2019, Vol. 40
微生物电合成系统(microbial electrosynthesis systems, MESs)是利用电活性微生物作为催化剂在阴极表面获得电子, 将二氧化碳(CO2)还原成有机化合物的一种新型微生物技术[1, 2].这一过程既能减缓温室效应, 也能解决能源紧缺问题, 引起了广泛关注.
但是, MESs合成乙酸的效率远低于工业界的要求[3~8].目前提高其合成效率主要有以下4点思路：①优化基质, 如在基质中添加钨酸盐[9]; ②改进反应器设计[10, 11]; ③改进运行条件, 如改变基质的pH值、外加电压/电势[11]; ④优化接种液, 如使用富集产乙酸菌群的接种液[12]; ⑤电极材料表面改性等等.其中电极材料表面改性是最为常见的思路.一般而言, 电极材料表面改性的方法总结如下：①化学浸泡或加热等预处理[13]; ②高导电性或高生物亲和性的聚合物接枝电极表面[14~16]; ③增加电极表面的三维结构[17, 18]; ④纳米金属或金属接枝电极表面[14, 19].参考阳极电极材料的表面改性方法[20], 这些改性手段主要是通过改进以下3个方面：①导电性; ②生物亲和性; ③活性反应位点, 以达到提高微生物电合成系统合成效率的目的.
电化学还原重氮盐是一种简单稳定的反应, 通过电化学还原将特定的官能团接枝到电极表面进行改性[21~23].该电极表面改性方法已经成功应用在阳极电极材料, 提高了微生物燃料电池(MFC)的电流输出[22, 24]. Guo等[22]利用电化学还原重氮盐反应使—OH接枝到玻碳(GC)电极表面.结果表明, —OH接枝电极组建的MFC, 电流有显著的提高, 推测这是由于—OH的接枝提高了电极表面的亲水性, 微生物更容易黏附在电极表面, 形成更紧密的生物膜, 富集更多的电活性微生物.
本研究首次通过电化学还原重氮盐反应将亲水性官能团—COOH接枝到碳布电极表面, 随后将其作为固体阴极组建MESs产乙酸, 探究阴极表面的亲水性强弱对于MESs的影响, 以期为MESs的快速启动提供新的思路.
1 材料与方法 1.1 碳布的预处理以及改性方法阴阳极电极材料均为碳布(CC, 50 mm×45 mm).所有碳布首先在丙酮溶液中浸泡过夜(24 h)去除表面杂质, 用纯水冲洗3次之后, 在100℃的烘箱中干燥3 h.然后将碳布分别先后浸没在1 mol·L-1 HCl和NaOH溶液中热水浴1 h, 用纯水冲洗3次之后, 在100℃的烘箱中干燥3 h.
通过电化学还原重氮盐反应[22]将特定的官能团—COOH接枝到碳布电极表面(图 1).具体来说, 首先是5 mmol·L-1的4-氨基苯甲酸和NaNO2溶解在0.5 mol·L-1 HCl溶液中, 溶解过程不间断通入氮气(N2) 30 min, 以去除溶解氧.然后使用电化学工作站(CHI660, 上海晨华, 中国)进行电化学还原重氮盐反应, 阴极电势设定为-0.6 V (v.s Hg/HgCl2, 0.241 V), 采用三电极体系, 甘汞电极作为参比电极, 碳布作为工作电极, 铂电极作为对电极.在电化学工作站软件上显示通过流路的电荷量分别达到0.006、0.03和0.15 C时, 停止电化学还原重氮盐反应.随后, 改性电极用纯水冲洗3次之后, 自然晾干.改性电极按照在进行电化学还原重氮盐反应时通过流路电荷量的大小依次命名为：CA-L、CA-M和CA-H, 未改性电极命名为CK, 每个处理包含3个平行.
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图 1 电化学还原重氮盐的反应过程 Fig. 1 Reaction process of electrochemical reduction of aryl diazonium salts |
(1) X射线光电子能谱(XPS) 使用XPS (Thermo ESCALAB 250XI, 美国)分析电极表面的元素组成.碳布材料经过冷冻干燥去除表面水分, 使用XPS获得光电子能谱图, 分析电极表面的元素组成.
(2) 接触角 使用全自动接触角仪[Kruss (DSA100), 德国]测量纯水在电极材料表面的接触角.碳布材料平整放置在载玻片上, 全自动接触角仪软件设置液滴大小为10 μL, 设置测量方法为悬滴法.将液滴滴在碳布材料表面, 软件自动捕捉图像数据.手动调整基线, 软件自动读取并记录接触角大小.
(3) 循环伏安扫描(CV) 使用电化学工作站(CHI1000B, 中国)开展循环伏安扫描, 测定电极表面的电子传递效率.扫描条件：采用三电极体系, 甘汞电极作为参比电极, 碳布作为工作电极, 铂电极作为对电极.纯电化学体系的基质为：以0.2 mol·L-1 KCl水溶液为溶剂, 0.1 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]溶在0.2 mol·L-1的KCl电解质溶液中.扫描范围是-0.1~0.6 V, 扫描速度是5 mV·s-1.
1.3 MESs反应器的启动和运行采用先前报道的反应器装置设计[25, 26], 阴极的接种菌种为先前报道中驯化成功的产乙酸混合菌群[25], 阳极的接种菌种为驯化成功的MECs中阳极的产电混合菌群[27].反应器运行时, 阴阳极液的体积均为140 mL, 阴阳极液成分和先前的报道一致[25], 阴极液的pH调节为6.反应器阴极连接10 Ω电阻, 并连接直流电源负极, 反应器阳极连接直流电源正极.直流电源(Itech, IT6720, 中国)施加的电压为1.1 V.阴极室每24 h通入纯CO2气体10 min, 除了启动周期长度为8 d, 稳定时候的每个周期缩短到3 d.
1.4 MESs反应器性能和生物膜表征手段(1) 电流 数据自动采集器(Model M2700, module M7708, Keithley Instruments, 美国)连接10 Ω电阻, 采集电阻两端的电压变化, 经过如下公式计算得到电流变化:
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式中, I为电流, 单位A, U为电阻两端的电压, 单位V, R为电阻, 单位Ω.
(2) 高效液相色谱(HPLC) 阴极室乙酸的浓度由HPLC (EC2006, 大连依利特, 中国)测定, 色谱柱为有机酸分析柱[SinoChrom ODS-BP (4.6 mm×250 mm, 5 μm), 大连依利特, 中国], 流动相为0.09 mmol·L-1 K2HPO4水溶液, 流速为0.8 mL·min-1, 进样量10 μL, 检测波长210 nm, 柱温35℃.
(3) 循环伏安扫描(CV) 使用电化学工作站开展循环伏安扫描, 测定生物膜的电子传递效率.在反应器运行结束时, 开展循环伏安扫描, 采用三电极体系, 甘汞电极作为参比电极, 阴极碳布作为工作电极, 铂电极作为对电极.扫描范围设定为-0.8~0.4 V (v.s Hg/HgCl2, 0.241 V), 扫描速度为1 mV·s-1.
(4) 16S rRNA基因高通量测序 阴极接种液样品充分混匀后, 取10 mL菌液放入灭菌的15 mL离心管中, 经4 000 r·min-1离心5 min后收集菌体.阴极生物膜样品剪取阴极电极(25 mm×45 mm大小), 放入灭菌的50 mL离心管中.使用引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)用于PCR扩增.在Ⅰ-Sanger生信云平台进行分析.
(5) 蛋白量 使用考马斯亮蓝法测定阴极生物膜上的蛋白量.考马斯亮蓝溶液的配置：将100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%乙醇, 加入100 mL 85%的磷酸, 然后用蒸馏水补充至200 mL.在阴极的左上角取下0.5 cm×1 cm大小的生物膜, 经无菌水清洗后放置在5 mL离心管中, 加3 mL的1 mol·L-1 NaOH, 使用最大转数在漩涡振荡器上振荡10 min, 以促进生物膜上蛋白溶解, 随后在4 000 r·min-1离心5min收集上清液1 mL.上清液加入5 mL考马斯亮蓝溶液, 使用2档转数在漩涡振荡器上振荡混匀5 min, 显色后在紫外分光光度计读取吸光值, 检测波长为595 nm.
2 结果与讨论 2.1 电极表面的元素以及亲水性变化采用XPS检测电化学还原改性前后电极表面元素的变化, 结果如表 1所示, 电极表面元素主要为C、N和O, CA-L、CA-M、CA-H和CK的O元素相对含量分别为：7.97%、13.73%、4.14%和5.79%.除了CA-H, O元素比例随着电化学还原重氮盐反应中通过流路的电荷量增加而增加.在CA-H中, 可能是由于电化学还原重氮盐反应中通过流路的电荷量比较大, 电极表面覆盖了多层—Ar—COOH有机层, 使得O元素的相对含量值较低[28].通过测定纯水在各电极材料表面的接触角, 发现接触角的大小随着通过流路的电荷量增加而减少(即CA-H>CA-M>CA-L>CK), 纯水在CA-H电极表面的接触角等于0, 表明经电化学还原改性后, 电极的亲水性显著增强.电极材料表面的元素组成和接触角的测量结果表明：—COOH已通过电化学还原重氮盐反应成功接枝到电极表面.循环伏安扫描结果显示(图 2), 在相同电压下电流的大小顺序为：CK=CA-L>CA-M>CA-H.随着通过流路的电荷量的增加, 电极表面电子传递效率呈现降低的趋势.这是由于电化学还原重氮盐反应中, 电极材料的表面覆盖了有机层—Ar—COOH, 而且随着通过流路的电荷量的增加, 电极表面覆盖的—Ar—COOH浓度增加, 改变了碳布表面的电化学性质[28], 导致电极表面电子传递效率的降低.
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扫描条件：纯电化学体系的基质为0.1 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶在0.2 mol·L-1的KCl电解质溶液, 扫描范围为-0.1~0.6 V, 扫描速度5 mV·s-1 图 2 各电极的循环伏安扫描结果 Fig. 2 Cyclic voltammograms (CV) of electrode |
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表 1 电极材料表面的元素组成以及接触角(纯水)测量结果 Table 1 Elemental composition and hydrophobicity of electrode surfaces |
2.2 微生物电合成系统的性能 2.2.1 不同电极组建的MESs产电性能和初始阴极电势
外加电压为1.1 V时, MESs反应器从启动到稳定阶段的电流曲线如图 3所示.在0~72 h期间, 电流从0上升到2 mA; 在60~324 h期间, 电流均稳定在2 mA左右, 表明阴极表面形成了稳定的生物膜.在MESs反应器启动阶段(0~72 h), CA-H、CA-M、CA-L和CK在48 h的电流密度分别是(0.74±0.09)、(0.73±0.08)、(0.56±0.13)和(0.16±0.10) A·m-2, 误差来源于3个平行样品.改性电极组建的MESs(改性组)比未改性电极组建的MESs(未改性组)在更短的时间内达到了更高的电流密度.先前的研究表明, 微生物电化学系统的产电性能和电极表面的生物膜有密切关系[29, 30].相比未改性组, 亲水性更强的改性电极表面加速了微生物的附着, 减少了从启动到稳定所需的时间[31].在MESs的稳定运行阶段(72~324 h), CA-H、CA-M、CA-L和CK的平均电流密度分别是(0.85±0.03)、(0.85±0.05)、(0.79±0.05)和(0.77±0.05) A·m-2, 改性组的电流密度比未改性组的稍高.
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箭头表示阴阳极基质的更换和一个周期的结束 图 3 MESs的输出电流随时间变化曲线 Fig. 3 Current generation in different MESs |
MESs在启动期的阴极电势变化如图 4所示. CA-H、CA-M、CA-L和CK的初始阴极电势分别为：-670.6、-586.6、-525.9和-451.7 mV, 阴极材料表面的亲水性越强, 启动期的阴极电势越低, 推测可能是因为亲水性的增强, 阴极液与电极表面的接触更加充分, 进而使得电化学活性微生物更容易附着在电极表面[32].
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图 4 采用改性与未改性阴极启动的MESs在启动期的阴极电势 Fig. 4 Cathodic potentials in different MESs at the start-up period |
MESs从启动到稳定阶段的产氢速率以及乙酸累积浓度如图 5所示.在第一周期的2 d(48 h), 反应器的电流从0逐渐上升到2 mA后, 首先检测到反应器中有氢气的产生, 此时没有检测到乙酸. MESs的产氢速率在96 h达峰值, 120 h开始下降, 此时首次检测到乙酸的产生.先前的研究认为, 理论上当电极电势为-410 mV(vs. SHE)时, 阴极微生物可以利用电极上的电子产生氢气, 但是实际需要更低的电势[1, 4], 理论上当电极电势为-280 mV(vs. SHE)时, 阴极微生物可以利用电极上的电子产生乙酸, 但实际所需的电势远远低于此数值[8, 26, 33, 34], 在实际研究中, 阴极电势在-400~1 100 mV(vs. SHE)之间均有报道.在本研究中, MESs生物阴极先产生氢气, 后产生乙酸; 而且随着乙酸的生成, 氢气的产生速率逐渐下降为0, 说明阴极生物膜逐渐形成并对氢气有极高的利用和转化效率, 进而推断阴极微生物是利用氢气作为电子传递体[35].
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箭头表示阴阳极基质的更换, 周期的结束 图 5 采用改性与未改性阴极组建的MESs的产氢速率和产乙酸累积量 Fig. 5 Hydrogen production rate and acetate concentration accumulation in different MESs |
在各个MESs反应器之间, 改性组和未改性组的产氢产乙酸性能存在一定的差异.改性组在48 h开始检测到氢气的产生, CA-H、CA-M和CA-L在48h的平均产氢速率分别是：(1.67±0.57)、(2.23±2.51)和(1.77±1.39) mL·d-1, 而CK对应的平均产氢速率只有(0.08±0.08) mL·d-1. CA-H、CA-M、CA-L的产氢速率分别是CK的21.45、28.60和22.75倍.改性组MESs在72 h获得最大产氢速率, CA-H、CA-M和CA-L的平均产氢速率分别是：(8.56±0.22)、(9.91±1.32)和(10.79±2.42) mL·d-1.而CK的则是(4.01±2.23) mL·d-1, 在96 h时CK的平均产氢速率才达到最大, 为(6.86±4.14) mL·d-1.
运行120 h, 所有MESs反应器开始检测到乙酸的产生, CA-H、CA-M、CA-L和CK的乙酸累积浓度分别是：(2.06±0.37)、(2.35±0.42)、(1.67±0.32)和(0.68±0.46) mmol·L-1. CA-H、CA-M和CA-L的乙酸累积浓度是CK的2.01、2.43和1.44倍.第一周期结束(192 h), CA-H、CA-M、CA-L和CK的乙酸累积浓度分别是(7.47±0.24)、(6.28±0.36)、(6.14±0.04)和(4.61±0.19) mmol·L-1, 相比CK, CA-H、CA-M和CA-L分别提高了61.92%、36.12%和33.13%.第二周期结束(264 h), CA-H、CA-M、CA-L和CK的乙酸累积浓度分别是(4.12±0.24)、(4.05±0.02)、(2.98±0.16)和(2.29±0.08) mmol·L-1, 相比CK, CA-H、CA-M和CA-L分别提高了80.09%、77.18%和30.16%.第三周期结束(324 h), CA-H、CA-M、CA-L和CK的乙酸累积浓度分别是(4.29±0.23)、(4.22±0.25)、(3.93±0.26)和(3.89±0.19) mmol·L-1, 相比CK, CA-H、CA-M和CA-L分别提高了10.25%、8.53%和1.08%.随着周期的增加, 不同MESs反应器之间产乙酸的性能差异越来越小, 因此可以推断, 阴极亲水性的增加会促进微生物在电极表面的初始附着, 从而强化MESs的产乙酸性能.
2.3 阴极生物膜的表征 2.3.1 循环伏安法扫描分析运行324 h后, 将MESs各阴极进行循环伏安扫描分析, 结果如图 6所示.由循环伏安曲线可知, 对比非生物组, 生物组的循环伏安扫描结果存在明显的还原峰, 证明阴极表面的微生物具有良好的电化学活性, 能够在电极表面催化还原CO2.还原峰的位置在-560 mV (vs. Hg/HgCl2)左右, 根据先前的研究结果, 这个峰既不是析氢峰, 也不是CO2直接通过电化学方式还原成乙酸的还原峰[1], 推测该还原峰可能与细胞膜上具有电化学活性的细胞色素有关[35].
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图 6 生物阴极和非生物阴极的循环伏安曲线 Fig. 6 Cyclic voltammograms (CV) of cathodic biofilm and non-modified cathodic biofilm |
虽然各个MESs反应器之间, 改性组和未改性组的产氢产乙酸性能存在一定的差异.但是循环伏安扫描结果显示, CA-H、CA-M、CA-L和CK的还原峰出峰位置和在相同电位下电流的大小没有明显差异, 说明各个反应器的电极-阴极生物膜的电化学活性相近.对比图 2的结果发现, 虽然电极改性导致电极表面电子传递效率的降低, 但生物膜的附着、生长和成熟能够提高电极-生物膜之间的电子传递效率[29], 叠加了电极改性和生物膜两者的作用后, 循环伏安扫描结果显示各个反应器的电极-阴极生物膜的电化学活性相近.
2.3.2 阴极生物膜生物量和群落结构分析运行324 h后, 测量阴极生物膜的蛋白量以反映生物膜的生物量大小, 结果如图 7所示, CA-H、CA-M、CA-L和CK的阴极生物膜蛋白量分别是(0.489±0.019)、(0.485±0.019)、(0.469±0.075)和(0.469±0.037) mg·cm-2.虽然各个MESs反应器之间, 改性组和未改性组的产氢产乙酸性能存在一定的差异, 但是各个反应器阴极生物膜的生物量并没有显著差异.
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图 7 阴极生物膜的生物量和单位生物量的产乙酸量 Fig. 7 Protein content and accumulative acetate production per protein |
CA-H、CA-M、CA-L和CK阴极生物膜单位蛋白量累积产生乙酸量分别是(32.50±1.09)、(30.02±0.68)、(25.19±1.35)和(23.19±2.17) mmol·(L·mg·cm2)-1, 说明CA-H和CA-M的阴极生物膜产生乙酸的效率更高.利用产乙酸混合菌群构建的MESs, 检测到的乙酸累积浓度是产乙酸菌群产生的乙酸量减去其他异养菌群消耗的乙酸量的结果.阴极生物膜的生物量相近的条件下, 产生乙酸的效率高可能有两个原因：一个是阴极生物膜的群落中, 产乙酸菌群的相对丰度更大, 产乙酸的能力更强; 另一个是阴极物膜的群落中, 其他异养菌群的相对丰度更小, 消耗乙酸的能力更弱.
高通量测序的结果表明, 在门水平上, 阴极的接种液厚壁菌门(Firmicutes)是绝对的优势种, 相对丰度占总丰度的70.3%, 变形菌门(Proteobacteria)相对丰度占总丰度的28.6%, 这两个门的微生物占到了总丰度的98.9%.接种到MESs反应器并运行324 h之后, MESs阴极生物膜主要由厚壁菌门(Firmicutes), 变形菌门和Saccharibacteria门占据主导, 它们的总相对丰度占到74.2%~91.8%(图 8).在属水平上, 阴极的接种液主要由醋酸杆菌属(Acetobacterium)和Thioclava属组成, 这两个属的相对丰度分别占总丰度的70.0%和17.3%.接种并运行后, 各个反应器阴极生物膜的群落结构比接种液更复杂, 主要由Acetobacterium属、norank_p_Saccharibacteria属和Thioclava属组成, 它们的总相对丰度占到59.6%~82.1%[图 8(b)].醋酸杆菌属(Acetobacterium)是在微生物电合成系统中出现频率最多的一个属, 能够还原CO2产乙酸[8, 36~38].相比先前的研究, 阴极生物膜群落结构的物种在门水平上, 首次检测到Saccharibacteria门, 而在属水平上, 首次检测到norank_p_Saccharibacteria属. Saccharibacteria门广泛存在于自然环境中[39], 包括污水处理场的活性污泥[39]、根际土壤中[40], 近年来也在处理垃圾渗滤液的膜生物反应器[41]中发现其存在.关于Saccharibacteria门的微生物研究比较少, Kindaichi等[39]的研究发现, 大部分Saccharibacteria门的微生物, 可以在厌氧的情况下进行糖代谢, 推测在本次的研究中, Saccharibacteria门的微生物主要起着消耗底物的作用. norank_p_Saccharibacteria属的微生物在CA-H、CA-M、CA-L和CK的阴极生物膜的相对丰度分别为：16.1%、24.6%、31.1%和37.5%.各阴极在Acetobacterium属的相对丰度比较接近的情况下, 也就是说产乙酸能力相对一致的情况下, norank_p_Saccharibacteria属的微生物的相对丰度越高, 消耗底物的能力越强.两者的作用相互抵消之后, 呈现出CA-H和CA-M的产乙酸能力比CA-L和CK更强的现象.
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图 8 阴极生物膜群落结构分析 Fig. 8 Microbial community structure analysis of cathodic biofilm |
(1) 经—COOH改性的阴极材料亲水性显著提高.
(2) 其组建的MESs在启动阶段性能差异最大, 改性组的产氢速率、乙酸累积浓度相比未改性组显著提高.
(3) 随着MESs的持续运行, 各阴极生物膜的电化学活性、蛋白量无明显差异.群落结构分析显示：各阴极生物膜之间产乙酸功能菌的相对丰度差别不大, 而消耗乙酸的微生物的相对丰度存在显著差异, 这可能是改性组的性能差异的原因之一.
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