2019, Vol. 40
厌氧氨氧化是厌氧氨氧化菌以NO2--N为电子受体、NH4+-N为电子供体, 将NO2--N和NH4+-N转化为N2的过程[1].与传统的硝化-反硝化脱氮工艺相比, 厌氧氨氧化工艺具有不需要外加碳源, 能耗低, 污泥产量低等优点[2, 3].然而, 由于厌氧氨氧化菌生长缓慢、易受环境影响等缺点在一定程度上限制了厌氧氨氧化工艺的应用[4, 5].厌氧氨氧化颗粒污泥由于具有可持留大量生物量、沉降性能好、抗冲击能力强等诸多优点而受到学者的广泛关注[6, 7].
胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)是指特定环境条件下细菌代谢分泌的、包裹在细胞壁外的高分子聚合物, 主要由蛋白质(protein, PN)和多糖(polysaccharide, PS)构成[8]. EPS中的PN和PS极大地影响着细菌表面电荷、疏水性及聚集体空间结构[9, 10]. EPS的物理化学性质和特殊位置使其成为维持颗粒污泥结构和功能的重要部分[10, 11]. Chen等[12]的研究发现, 与活性污泥、硝化污泥、反硝化污泥相比, 厌氧氨氧化污泥能够产生更多的EPS.陈方敏等[13]的研究发现, 厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中PN/PS与颗粒污泥的稳定性相关. Hou等[14]比较了厌氧氨氧化污泥、传统活性污泥、硝化污泥、反硝化污泥的聚集能力, 结果表明厌氧氨氧化污泥EPS中较多的疏水性官能团导致其具有较强的聚集能力. Jia等[15]的研究结果表明, 厌氧氨氧化污泥EPS具有较强的黏性, 容易形成凝胶网状结构而促进污泥的聚集.
目前国内外有关厌氧氨氧化污泥EPS的研究主要集中在EPS组成及特征的分析, 鲜见学者关注不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS特性及其对颗粒污泥表面特性的影响.反应器持续运行过程中, 小粒径颗粒污泥逐渐变成大粒径颗粒污泥, 探究不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS特性及其对颗粒污泥表面特性的影响, 有助于进一步理解厌氧氨氧化颗粒污泥的聚集机制.本文研究了厌氧氨氧化EGSB反应器中不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS组成及官能团特征, 探讨了EPS提取前后厌氧氨氧化聚集体表面亲疏水性、Zeta电位的变化, 分析了EPS对厌氧氨氧化颗粒污泥聚集机制的影响, 以期为厌氧氨氧化颗粒污泥的形成及稳定运行提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 反应器及颗粒污泥厌氧氨氧化颗粒污泥取自实验室长期稳定运行的厌氧氨氧化EGSB反应器.反应器进水和回流水经蠕动泵由底部进入反应器, 回流比为25:1, 反应器上升流速为4.42 m·h-1.反应器进水氨氮和亚硝氮浓度分别约为180 mg·L-1和190 mg·L-1, 总氮负荷为2.39 kg·(m3·d)-1.反应器温度控制在(32±1)℃, 进水pH值为7.8~8.0.
取厌氧氨氧化颗粒污泥拍照后, 采用Nano Measurer 1.2软件分析颗粒污泥粒径分布.反应器中99%以上的颗粒污泥粒径大于0.5 mm, 所以本试验主要分析了粒径大于0.5 mm的颗粒污泥.经过35、14和7目筛子筛分, 将颗粒污泥分为3组：R1组粒径为0.5~1.4 mm, R2组粒径为1.4~2.8 mm, R3组粒径为>2.8 mm.
1.2 EPS提取与测试采用热提取法提取EPS[16].将颗粒污泥样品用纯水清洗3次, 转移至50 mL离心管中, 加入20 mL纯水, 在80℃下加热10 min, 8 000g离心20 min.吸取上清液用0.45 μm滤膜过滤, 滤液即为EPS提取液, 保存在-20℃备用.采用快速Lowry法蛋白质试剂盒测定EPS中蛋白质含量, 采用蒽酮硫酸比色法测定EPS中多糖含量, 采用标准重量法测定挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)[17], EPS中蛋白和多糖以每克VSS中的蛋白和多糖含量计.
1.3 红外光谱和三维荧光光谱在-35℃下冷冻干燥EPS提取液.将制备的样品粉末与KBr粉末混合, 用FTIR光谱仪(Tensor 27, Bruker, Germany)测定红外光谱.使用软件PeakFit 4.12分析红外光谱酰胺Ⅰ区域, 确定蛋白质二级结构及相对含量.酰胺Ⅰ(1 700~1 600 cm-1)谱带的二阶导数经15%平滑和高斯函数拟合, 得到若干亚峰, 多次拟合直到r2≥0.999, 通过峰位置和峰面积确定蛋白质二级结构及相对含量.
取3 mL左右的EPS样品, 使用荧光光度计(F-7000 FL, 日本日立)测定EPS荧光光谱, 用纯水作为空白校正水的拉曼散射.以5 nm为采样间隔, 改变200~400 nm间的激发波长; 以5 nm为增量, 连续扫描220~500 nm发射光谱, 扫描速度为3 000 nm·min-1.采用Origin 8.0绘制三维荧光光谱图.
1.4 Zeta电位和疏水性将颗粒污泥碾碎, 匀浆成污泥悬浮液备用.污泥Zeta电位采用纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS90, 英国马尔文)测定.污泥表面疏水性采用基于正十二烷-水系统的微生物黏附烷烃试验测定[18], 首先将污泥悬浮液的D546调整到0.3左右, 取4 mL悬浮液与1 mL正十二烷在比色管中充分混合, 经涡旋振荡器全速振荡2 min, 随后静置15 min以保证相分离.部分污泥悬浮液被吸附到了烷烃相, 取水相测定D546.试验重复3次, 采用式(1)计算污泥疏水度.
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(1) |
式中, D546为悬浮液在546 nm波长处的吸光值.
2 结果与讨论 2.1 反应器性能及颗粒污泥特征厌氧氨氧化EGSB反应器已运行超过200 d, 脱氮性能保持稳定.颗粒污泥取样阶段, 反应器NH4+-N, NO2--N和TN的平均去除率分别为94.3%±1.2%、97.5%±1.7%和87.2%±2.1%.
不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥照片及颗粒污泥粒径分布如图 1所示.反应器中颗粒污泥平均粒径为2.71 mm. 99%以上的颗粒污泥粒径大于0.5 mm, 并以2.5~3 mm粒径范围为中心, 随着粒径的增大或减小, 颗粒污泥的数量均呈现逐渐减少的趋势, 粒径分布大致呈正态分布.
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图 1 不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥照片及粒径分布 Fig. 1 Photographs with different particle sizes and particle size distribution of ANAMMOX granular sludge |
如图 1(a)~1(c)所示, 厌氧氨氧化颗粒污泥形状规则, 轮廓呈椭球状, 颜色为“铁红色”, 结构较为密实.随厌氧氨氧化颗粒污泥粒径的增大, 厌氧氨氧化菌的“铁红色”特征越来越明显, 这与厌氧氨氧化菌血红色素含量的增多有关[19, 20].
2.2 厌氧氨氧化颗粒污泥EPS组分及含量分析EPS在厌氧氨氧化颗粒污泥形成过程中具有重要的作用[14, 15].在厌氧氨氧化污泥颗粒化过程中, 微生物分泌大量的EPS促进细胞凝聚而形成颗粒污泥.不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量如表 1所示.
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表 1 不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS组分及含量 Table 1 EPS composition and content of ANAMMOX granular sludge with different particle sizes |
由表 1可知, PN是厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中的主要成分, 占EPS含量(以每g VSS中的EPS含量计, 下同)的84%以上, 这与陈方敏等[13]得到的研究结果是相似的.随着厌氧氨氧化颗粒污泥粒径的增大, PS含量只有轻微的变化, 介于(10.69±0.11)~(12.28±0.15) mg·g-1之间, 而PN含量从(56.88±0.86) mg·g-1增加到(98.59±2.10)mg·g-1, EPS总量从(68.05±0.97) mg·g-1增加到(94.26±2.20) mg·g-1, PN/PS从5.32提高到9.05.
从结果可知, EPS的含量与厌氧氨氧化颗粒污泥的粒径大小呈正相关关系, 这表明较大的颗粒污泥会分泌更多的EPS.文献[14, 21]指出, 较多的EPS含量有利于厌氧氨氧化菌细胞间的互相聚集及细胞交流.随着粒径的增加, PN含量和PN/PS都增大, 这表明蛋白质在厌氧氨氧化颗粒污泥颗粒化过程中起着关键作用. Yan等[22]对比了不同粒径好氧颗粒污泥EPS中蛋白质和多糖的组成, 发现了相同的规律. PS属于亲水性物质, PN属于疏水性物质, 两种物质的含量和比例影响颗粒污泥的表面疏水性[8], 污泥表面疏水性的增强是聚集体颗粒化过程的触发力[23].因此, PN/PS的提高可以增强污泥的相对疏水性, 从而促进厌氧氨氧颗粒污泥的聚集.
2.3 表面官能团特征分析 2.3.1 红外光谱红外光谱可表征厌氧氨氧化颗粒污泥EPS官能团组成特征, 不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS红外光谱如图 2(a)所示.红外光谱中, 波数为3 278 cm-1处的振动主要代表O—H伸缩振动[22], 2 961 cm-1处代表着烷烃有机物和多糖分子中的C—H伸缩振动[15], 1 636 cm-1附近为蛋白质酰胺Ⅰ的C=O伸缩振动[22], 1 562 cm-1附近为酰胺Ⅱ的N—H变形振动[22], 1 454 cm-1附近主要为蛋白质结构中的C—OH、CH3、CH2变形振动[24], 1 340 cm-1处主要代表了和氨基酸相关的C—O和C—H伸缩振动[24], 1 243 cm-1处为蛋白质酰胺Ⅲ处C—N伸缩振动[22], 1 076 cm-1附近主要代表多糖糖苷键C—O—C伸缩振动[15], 1 045 cm-1附近处的振动代表了磷酸化蛋白和醇类物质的存在[22, 24].红外光谱的结果表明了厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中存在蛋白质、多糖、醇类等物质.
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图 2 不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS红外光谱及蛋白质二级结构分峰 Fig. 2 Infrared spectrum and peaking diagram of protein secondary structure of EPS in ANAMMOX granular sludge with different particle sizes |
随着颗粒污泥粒径增大, 1 636、1 563和1 454 cm-1处的波峰强度逐渐增大, 表明蛋白质酰胺Ⅰ的C=O伸缩振动、酰胺Ⅱ的N—H变形振动和蛋白质结构中的C—OH、CH3、CH2变形振动增强, 这种变化与EPS中PN的含量变化相一致.而1 076 cm-1和1 045 cm-1处的波峰强度逐渐减小, 表明糖苷键C—O—C含量、磷酸化蛋白、醇类物质的含量随着颗粒污泥粒径的增大而减小.这些结果表明不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中官能团含量不同.
EPS蛋白质二级结构的组成特征影响着微生物聚集体的结构和性能[14, 15], 而红外光谱酰胺Ⅰ区域常被用于蛋白质二级结构的研究[24, 25].为进一步分析不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中蛋白质二级结构的不同, 对红外光谱酰胺Ⅰ区域进行分峰处理, 根据模型肽段和具有已知蛋白结构的光谱数据确定蛋白质二级结构[26, 27].分峰结果如图 2所示, 蛋白质二级结构的相对含量在表 2中显示.结果表明厌氧氨氧化颗粒污泥EPS酰胺Ⅰ中含有聚合链(1 625~1 610 cm-1), β-折叠(1 640~1 630 cm-1), α-螺旋(1 657~1 648 cm-1), 3-转动螺旋(1 666~1 659 cm-1)和反平行β-折叠/聚合链(1 695~1 680 cm-1)这5种蛋白质二级结构, 无规卷曲(1 645~1 640 cm-1)在结果中没有发现. β-折叠是厌氧氨氧化颗粒物污泥EPS中最主要的蛋白质二级结构, 其含量约占总蛋白质二级结构含量的40%.
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表 2 不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中蛋白质二级结构相对含量1) Table 2 Relative contents of protein secondary structure of EPS in ANAMMOX granular sludge with different particle sizes |
随着颗粒污泥粒径的增大, 颗粒污泥EPS中蛋白质二级结构的相对含量发生了变化.蛋白质二级结构相对含量与污泥的疏水性相关.当α-螺旋含量低, β-折叠和无规卷曲含量高时, 蛋白质分子具有更松散的结构, 内部疏水基团可以更充分暴露出来, 分子内疏水位点的暴露将导致微生物表面强的疏水性[14]. α-螺旋/(β-折叠+无规卷曲)比值常被用于表征蛋白质二级结构的组成特征[14, 15].随着颗粒污泥粒径的增大, 该值从0.60逐渐降低到0.43.该结果表明随着厌氧氨氧化颗粒污泥粒径的增加, 厌氧氨氧化污泥EPS中的疏水性蛋白质二级结构含量增加, 这种变化使得疏水基团更容易表达其疏水性质, 从而促进颗粒污泥的聚集.
2.3.2 荧光光谱分析图 3为不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥中EPS组分的三维荧光光谱图, 表 3总结了各EPS组分三维荧光光谱参数.
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图 3 不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS三维荧光光谱 Fig. 3 Three-dimensional fluorescence spectrum of EPS in ANAMMOX granular sludge with different particle sizes |
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表 3 不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS三维荧光光谱参数 Table 3 Parameters of three-dimensional fluorescence spectrum of EPS in ANAMMOX granular sludge with different particle sizes |
由图 3可知, EPS组分中有3个明显的三维荧光光谱峰.根据文献[28, 29]确定三维荧光光谱峰, 峰A的激发/发射波长Ex/Em位于275/335~345 nm, 指定为色氨酸蛋白类物质; 峰B的Ex/Em位于220/325~345 nm, 指定为芳香族蛋白类物质; C峰的Ex/Em位于225/305~310 nm, 指定为酪氨酸蛋白类物质.由表 3可知, 随着粒径的增大, A、B、C峰的强度都有一定程度提升, 这主要是因为粒径的增大, EPS中蛋白质组分含量增加.同时, 峰A的发射波长发生蓝移, 峰B和峰C的发射波长先发生蓝移, 再发生红移.荧光峰的蓝移表明链结构中的芳环和共轭键等官能团含量的减少, 荧光峰的红移表明荧光基团中羰基、羧基、羟基和胺基含量有所增加[28].此外随着粒径的增大, A/C的比值逐渐增大, 且R2和R3中A/B峰的比值明显大于R1.三维荧光基团的变化可以提供污泥EPS样品化学结构变化的光谱信息, 这些结果表明EPS荧光组分的变化与厌氧氨氧化聚集体聚集过程有关, 而这种关系与规律需要进一步的研究.
2.4 EPS对厌氧氨氧化颗粒污泥表面特性的影响EPS覆盖在微生物表面可以改变微生物聚集体的表面特性如亲疏水性、Zeta电位等, 进而影响微生物的聚集和颗粒污泥的稳定性.为了进一步探究EPS对厌氧氨氧化颗粒污泥表面特性的影响, 分析了EPS提取前后厌氧氨氧化聚集体疏水性和Zeta电位的变化. 图 4(a)是不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS提取前后表面疏水性的变化.
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图 4 EPS提取前后厌氧氨氧化聚集体表面特性的变化 Fig. 4 Changes in surface characteristics of ANAMMOX aggregates before and after EPS extraction |
由图 4(a)可知, R1、R2和R3颗粒污泥在EPS提取前的表面疏水度分别为54.2%、59.5%和63.1%.随着颗粒污泥粒径的增大, 厌氧氨氧化聚集体表面疏水性增强.从前文分析可知, PN/PS组成和疏水性蛋白质二级结构的变化导致了污泥表面疏水性增强, 这进一步证明了蛋白质在厌氧氨氧化颗粒污泥聚集中的重要作用.颗粒污泥EPS去除之后, 3组不同粒径颗粒污泥的表面疏水性均有一定程度的下降, 这表明EPS的存在影响了厌氧氨氧化聚集体的疏水性.厌氧氨氧化污泥EPS中具有含量较高的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸等物质[14], EPS中的疏水性组分可以增强厌氧氨氧化污泥表面疏水性.
图 4(b)是不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥EPS提取前后Zeta电位的变化. R1、R2和R3颗粒污泥在EPS提取前的Zeta电位分别是-41.2、-36.7和-31.5 mV.随着颗粒污泥粒径越大, 颗粒之间的排斥力越小, 有利于颗粒之间的聚集.颗粒污泥EPS提取以后, 3组不同粒径颗粒污泥的Zeta电位有所降低.表明聚集体EPS去除以后, 聚集体表面负电荷的相互排斥力增加, 增强了聚集体表面的电负性. EPS中带正电荷的蛋白质(如含有较多赖氨酸和精氨酸的贻贝蛋白), 常具有较高的等电点, 可通过静电作用促进细胞或菌胶团(一般带负电荷)间的吸引和接触, 从而促进了污泥的聚集[30, 31].同时, 蛋白质可通过螯合作用和离子键与金属离子发生反应, 该反应将压缩双电层并增大Zeta电位, 这有利于微生物细胞之间的聚集[32].
以上分析表明, 厌氧氨氧化颗粒污泥EPS的存在影响了污泥的疏水性和表面电荷, 进而影响颗粒污泥的聚集能力.随着颗粒污泥粒径的增大, PS含量一直维持在较低的含量, 而PN含量不断增加, PN、PN/PS的变化与颗粒污泥表面疏水度和Zeta电位均呈现一定的正相关, 这进一步证明了厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中的PN影响着聚集体表面疏水性和表面电荷, 进而影响污泥的聚集能力.随着颗粒污泥粒径的增加, 厌氧氨氧化颗粒污泥的表面疏水性增加, 疏水性的增加将增强聚集体疏水性作用力.疏水性作用力是颗粒污泥发生聚集的重要作用力之一, 在颗粒污泥形成的初期其作用尤其重要[3].污泥表面Zeta电位也随着粒径的增大而变大, Zeta电位的变化将会增强微生物之间的压缩双电层作用.这些结果表明疏水性作用和压缩双电层作用均作用于厌氧氨氧化颗粒污泥的聚集.
3 结论(1) PN是厌氧氨氧化颗粒污泥EPS的主要成分, EPS中PN含量和PN/PS随着颗粒污泥粒径的增大而提高.
(2) 厌氧氨氧化颗粒污泥粒径不同, EPS官能团及三维荧光组分含量不同.厌氧氨氧化颗粒污泥EPS中含有5种蛋白质二级结构, 随着粒径的增加, 蛋白质二级结构相对含量的变化有利于颗粒污泥的聚集.
(3) 随着厌氧氨氧化颗粒污泥粒径的增大, 污泥表面疏水性和Zeta电位的变化有利于污泥的聚集.厌氧氨氧化颗粒污泥EPS可以增强污泥疏水性、降低污泥表面的负电排斥力. EPS中的PN影响了污泥疏水性和Zeta电位.
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