃^--N, 促进NH₄⁺-N向NO₃^--N的转化, 进而影响反硝化微生物的群落组成^[31].在本研究中, 生物质炭添加增加了休闲季土壤NH₄⁺-N和NO₃^--N含量.相关性分析表明, 休闲季NH₄⁺-N与反硝化功能基因丰度呈极显著正相关, 且与NO₃^--N呈显著的正相关, 说明增加的NH₄⁺-N可促进硝化作用, 向NO₃^--N转化, 使得生物质炭处理的NO₃^--N较对照增加了63.0%~176.0%, 进而间接增加narG和nosZ的基因丰度. NO₃^--N可为反硝化微生物提供底物, 休闲季增加的NO₃^--N也间接促进了nosZ的基因丰度的增加, 同时改变了narG、nirK和nosZ的群落结构组成.水稻季中, 生物质炭降低了土壤NH₄⁺-N含量, 相关性分析表明, NH₄⁺-N与nosZ基因丰度呈显著负相关. NH₄⁺-N是硝化作用的底物, 水稻季生物质炭处理NH₄⁺-N含量的降低, 理论上会导致土壤NO₃^--N的减少, 但本研究NO₃^--N含量并未降低, 且参与反硝化作用的narG基因丰度也未降低, nirK和nosZ基因丰度反而增加, 故生物质炭引起的水稻季NH₄⁺-N降低没有引起反硝化作用的减弱, 反而增强, 这可能受其他因素的影响, 需要进一步地研究.土壤NH₄⁺-N与nirK和nosZ的群落结构呈及显著正相关, 这可能是水稻季生物质炭处理的nirK基因中优势种群157 bp代表的菌种相对丰度降低、nosZ基因中优势种群48 bp和51 bp等代表的菌种相对丰度降低的主要原因.因此, 生物质炭可通过改变NH₄⁺-N和NO₃^--N含量影响反硝化微生物的丰度和群落组成.

pH是影响土壤微生物多样性的关键因子^[32].土壤中反硝化作用的最适酸碱范围为6.0~8.0, 当pH为5.6~8.0时, 反硝化速率会随着土壤pH的上升而增大^[9]. Liu等^[33]认为生物质炭的石灰效应为微生物生长提供了适宜的生存环境, 进而提高了反硝化功能基因的丰度.在本研究中, 生物质炭提高了休闲季土壤pH, 促进了nosZ基因丰度的增加, 显著改变了反硝化功能基因narG和nosZ的群落组成, 并以此对反硝化作用产生影响.此外, 2013年晚稻季结束时, 生物质炭处理的pH仍较对照高出0.2~0.7个单位, 故笔者推测生物质炭仍持续提高水稻季pH, 这可能与水稻季nirK和nosZ基因丰度增加有关, 从而影响反硝化作用, 相关内容有待进一步地研究验证.

本试验休闲季采样在2013年4月, 正值梅雨季节, 土壤较为湿润, 2013年晚稻季虽然是在晒田期采样, 但是在排水的第2天, 土壤仍处于淹水状态, 因此, 本研究土壤N₂O排放的主要来源为反硝化作用.生物质炭添加对休闲季N₂O排放无显著影响.生物质炭使narG基因丰度增加和群落结构的变化会促进土壤NO₃^-向NO₂^-的转化, 进而促进反硝化作用.而nosZ基因丰度增加及群落结构的变化又促使N₂O向N₂转化.因此, 本研究生物质炭促进了休闲季土壤反硝化作用, 可降低NO₃^-的淋失, 且能够促进反硝化作用的最后一步反应, 不增加N₂O排放.而在水稻季, HC显著增加了土壤N₂O排放, 这与祁乐等^[34]的研究结果相一致.水稻季LC和HC增加了nosZ的基因丰度, 增加了N₂O向N₂的转化, 促使LC的N₂O排放较对照有小幅度降低, 但HC的N₂O排放不降反增, 说明nosZ基因丰度不是影响休闲季N₂O排放的主要因素. HC显著增加了nirK基因丰度, 而亚硝酸还原酶是反硝化作用的限速酶, 本研究的相关性分析也表明nirK基因丰度与N₂O排放呈显著正相关, 因此, nirK基因丰度增加是导致水稻季HC的N₂O排放增加的重要原因.另外, HC的narG群落结构也与LC和CK处理有较大差异, 如HC增加了77 bp的相对丰度, 而58 bp和156 bp却基本消失, 新增了335 bp和347 bp, 这也是HC增加N₂O排放的一个重要原因.因此, HC通过增加nirK基因丰度和改变narG基因群落, 增加了水稻季N₂O排放.

本研究表明, 生物质炭增加了稻田休闲季土壤pH、NH₄⁺-N、NO₃^--N及MBN含量, 降低了水稻季土壤NH₄⁺-N含量. qPCR及T-RFLP分析表明, 生物质炭添加增加了休闲季narG基因丰度及休闲季和水稻季nosZ基因丰度, HC显著增加了水稻季nirK基因丰度.同时生物质炭改变了休闲季和水稻季narG、nirK和nosZ基因群落结构.生物质炭对反硝化功能基因丰度的影响是通过改变土壤NH₄⁺-N和NO₃^--N来实现的. pH和NO₃^--N是影响休闲季反硝化微生物群落结构的主要因子, 而NH₄⁺-N则是影响水稻季反硝化微生物群落结构的主要因子.生物质炭通过改变土壤理化性质, 改变了反硝化微生物的基因丰度和群落结构, 进而影响N₂O排放.