2019, Vol. 40
2. 中国科学院大学资源与环境学院, 北京 101408;
3. 中国科学技术大学生命科学学院, 合肥 230026
2. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China;
3. School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China
湿地生态系统(wetland ecosystem)是湿地植物、栖息于湿地的动物、微生物及其环境组成的统一整体.由于湿地生态系统兼具水生环境和陆生环境双重特性, 是全球生态和社会价值最高的生态系统[1].湿地的资源丰富性和复杂性, 使其对生态系统平衡、气候调节等方面具有重要意义[2], 因此有“地球之肾”之称.近年来, 由于自然环境条件变化、人类活动扰动或者两者兼而有之, 大面积的湿地退化严重[3].湿地退化主要是指由于人类活动的破坏, 导致湿地一种或多种功能受损、减弱或破坏[4].与自然湿地生态系统相比, 退化湿地系统通常表现出湿地面积减少、物种多样性丧失、生物生产量下降等生态恶化现象[5~7].
在湿地生态系统中, 土壤微生物通过复杂的代谢活动产生能量, 同化营养元素, 是湿地功能的关键承担者, 在元素循环、物质转化、能量流动及生态修复等生态过程中发挥着不可替代的作用[8, 9], 微生物的活动对湿地生态系统的功能是至关重要的[10].有研究表明, 微生物作为湿地生态系统物质循环与转化的重要驱动力, 其群落数量的变化可作为表征生境与生物演变的重要指标[11~14].
目前, 有关我国农田或森林生态系统土壤微生物功能的研究较多, 但是对湿地生态系统的相关研究相对缺乏[15].湿地土壤微生物群落在人类活动的影响下将如何变化, 从而如何影响湿地生态系统结构和功能, 都需要进一步研究.因此探讨土地利用变化导致的湿地土壤微生物群落演替, 对了解湿地土壤质量演变特征及深入探讨湿地生态系统结构和功能, 进而有效保护湿地生态系统具有重要意义.
本文通过选取开垦后改种豆科植物的湿地土壤、水稻田土壤及原始泥炭湿地土壤作为研究对象, 通过高通量测序技术及土壤环境要素相关性分析, 探讨三江平原退化湿地的土壤微生物群落特征, 旨在为阐明湿地退化的生物地球化学过程及其中微生物活动机制提供重要的基础资料和信息依据.
1 材料与方法 1.1 土样采集黑龙江三江平原湿地保护区位于黑龙江及乌苏里江交汇处, 是一个以泥炭沼泽湿地为主要保护对象地自然保护区.泥炭沼泽湿地一般是指有机碳含量大于12%的土壤, 是湿地资源的重要组成部分, 也是陆地生态系统中的重要碳库.本研究所用土壤采集于三江湿地保护区内, 根据不同土地利用方式, 湿地退化程度, 共选取3个采样点, 分别为PW：泥炭湿地土壤(47°29′42″N, 134°25′30″E); SS：种植大豆土壤(48°04′4.08″N, 134°32′06″E); PS：水稻土(47°29′49.20″N, 134°24′39.6″E).于2016年11月, 多点采集各样点表层土壤, 采集到的样品分装于自封袋中, 放于采样箱中运回.采集样点具体信息见图 1. 图 1(a)红点分别代表位于黑龙江抚远三江湿地的3个采样点; 图 1(b)~1(d)为采样点放大示意, 依次为改种豆科植物土壤(SS)、泥炭湿地土壤(PW)、水稻田土(PS).
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图 1 三江湿地保护区及采样点分布示意 Fig. 1 Map of the Sanjiang wetland protection area and distribution of the sampling sites |
分别测定采集土壤样品的pH、总碳、总氮、总磷和含水率5项理化性质.土壤pH使用电位法测定[16], 按水:土比2.5:1的比例配制悬液, 静置30min, 使用校正过的pH计测定悬液的pH值; 总碳采用元素分析法测定; 总氮采用凯氏法测定; 含水率采用烘干法进行测定.以上5项理化性质的测定均按照国标进行.
1.3 土壤DNA提取及测序本研究土壤样品DNA的提取, 采用Fast DNA® SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, USA)试剂盒进行.提取步骤参照试剂盒说明书进行.提取得到的总DNA, 采用(Nanodrop 2000)测定浓度及纯度, 保存于-20℃.细菌16S rRNA基因V3-V4区的扩增采用细菌16S rRNA通用引物[17]341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R：5′-GGACTA CNNGGGTATCTAAT-3′, 合成带有barcode(6个核苷酸)的上述引物进行PCR扩增.反应使用New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer, 和高效高保真酶进行PCR, 确保扩增效率和准确性.得到的产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测, 对目的条带使用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物.根据所扩增的16S区域特点, 基于Illumina HiSeq测序平台, 使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 使用HiSeq2500 PE250进行上机测序.
1.4 测序数据的处理及多样性分析为了使信息分析的结果更加准确、可靠, 首先采用QIIME(V1.7.0, http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)[18]对原始数据(raw data)进行Reads拼接、Tags过滤, 嵌合体去除, 得到有效数据(clean data).将有效序列按照97%的一致性聚类成为OTUs(operational taxonomic units), 并采用SILVA数据库(http://www.arb-silva.de/)[19]对OTUs进行注释.
微生物群落 α多样性采用Chao1丰富度估计量(Chao1 richness estimator)、香农-威纳指数(Shannon-wiener index)来表征[20]. Chao1可反映样本内丰富度, Shannon-Weiner index是综合了物种丰度及物种分布均匀性两方面的多样性指数, 通常Chao1及香农-威纳指数越高, 代表样本内物种多样性越高[21].
1.5 微生物群落组间差异分析使用ADONIS, 一种基于距离矩阵(Bray-Curtis)的非参数多元方差分析方法[22], 对分组的统计学意义进行显著性分析.并采用LEfSe (LDA Effect Size)分析方法寻找组间具有统计学差异的Biomarker[23], 即组间差异显著的物种.
1.6 CCA分析利用vegan软件包在R语言中, 以基于细菌OTU组成及土壤环境因子(PH、总碳、总氮、总磷及含水率)的矩阵进行CCA(canonical correlation analysis)分析[24], 以解析不同湿地利用土壤中细菌群落结构与土壤环境因子间的关系.
2 结果与讨论 2.1 土壤理化性质3种湿地土壤的理化性质如表 1所示.各样本土壤的pH均为中性偏酸, 其中, SS的pH值最低, PS居中, PW则趋近于中性; 改种豆科植物土壤总氮含量明显高于其他两样本, 可能与施肥及豆科植物固氮有关; 与改种豆科植物土壤(平均含水率16.29%)及水稻田土壤(平均含水率17.58%)相比, 泥炭湿地土壤(平均含水率为21.46%)含水率更高.可见, 水分含量是湿地退化的敏感指标, 湿地开垦为农田的土壤含水率明显低于泥炭湿地; 而湿地开垦也会导致土壤pH的降低.由于耕作施肥, SS及PS土壤的总氮、总碳和总磷含量均较PW有所增加.
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表 1 土壤样本基本理化性质1)(平均值±标准偏差) Table 1 Basic physical and chemical properties of soil samples(Mean±SD) |
2.2 微生物群落结构分析
通过Illumina HiSeq测序平台得到的下机数据(Raw PE), 经原始处理后, 结果如表 2所示, 得到有效数据45 080~56 860条, 其中Q20和Q30都在96%以上, 说明获得的数据质量较高, 可用于后续分析.
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表 2 数据预处理统计及质控1) Table 2 Pre-processing statistics and quality control data |
各土壤样品细菌的Chao1和Shannon指数如表 3所示.可见, 水稻田土微生物群落的多样性略高于泥炭湿地和种植大豆土壤.可能是因为水稻田干湿交替, 引起土壤结构、养分供给的变化[25], 好氧与厌氧环境交替频繁[26], 微生物群落多样性较高.而泥炭湿地与种植大豆土壤微生物群落多样性则未见明显差异.
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表 3 样品α多样性1)(平均值±标准偏差) Table 3 Values of α-diversity in bacterial communities of soil samples(Mean±SD) |
由物种注释结果(图 2)可知, 由于土地利用方式发生改变, 微生物优势程度也随之变化.但总的来说, 3种土壤样本中的优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria), 它们可占各样本细菌群落总量的75%以上.这也与已有的土壤微生物群落结构研究结果相符[27, 28].
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图 2 各样本微生物群落结构组成(门水平) Fig. 2 Microbial community composition of different phyla samples |
相比于水稻田土及泥炭湿地土壤样本, 种植大豆的土壤中Proteobacteria门含量较高, 其相对丰度超过40%;而泥炭湿地土壤中Actinobacteria门的相对丰度(约占总量26%)明显高于大豆土壤(约占总量17.5%)和水稻田土(约占总量21%), 主要原因可能是Actinobacteria门细菌通常更喜欢中性偏碱环境, 由于大豆及水稻作物的种植, 造成其土壤理化性质与泥炭湿地产生了较大差异, 尤其是土壤pH明显下降, 因此Actinobacteria门细菌丰度降低.
而在属水平上, 3组样本的微生物群落组成却出现了很大差异.为了对各样本属水平的优势物种组成有更加直观、系统地了解, 本研究根据样品在属水平的物种注释及丰度信息, 选取丰度排名为前35的属, 在物种和样品两个层面进行聚类, 绘制物种丰度聚类热图(图 3), 对样品中的物种类别差异进行全面直观地分析.从图 3可看出, 3种不同利用方式湿地土壤中的细菌群落在属水平上差异明显.大豆土壤Blastocatella、Coxiella(科克斯氏体属)、Rickettsia(立克次氏体属)、Acidothermus(酸热菌属)、Koribacter聚集较多; 水稻田土中Massilia(马赛菌属)、Nitrosomonas(亚硝化单胞菌属)、Bradyrhizobium(慢生根瘤菌属)、Ramlibacter、Anaeromyxobacter(厌氧黏细菌属)等丰度较高; 泥炭湿地中则Rhizomicrobium、Bacillus(芽孢杆菌属)、Arthrobacter、Streptomyces(链霉菌属)、Reyranella等聚集较多. Rhizomicrobium、Bacillus、Arthrobacter属于根际促生菌, 这是一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用, 并能抑制有害生物的有益菌[29]; Massilia和Bradyrhizobium是常见的根际微生物[30], Massilia、Bradyrhizobium和Nitrosomonas在水稻田土中聚集较多, 可能是与水稻田施肥耕作有关[31-32].另外, 有研究表明, Massilia丰度与土壤重金属污染呈正相关关系[33].改种大豆土壤中Coxiella、Rickettsia聚集较多, 则可能是放牧过程中, 牛羊粪便中携带的致病菌污染了原有土壤环境.
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图 3 基于各样品细菌优势属组成的热图 Fig. 3 Cluster heatmap of genus abundance |
以上结果表明, 不同土地利用方式土壤中的优势细菌门没有变化, 但细菌属的组成发生了极大地改变.由于人类活动的扰动, 湿地土壤中有益菌丰度减少, 而致病菌的丰度显著增加.
2.3 各湿地土壤细菌群落差异菌属分析采用Adonis方法对3组样本两两对比, 进行组间差异分析, 结果如表 4所示.从中可见, PW-SS组间差异分析P值为0.001 389, 说明原始泥炭湿地土壤样本与改种豆科植物土壤样本存在显著性差异.
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表 4 Adonis组间差异分析1) Table 4 Adonis analysis |
LDA score大于4的差异物种如图 4所示, 其展示了不同组中丰度差异显著的物种, 柱状图的长度代表差异物种的影响大小(即为LDA score).进化分支如图 5所示, 进化分支图的圆圈由内至外代表了由门至属(种)的分类级别, 不同分类级别上的每一个圆圈代表该水平下的一个分类, 圆圈的直径大小与物种相对丰度大小呈正比：红色表示在PW组中丰度高的物种, 绿色代表在SS组中丰度高的物种.在泥炭湿地土壤中主要差异优势物种为Arthrobacter, 在改种豆科植物土壤中的主要差异优势物种为Coxiella. Coxiella属于致病微生物, 可引发Q热病和斑疹伤寒[34, 35].这可能是由于开垦后人类活动的干扰促进了土壤中有害细菌的增长, 并且会引入新的致病菌.不同土地利用方式会影响土壤微生物群落组成, 由于湿地环境受到人为活动的破坏, 导致有益菌丰度降低, 而有害菌丰度增加, 病原菌丰度增加或许能在一定程度上反映土壤受到人为干扰.
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图 4 差异物种的LDA值分布 Fig. 4 LDA score for different species between groups |
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图 5 差异物种进化分支 Fig. 5 Cladogram of different microbes between two groups |
基于各样品细菌OTU组成及基本性质的CCA分析如图 6所示.可见, pH是影响土壤样品群落结构的主要因素(P=0.002, F=3.309).泥炭湿地样本结构差异与土壤pH及含水率呈正相关, 与总碳、总氮、总磷呈负相关.总磷含量则与改种豆科植物样本及水稻田土样本结构差异呈正相关.湿地水环境条件及土壤pH是影响湿地植物、微生物代谢生长的重要条件, 水分条件及土壤pH的变化必然会导致微生物群落结构的改变.已有研究表明[36], 土壤pH与微生物群落多样性有极好的相关性.因为不同细菌对环境pH要求不同, 即使是环境pH的细微变化, 也会对微生物群落结构产生显著影响.而湿地土壤水分会影响土壤氧化还原电位、氮磷等养分分布, 也是影响土壤微生物群落结构的重要因素之一[37].还有研究表明[38], 在富营养条件下, 磷元素对原有微生物群落的限制作用被大大削减了, 微生物的代谢活动发生变化, 进而可能会改变微生物的种类组成.由此看来, 湿地土壤开垦后改变了土壤pH, 含水率及土壤养分, 从而对微生物群落结构产生影响.
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图 6 微生物群落与环境因子CCA分析 Fig. 6 CCA analysis of bacterial community based on the OTU composition and soil properties |
(1) 三江平原湿地开垦后, 土壤理化性质的改变主要表现为土壤含水率降低, pH下降, 土壤理化性质的改变对土壤微生物群落结构产生了影响.
(2) 水稻田土及改种豆科植物土壤微生物群落组成明显受到人为活动干扰.相较开垦后土壤微生物组成, 泥炭湿地土壤富含Rhizomicrobium、Bacillus、Arthrobacter等种类的根际促生细菌; 而改种豆科植物土壤中Coxiella、Rickettsia两种致病菌的丰度显著增加.
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