2. 重庆市环境科学研究院, 重庆 401147
2. Chongqing Academy of Environmental Science, Chongqing 401147, China
随着规模化养猪场的迅速发展, 排放量不断增加的富含有机质、N、P等营养物及致病菌等污染物的猪场沼液会带来严重的健康和环境危害[1~3].猪场沼液普遍特征为高氨氮(NH4+-N≥200 mg·L-1)、低碳氮比(C/N < 3), 其带来的两大处理技术难点为:高氨氮具有生物毒性, 抑制微生物生长; 沼液有机物浓度较低, 可生化性差, 导致C/N失调, 不能为微生物提供充足的碳源, 使得废水脱氮效果差[4, 5].为提高沼液的NH4+-N去除效率, 当前研究主要采用以下几种方式:采用氨吹脱法[6]、磷酸铵镁结晶法[7]等物化方法大幅度降低沼液中NH4+-N浓度; 添加原水或补加碳源调整碳氮比[8]; 用臭氧氧化和微电解[9, 10]等方法提高沼液可生化性能.虽然上述方法可有效降低沼液中的NH4+-N浓度, 提高其C/N及可生化性, 但以上方式存在工艺复杂且后续处理成本提高等实际问题.部分研究人员采用CANNON等新型脱氮工艺处理猪场沼液[11], 虽然该工艺在低C/N条件下可对高氨氮取得较好的去除效果, 但由于启动时间太长(210 d), 限期了其工程化应用.因此, 开发新型工艺高效处理猪场沼液势在必行.
生物接触氧化(biological contact oxidation, BCO)工艺由于对高氨氮具有一定的耐受性、抗冲击负荷能力强等特点[12], 被广泛应用于处理畜禽养殖沼液等低碳氮比有机废水[13, 14], 但受碳源不足, NH4+-N浓度高的影响, 脱氮及有机物去除效果不理想[15].鉴于此, 本研究采用课题组前期筛选的异养硝化-好氧反硝化菌(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HN-AD)对BCO工艺进行生物强化, 前期研究发现, 该HN-AD菌能高效处理低碳氮比高氨氮废水.采用HN-AD菌生物强化的BCO工艺用于猪场沼液的脱氮处理, 借助BCO内载体较大的比表面积实现菌剂的固定, 并在好氧环境下, 通过运行条件优化实现系统内功能菌的富集和优势化构建, 强化氨氮和有机物的去除.前期研究表明HN-AD菌可耐高氨氮且Yang等[16]和Ren等[17]发现在低C/N条件下也能高效脱氮, 打破了人们对HN-AD菌只有在高碳氮比条件下才能获得高效脱氮的固有观念.此外, 采用生物强化的BCO工艺启动时间短、工艺流程简单(一个反应器同时实现有机物和“三氮”的同步去除), 有望成为经济、简洁、高效的新型生物脱氮工艺.
目前, 国内外HN-AD菌的工程化应用较少, 以HN-AD菌生物强化的BCO工艺进行猪场沼液处理的研究更是鲜见报道[18].本研究采用逐步增大NH4+-N负荷的策略启动BCO工艺, 稳定运行后接种HN-AD菌剂对BCO进行生物强化, 启动生物强化的BCO工艺后, 通过高通量测序技术分析生物强化前后微生物多样性的变化规律, 并结合扫描电镜(SEM)考察了填料表面生物膜的微观形态.同时考察了生物强化的BCO工艺对猪场沼液的实际脱氮效果, 以期为该技术的优化和实际应用提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 BCO系统实验装置BCO工艺流程图如图 1所示.系统中采用10 mm厚的长方体有机玻璃池体作为生物接触氧化池的主体, 池长500 mm, 池宽300 mm, 池高850 mm, 反应器有效容积为90 L. BCO工艺采用上流式进水、曝气、停留、出水的间歇循环运行方式.
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1.调节池; 2.进水泵; 3.液体流量计; 4.进气泵; 5.气体流量计; 6.微孔曝气头; 7.组合软性填料; 8.出水口; 9.取样口; 10.出水箱 图 1 BCO工艺流程示意 Fig. 1 BCO process flow chart |
生物接触氧化池内所用载体为PAN活性炭纤维填料, 购置于南通森友炭纤维有限公司, 其主要技术参数如表 1所示[19].填料层在BCO系统中的填充高度为750 mm.
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表 1 PAN活性炭纤维填料主要技术参数 Table 1 Main technical parameters of PAN activated carbon fiber packing |
在启动前期向反应器中接种取自重庆巴南区某生活污水处理厂曝气池中的活性污泥, 污泥浓度为5 887 mg·L-1.
实验用水分为人工配水和猪场沼液原水.在反应器启动运行阶段的模拟废水中, COD浓度为400~2 500 mg·L-1, NH4+-N浓度为80~500 mg·L-1.其COD:TN=(5~8):1, 以无水乙酸钠为碳源, 以硫酸铵为氮源, 以磷酸氢二钾为磷源, 同时添加微量元素以保证菌液的正常生长, 其中微量元素成分为:MgSO4·7H2O 2 g·L-1、MnSO4·H2O 0.1 g·L-1、CaCl2 1.5 g·L-1、FeSO4·7H2O 0.1 g·L-1.在处理过滤后的猪场沼液阶段, 沼液中的COD、NH4+-N和TN的平均浓度分别为855.4、314.8和466.7 mg·L-1.
1.3 实验方法初期向BCO反应器中接种15 g·L-1的活性污泥.连续闷曝2 d后, 采取间歇进水并逐渐提高进水NH4+-N浓度方式启动反应器. NH4+-N浓度梯度分别为80、100、160、300、400和500 mg·L-1, 经过90 d的活性污泥驯化培养后, 向反应器中接种课题组前期从养猪废水中分离筛选得到具有耐高NH4+-N、耐高COD、生长周期短和易于培养等性能的HN-AD菌剂, 同时添加营养物质以供菌剂生长.在经HN-AD菌生物强化的BCO系统间歇运行12 d后, 对系统及时采取排泥措施.启动过程中通过实时监测废水中有机物和含氮污染物的去除率及对填料表面的微生物进行显微镜检测.在BCO系统分别经活性污泥驯化和HN-AD菌剂生物强化前后, 选取填料上的生物膜样品提取DNA后进行多样性测序分析.同时对原始填料和HN-AD菌生物强化后BCO系统中的填料进行扫描电镜表征分析.待经HN-AD菌生物强化后的BCO系统启动成功并稳定运行后, 用该反应器序批式处理重庆市巴南区某生猪养殖场沼液, 运行参数与启动运行时保持一致.
1.4 分析方法本实验的水质指标均采用国家规定的标准方法测定[20], DO使用HQ-30d便携式溶解氧测定仪直接检测; COD指标使用LH-16K型标准化学需氧量消解仪, 采用重铬酸钾法测定; NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法、NO3--N采用酚二磺酸分光光度法测定; TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定.
填料表面上的生物样品先采用冷冻干燥做脱水预处理[21], 然后采用TESCAN MIRA3热场发射扫描电镜观察生物膜表面微观形态结构. DNA提取和高通量测序分别选取污泥挂膜和菌剂生物强化后的生物样品, 离心弃去上清液后于-80℃保藏用于多样性测序分析.用购自天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TANamp Bacteria DNA Kit)提取样品的基因组DNA[22]. MiSeq平台对16S rRNA基因高变区序列进行测序, 测序区域选择V3+V4区, 测序片段为468 bp, 测序引物为338F-806R, 使用Trimmomatic、FLASH软件对MiSeq测序数据进行处理获得干净数据.在Usearch软件平台中使用uparse方法将序列按照彼此相似性为97%分归为许多小组, 一个小组为一个OTU, 从而得到OTU的代表序列.然后, 使用uchime检测PCR扩增中产生的嵌合体序列并从OTU中去除, 再用usearch_global方法将优化序列map比对回OTU代表序列, 最终得到OTU各样品序列丰度统计表[23], 相关性利用SPSS Statistics 21软件分析, 多样性数据采用i-sanger平台(http://www.i-sanger.com/)分析.
2 结果与讨论 2.1 驯化阶段BCO工艺对有机物及含氮污染物的去除效果如图 2所示, 向反应器中接种好氧污泥后, 以模拟废水通过逐渐提高NH4+-N和COD浓度驯化生物接触氧化系统.驯化过程中C/N保持为5, NH4+-N浓度从80 mg·L-1提高至500 mg·L-1.如图 2, 在提高NH4+-N浓度驯化系统过程中, 在梯度NH4+-N浓度下, 系统的去除率均呈现升高的趋势. NH4+-N浓度从80 mg·L-1升至400 mg·L-1阶段, 经过75 d的驯化之后, 72 h内NH4+-N、NO3--N、TN和COD的平均去除率分别为84.3%、30.0%、70.7%和89.6%, 但在高氨氮(>500 mg·L-1)条件下, 由于生活废水处理工艺中的活性污泥耐氨氮能力较差, 高浓度氨氮对活性污泥产生高毒性, 系统中微生物的生长受到严重抑制, 导致去除率出现下降且波动幅度较大.由此可见, 需要对生物接触氧化池进行生物强化, 使得系统中的微生物能耐受高浓度氨氮, 从而实现高效处理高氨氮猪场沼液.
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图 2 BCO工艺驯化过程对NH4+-N、NO3--N、TN和COD去除率的变化情况 Fig. 2 Changes in removal rates of NH4+-N, NO3--N, TN, and COD upon adoption of the BCO process |
为了提高生物接触氧化池系统对高浓度氨氮的处理效率, 向反应器中接种HN-AD菌, 菌剂通过在BCO填料上的负载及固定, 并在好氧环境下, 通过观察填料表面生物膜的生长变化, 及时采取排泥措施以实现污染物的高效稳定去除, 最终优化运行参数实现HN-AD菌剂在BCO反应器中的富集与优势化构建, 达到以HN-AD菌剂生物强化加强NH4+-N和COD的去除.
如图 3所示, 当在第90 d高氨氮驯化后接种HN-AD菌剂, 反应器内的污染物去除率均缓慢回升, 在接种菌剂后的12 d内, 系统72 h的去除率逐渐上升, 其中NH4+-N、NO3--N、TN和COD的平均去除率分别从接种前的60.5%、30.5%、44.5%和67.3%升高至接种后的79.0%、49.9%、63.0%和73.5%.同时在接种后12 d时观察到反应器底部沉积了较多的污泥及从填料上脱落的大量生物膜, 为了抑制沉积污泥对反应器系统的影响, 对生物强化后的BCO系统及时排泥.系统排泥后, 系统NH4+-N、NO3--N、TN和COD的去除率分别上升至90.2%、43.5%、80.5%和83.2%, 污染物去除效果均较明显且能保持污染物高效稳定去除.
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图 3 HN-AD菌剂生物强化对BCO工艺处理性能的影响 Fig. 3 Effect of biological enhancement of HN-AD microbial agents on the treatment performance of BCO process |
在经过接种污泥驯化和生物强化阶段后, 向BCO反应器系统内序批式通入重庆市巴南区某生猪养殖场沼液, 连续观察30 d, 其对NH4+-N、NO3--N、TN、COD的处理效果如图 4所示, 在HRT=24 h条件下, 沼液中NH4+-N、NO3--N、TN和COD的平均浓度可分别从314.8、143.5、466.7和855.4 mg·L-1降低至41.3、76.1、137.7和218. 4 mg·L-1.其平均去除率可分别保持稳定在86.9%、47.0%、70.5%和74.4%, 可在很大程度上实现污染物浓度的削减.出水浓度均低于《畜禽养殖业污染物排放标准》(GB 18596-2001)[24]限值(COD≤400 mg·L-1和NH4+-N≤80 mg·L-1).
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图 4 BCO工艺处理猪场沼液效果 Fig. 4 BCO process treatment of pig farm biogas slurry |
对系统进行污泥驯化和HN-AD菌生物强化前后的微生物群落结构进行了多样性分析, 结果如图 5所示.在污泥驯化过程中, 通过不断提高氨氮浓度, 系统中微生物多样性发生一定的变化, 接种污泥中的HN-AD菌为Thauera 18.4%、Diaphorobacter 9.1%、Nitrosomonas 2.4%[25]和Pseudomonas 1.0%[26], 在对污泥进行驯化后, 由于高氨氮的抑制作用, 系统内的主要HN-AD菌变为Diaphorobacter 2.6%、Thauera 0.7%和Acinetobacter 1.7%[17], 可见, 高浓度氨氮对活性污泥系统中的优势菌具有毒性作用, 活性污泥中属于HN-AD菌的Thauera和Diaphorobacter相对丰度急剧减少且部分硝化菌出现消亡, 同时伴随着其他新的HN-AD菌如Acinetobacter的出现, 同时结合图 2可知, 随着污泥驯化过程的继续, 系统内污染物的去除率随之得到缓慢提升, 驯化后新出现的HN-AD菌逐渐成为系统内的优势菌.
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图 5 HN-AD菌剂生物强化后微生物群落结构对比 Fig. 5 Comparison of microbial community structure after bio-enhancement of HN-AD microbial agents |
当驯化氨氮浓度为500 mg·L-1时, 污染物去除率出现急剧下降的趋势, 此时向反应器中接种HN-AD菌剂对BCO系统进行生物强化, 接种菌剂中的主要HN-AD菌为Alcaligenes 55.6%[27]、Myroides 6.5%[28, 29]、Acholeplasma 6.1%[30]和Acinetobacter 1.3%[31], 经过HN-AD菌剂的生物强化后, 系统内主要的HN-AD菌分别为Diaphorobacter 10.3%、Thauera 3.6%和Acinetobacter 2.2%, 生物强化后系统优势菌由接种菌剂中的Alcaligenes变为生物强化后的Diaphorobacter和Thauera, 而Acinetobacter的相对丰度明显高于接种菌剂.国内外研究表明, 上述菌属均为HN-AD菌.其中Zhang等[32]发现Diaphorobacter菌属为HN-AD菌, 孙英杰等[33]和Yang等[16]也证明了Thauera菌属和Acinetobacter菌属均为HN-AD菌, 且都在系统中发挥了主要的异养硝化与好氧反硝化作用.
2.5 BCO系统生物强化后的SEM表征分析接种HN-AD菌剂前后填料表面的SEM表征如图 6所示, 在原始填料上[图 6(a)]可明显看到整齐排列的细丝状填料, 每根填料上呈凹凸交替的沟状条纹, 此结构增大了填料表面的比表面积和吸附性能, 使大量微生物能在填料上固定生长.接种HN-AD菌剂后填料表面的微观结构如图 6(b), 在具有异养硝化-好氧反硝化功能的HN-AD菌固定在填料上后, 可在填料表面形成比表面积较大的生物膜层, 生物膜层通过局部放大后, 明显可见较多的杆状菌和球状菌在填料表面富集.结合图 5分析, 接种HN-AD菌剂生物强化后, 填料表面形成紧密相连且牢固的生物膜层, 局部放大图也进一步显示, 生物膜层中的HN-AD菌主要以杆状菌和球状菌为主.结合图 5进一步推测填料表面的杆状菌和球状菌为系统生物强化后的HN-AD优势菌, 主要为Diaphorobacter、Thauera和Acinetobacter, 成功实现了系统内优势菌的富集和优势化构建.
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图 6 原始填料与生物强化后BCO系统中填料的SEM对比 Fig. 6 SEM comparison of the original filler and the filler in the BCO system after bio-enhancement |
(1) 投加HN-AD菌剂对BCO进行生物强化, 仅需12 d BCO系统实现稳定、高效运行.
(2) 高氨氮(>500 mg·L-1)养殖废水对BCO系统具有抑制作用. HN-AD菌生物强化可显著提高BCO系统耐高氨氮性能及脱氮效果.
(3) HN-AD菌生物强化BCO工艺对真实猪场沼液中的NH4+-N(86.9%)、TN(70.5%)和COD(74.4%)具有高效去除效果, 出水浓度均低于《畜禽养殖业污染物排放标准》限值.
(4) 高通量测序结果表明, 生物强化后实现了系统内HN-AD菌的富集且HN-AD菌优势化构建明显. SEM观察结果也进一步证实, BCO工艺生物强化后, 填料上的优势菌主要以杆状和球状的HN-AD菌为主.
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