抗生素能有效杀灭病原体, 因而被广泛应用于健康领域.随着畜牧业的发展, 抗生素被广泛用作饲料添加剂以提高饲养效率^{[1, 2]}.近年来, 随着社会经济的快速发展, 人们对健康有机食品的需求与日俱增^[3].全球已有数百个国家开展有机农业的生产, 我国自本世纪以来大力发展有机农业, 现已有有机农场面积达230万hm^2[4].有机农业与传统农业模式不同, 其提倡使用有机肥, 禁用农药化肥等合成品.大多数农业生产基地直接或间接地将含有抗生素的禽畜粪便、污泥、污水等作为有机肥或灌溉用水施于农田土壤.尽管在农田利用前会对畜禽粪便进行堆肥、腐熟, 或蚯蚓养殖等处理, 但这些处理方式对抗生素的去除效率并不高^[5], 因此土壤便成为抗生素在环境中的重要归属场所^{[6, 7]}.虽然环境中抗生素的残留对人体没有直接危害, 但养殖业和医疗行业对抗生素的长期大量不规范使用, 使其不断输入到土壤中^[8], 抗生素通过物理、化学、生物反应发生一系列迁移、降解、吸附等环境行为后被植物吸收累积, 并经由食物链进入人体, 从而加剧细菌耐药性的产生和传播, 最终威胁生态系统和人类健康^[9~13].近年来, 抗生素已然成为一类新型的重要环境有机污染物.

目前已有学者开展了农用地土壤抗生素方面的研究, 但大多是针对某一特定土地利用类型下某单一类别抗生素的空间分布、污染特征或风险评估^[14~16], 以及抗生素在土壤中的迁移转化、生态毒性等方面^{[17, 18]}, 而对于不同种植模式, 多类抗生素的组成特征、空间分布及积累规律方面的综合性研究则相对缺乏.在众多种类的抗生素中, TCs价格低廉, 是世界各国养殖、畜牧业中使用最多、最广泛的一类抗生素^{[19, 20]}.我国每年有5 000~7 000 t土霉素(oxytetracycline, OTC)和750~1 000 t金霉素(chlortetracycline, CTC)用于动物养殖^[21]. MLs已被广泛应用于细菌感染的治疗和预防, 如牛、羊、猪和家禽的呼吸道疾病、肠道感染^[22]. SAs自1935年便应用于临床治疗, 是人工合成抗菌药物中应用最早的一类, 因此作为畜禽饲料药物添加剂被广泛使用.但SAs不易被分解吸收, 约有60%~90%会以原药或代谢物的形式随动物粪便排出体外, 最终进入到环境中^[23].针对上述情况, 本文选取我国北部典型农副产品生产基地, 通过对研究区土壤采样及系统分析, 揭示土样中上述三类抗生素(共检测10种)的含量特征, 对不同种类抗生素含量的空间分布进行插值预测, 并就其含量分布与养殖场、公路、河流间距离的关系, 以及不同种植模式、不同土壤性质对抗生素组成特征与积累规律的影响进行初步探讨, 以期为快速社会经济发展背景下农用地土壤安全利用提供科学参考.

研究区位于116°57′E~117°15′E、40°4′N~40°17′N的某农副产品生产基地, 属典型的北温带大陆性半湿润季风气候, 主要土壤类型有褐土、潮土以及少量水稻土.研究区内主要土地利用类型为果园和菜地, 其中果园以种植桃树为主.区内农用地普遍施用以鸡粪、羊粪等禽畜粪便为主的有机肥, 且存在部分规模化禽畜养殖场.

利用ArcGIS软件对研究区内果园和菜地的空间分布进行采集和网格化.根据控制区域和分层抽样的原则, 进行网格分布设计.果园网格大小为235 m×235 m, 菜地为160 m×160 m.考虑研究区内不同土壤类型, 不同种植模式, 以及养殖场、公路、河流的分布情况, 共布设样点95个, 利用GPS精确定位进行土样采集, 采样点分布情况如图 1所示.根据采样地块的大小和形状, 采用梅花法、蛇形法或棋盘法对10个样本进行随机抽样.采集土样深度为0~25 cm, 用四分法取样品约1 kg, 每个样品均用密封袋包装并标记, 放置于装有干冰的保温箱带回实验室, 于-20℃保存并立即冷冻干燥处理.

图 1

Fig. 1

图 1 研究区采样点分布示意 Fig. 1 Distribution of sampling points in the study area

本研究对4种TCs：四环素(tetracycline, TC)、土霉素(oxytetracycline, OTC)、强力霉素(doxycycline, DXC)、金霉素(chlortetracycline, CTC), 2种MLs：红霉素(erythromycin, ERY)、罗红霉素(roxithromycin, ROX), 4种SAs：磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SMR)、磺胺2甲氧嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)、磺胺5甲氧嘧啶(sulfamethoxydiazine, SMD)、磺胺甲唑(sulfamethoxazole, SMZ)共10种抗生素进行检测. 10种抗生素的标准品均购于北京北纳创联生物技术研究所.本实验分析中所用的柠檬酸、甲酸、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸(EDTA)为分析纯, 购自北京化学试剂公司(中国).乙腈和甲醇是HPLC级, 购自Fisher Scientific(美国).溶液配制、淋洗等所用水均为超纯水, 由Aquapro Ultrapure Water System超纯水机提供.以乙腈为原料标准溶液, 制备ERY(1 000 mg·L^-1)、ROX(1 000 mg·L^-1)、CTC(10 mg·L^-1)、TC(10 mg·L^-1)和DXC(10 mg·L^-1).在甲醇中制备其他5种抗生素(10 mg·L^-1)的标准溶液.将所有的标准溶液储存在-20℃冰箱中.通过在200 mL水中溶解2.8 g柠檬酸、13.9 g磷酸二氢钠和8.2 g EDTA, 制备EDTA-McIlvaine缓冲溶液.

称取2 g土壤样品到50 mL离心管中, 用8 mL提取液(甲醇/EDTA-McIlvaine缓冲液, 体积比为1/1)通过涡旋彻底混合5 min.然后将样品在3 800 r·min^-1离心5 min.用0.22 μm滤膜过滤上清液1 mL, 用HPLC-MS/MS进行抗生素的识别与定量测定. HPLC-MS/MS系统(Agilent technologies, USA)由1200系列液相色谱仪组成, 该液相色谱仪与配备有电喷雾电离界面(ESI)的三重四极杆质谱仪(6410 Triple Quad)偶联.通过HPLC反相C18柱(50 mm×2.1 mm×3.5 μm, Agilent technologies, USA)分离10种目标抗生素.色谱柱温保持在30℃, 进样量为5 μL, 流速为0.3 mL·min^-1.流动相A为甲醇, 流动相B为0.1%甲酸水溶液, 采用梯度洗脱程序, 程序设置如表 1所示. 10种抗生素标准曲线线性方程的R2均大于0.99.

表 1 (Table 1)

表 1 抗生素的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program for the antibiotics 时间/min 甲醇/% 0.1%甲酸水溶液/% 流速/mL·min-1 0 5 95 0.3 1 5 95 0.3 5 25 75 0.3 8.5 90 10 0.3 9.5 90 10 0.3 10 5 95 0.3 13 5 95 0.3

表 1 抗生素的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program for the antibiotics

3类抗生素的检测限(LOD)分别为TCs：0.75~1.20 μg·kg^-1, MLs：0.01~0.04 μg·kg^-1, SAs：0.10~2.00 μg·kg^-1.以4个加标浓度(10、50、100、500 μg·kg^-1)进行3类目标抗生素的回收率测定, 其回收率为TCs：70%~99%, MLs：37%~53%, SAs：71%~108%, 回收率的标准偏差(RSD)在1%~20%之间, 表明该方法具有良好的精密度及重现性.

所有数据均采用平均值±标准偏差来表示, 采用IBM SPSS 21.0软件进行数据的描述统计、相关性及主成分分析, 影响因素的贡献率通过Canoco4.5线性模型的冗余分析实现, 数据的空间预测及绘图在ArcGIS 10.2地统计分析工具中进行.

不同抗生素在土壤中含量变化特征及检出率如表 2所示.其中MLs检出率高达98%, SAs和TCs的检出率分别为78%、62%. TCs中, DXC及CTC最大值达333.62 μg·kg^-1和297.42 μg·kg^-1, 其含量远超过国际兽药指导委员会规定的土壤生态效应触发值(100 μg·kg^-1). MLs中ERY、ROX平均含量较低, 分别为0.10 μg·kg^-1±0.81 μg·kg^-1和0.40 μg·kg^-1±0.25 μg·kg^-1, 但ROX检出率高达98%, SDM在SAs中含量及检出率均高于其它3种.整体上, 研究区土壤中抗生素的主要成分为TCs, 约占总量的94%, 除个别样点中DXC及CTC含量出现较大值外, 整个研究区不同抗生素含量均处于较低水平.此外, 不同抗生素变异系数较大, 可见研究区内土壤抗生素含量存在较大的空间差异性.

表 2 (Table 2)

表 2 土壤中不同抗生素含量描述性统计 Table 2 Statistical descriptions of the concentrations of the different antibiotics in the soil samples 抗生素类型 最大值/μg·kg-1 最小值/μg·kg-1 平均值/μg·kg-1 变异系数 检出率/% TCs TC n.d. 28.31 0.75±3.61 4.83 15 62 OTC n.d. 81.00 2.70±12.28 4.55 15 DXC n.d. 333.62 8.93±38.94 4.36 52 CTC n.d. 297.42 10.00±35.45 3.55 29 MLs ERY n.d. 7.84 0.10±0.81 7.75 12 98 ROX n.d. 1.43 0.40±0.25 0.63 98 SAs SMR n.d. 0.87 0.04±0.12 3.39 12 78 SDM n.d. 8.39 0.66±1.27 1.91 56 SMD n.d. 1.07 0.08±0.22 2.93 12 SMZ n.d. 0.53 0.06±0.13 2.28 18

表 2 土壤中不同抗生素含量描述性统计 Table 2 Statistical descriptions of the concentrations of the different antibiotics in the soil samples

对检测的10种抗生素含量进行Pearson相关性分析, 结果如图 2, 其中下三角形显示不同配对变量之间的相关系数, 对角线中直方图表示相应变量的数据值分布, 上三角形为不同配对变量之间的局部加权散点图, 其中黑线为其线性拟合线.由图 2可见, TCs中TC-DXC(r=0.420)、TC-CTC(r=0.878)、OTC-DXC(r=0.564)、OTC-CTC(r=0.335)、DXC-CTC(r=0.529)5组抗生素均呈显著正相关(P＜0.01), 可见TCs内部不同抗生素相关性较强. ROX-SMZ(r=0.208)为显著正相关, 而ROX-SMD(r=-0.222)呈显著负相关(P＜0.05), 其余组合相关性不显著.表现为显著正相关的几组抗生素, 说明其一般具有某种同源关系或存在复合污染情形, 而呈现负相关性则说明可能不具有同源性.

图 2

Fig. 2

图 2 不同抗生素的Pearson相关矩阵 Fig. 2 Matrix of the Pearson correlations for the different antibiotics

经验贝叶斯克里格法在重金属空间分布及环境风险评估方面已成为热点, 但在抗生素的研究中还较少出现.本研究尝试使用该方法结合ArcGIS软件中的地统计分析工具对研究区土壤抗生素的空间分布情况进行科学预测, 结果如图 3所示.

图 3

Fig. 3

图 3 不同土壤抗生素空间分布 Fig. 3 Spatial distribution of the concentrations of the different antibiotics in the soil

图 3中研究区抗生素总量在0.77~86.89 μg·kg^-1之间, 其含量的整体水平不高, 主要聚集于研究区西北角及东北角. TCs含量处于0~75.86 μg·kg^-1, 其分布与抗生素总量的分布格局基本一致, TCs含量在总量的占比高可能是导致这种分布格局的主要原因; MLs含量值较低, 为0.21~1.41 μg·kg^-1, 在研究区的正南方向有小部分聚集; SAs含量亦较低, 值为0.09~5.22 μg·kg^-1, 主要聚集地带为研究区西北角及中部部分区域, 其余区域均无明显聚集现象.

已有研究表明, 土壤中抗生素的存在状态及含量变化会不同程度地受人类活动强度(如禽畜养殖密度、道路距离、海拔等), 不同土地利用模式以及土壤本身性质(pH、有机质、含水量等)的影响^{[16, 24, 25]}.结合研究区实际情况, 本文选择样点与禽畜养殖场、公路、河流间的距离, 不同种植模式以及不同土壤性质为影响因素, 研究区内土壤中不同抗生素的组成特征与积累规律.

将研究区各样点抗生素进行检出含量值划分, 其含量与养殖场、公路及河流的空间分布情况如图 4所示.

图 4

Fig. 4

图 4 养殖场、公路及河流周边土壤抗生素含量分布特征 Fig. 4 Distribution characteristics of the concentrations of the antibiotics in the soil around livestock farms, highways, and rivers

不同抗生素的检出率及含量基本随土壤样点与养殖场、公路、河流间距离的增大而逐渐降低, 其中距离河流50 m内的样点3类抗生素检出率均达100%, 含量均值分别为TCs: 40.05 μg·kg^-1、MLs: 0.93 μg·kg^-1、SAs: 2.84 μg·kg^-1, 同样高于50 m以外的样点含量均值. 图 4(a)中抗生素总量的检出率为100%, 含量范围在0.30~508.06 μg·kg^-1之间, 其中抗生素最高含量出现在西北及东北角, 主要围绕该区域养殖场四周分布. TCs浓度处于n.d.~506.77 μg·kg^-1之间[图 4(b)], 高含量的聚集区域与抗生素总量的分布格局相似. 图 4(c)及图 4(d)中MLs、SAs整体含量较低, 分别在n.d.~8.58 μg·kg^-1、n.d.~8.39 μg·kg^-1之间, 其中MLs含量较高值出现在研究区东北角的禽畜养殖场周边, 中下部禽畜养殖场、公路、河流汇集区, 以及正南部公路及河流边沿; SAs含量较大值主要出现在研究区西北至东南方向的对角线上, 沿养殖场、公路、河流附近分布.通过相关性分析显示, 样点抗生素含量与距禽畜养殖场间的距离呈显著负相关(P＜0.05), 相关系数为-0.214, 推测区内人类活动强度在不同程度上影响了该区域抗生素的分布情况.

研究区土地的农业利用方式主要为果园和菜地, 果园以种植桃树为主, 还有部分区域种植核桃; 菜地可分为露天和大棚两种, 此外, 还有少量区域为菜果混种地块. 图 5(a)为不同种植模式下不同土壤抗生素的检出含量值, 区内10种抗生素含量分布不均, 但整体呈现的趋势为：果园＞菜地＞菜果混种, 且桃园的检出含量远高于其它种植类型.大棚菜地与露天菜地抗生素的检出含量较为接近, 但在不同抗生素的具体分布上略有差异.整体上, 不同种植类型均以TCs的检出含量最高, 而MLs和SAs则相对较低.对不同种植类型各样点抗生素含量的PCA分析结果显示[图 5(b)], 桃园及露天菜地土壤中抗生素的来源、含量残留与其它种植类型具有差异性, 而核桃园、大棚菜地及菜果混种地块样点抗生素含量、组成及来源的区别较弱, 可见不同种植模式对区内抗生素的组成与分布产生了影响.

图 5

Fig. 5

图 5 不同种植模式土壤抗生素含量组成及载荷三维散点图 Fig. 5 Composition of the antibiotics in the soil and three-dimensional scatter plots for factor loading in different planting patterns

选择土壤pH、SOM、CEC、TN、AP、AK来表征土壤性质, 探究土壤本身特性对抗生素含量积累的影响, 冗余分析结果如图 6所示.

图 6

Fig. 6

图 6 土壤性质与抗生素含量间的冗余分析 Fig. 6 Redundancy analysis of the quantitative correlations between the antibiotic concentrations and soil properties

整体上, 土壤pH、SOM、CEC、AP、AK这5种因子对土壤抗生素含量的影响较大, 最为密切的是AK, 相较而言TN的影响较弱. AK、AP、SOM与抗生素总量、TCs(包括其中4种抗生素)含量呈正相关, 且通过Pearson相关分析显示SOM与TCs呈显著正相关(P＜0.05), 相关系数为0.221. AK与其它两类(共6种)抗生素呈明显负相关, 尤其与MLs(包括ERY、ROX)含量基本接近反相关.土壤pH及CEC对抗生素总量及TCs呈负相关性, 对SAs中SMZ、SMR具有较强正相关性, 而对同属SAs的SDM、SMD则呈现出负相关, MLs(包括ERY、ROX)浓度与CEC基本无相关性, 即其不会随CEC的变化而变化.可见土壤性质中的各土壤因子均在不同程度上显著影响着土壤中抗生素的组成与积累.

TCs在研究区土壤抗生素中比重较高, 占总量的94%, 少量样点DXC及CTC含量较高, 但相较于国内外其他区域来说, 其含量则相对较低.据报道, 上海某饲养场附近农田土壤中TCs总含量最高达到6 400 μg·kg^-1[26]; 辽宁和天津部分邻近集约化养殖场的农田土壤中, TCs检测率达100%, 其中CTC浓度为1 520. 6 μg·kg^-1, 最高甚至达10 967.1 μg·kg^-1[2]; Hamscher等^[27]对长期施用动物排泄物的表层土壤的研究发现CTC的最大残留量达26.4 mg·kg^-1, 高于本研究2~3个数量级.抗生素的不同吸附能力在一定程度上决定其在土壤中的含量, TCs的吸附能力较强, 吸附系数K_d处于290~1 620 L·kg^-1之间, 较高的吸附系数使TCs在土壤表层具有较强的持久存在能力, 而MLs与SAs含量相对较低可能由于其水溶性大、土壤吸附系数K_d值较低、迁移能力较强、半衰期短等原因, 尤其是SAs在农田土壤中24 h后的回收率不超过15%^[28~31].尽管研究区内MLs和SAs两类抗生素的含量远低于TCs, 但3类抗生素检出率均较高, 且抗生素总量的检出率达100%, 各抗生素之间的联合毒性尤其是耐药性问题不容忽视, 因此, 需要进一步深入研究并结合科学的农艺措施来控制土壤抗生素的积累现象.

研究区抗生素含量的整体水平不高, 主要聚集于西北角及东北角, 该区域以种植桃为主要农产品, 桃树的需肥量很大, 必须得到足够的肥料供应, 才能达到生长健壮、丰产稳产.研究区普遍施用有机肥, 且以鸡粪、羊粪为主, Zhang等^[1]通过调查国内包含本研究所选抗生素在内的36种抗生素的使用量, 发现有84.3%用于动物饲养, 仅15.6%用于人类健康, 并且农田土壤与有机肥具有相似的抗生素组成特征, 认为禽畜粪便作为有机肥施用于农田是土壤中抗生素的主要来源^[26].因此研究区西北及东北角桃园粪肥的大量施用, 可能是导致该区域抗生素聚集的主要原因.

土壤中抗生素含量较大值基本分布于研究区养殖密度较高区域, 由于规模化禽畜养殖场的废水处理工艺对抗生素去除效率不高^[32], 粪肥中含有大量有机质, 这些有机质所带的活性官能团如羟基、羧基、甲氧基等可与有机污染物发生络合、吸附作用, 从而使抗生素在土壤中积累, 含有抗生素的禽畜粪施于农用地便成为土壤中抗生素的重要来源^[33], 这与本文Pearson相关性性分析结果相一致, 即抗生素含量与距禽畜养殖场的距离呈显著负相关.人类活动对生态系统的干扰始于道路结构^{[34, 35]}, 人类活动总倾向于临近公路、河流的区域, 因而活动强度会随着距离道路、河流及城镇间距离的增加而逐渐减弱.村镇一般位于公路或河流附近, 且可能存在小规模的禽畜养殖, 产生的粪便以及日常含有抗生素的生活或医疗废水进入土壤后不断累积, 从而使抗生素含量升高.研究区部分土样尽管分布在养殖场、公路或河流附近, 但其含量并未达到较高水平, 究其原因可能与粪肥的来源、种类及抗生素含量、施肥方式、施肥后取样时间、土壤特性、耕作条件等因素有关, 而各种因素之间又可能会产生相互影响^[36].如施用粪肥土壤中抗生素含量会随时间推移发生变化, 鸡粪中抗生素的降解速率较猪粪中的快等^[37].

研究区不同种植模式土样中抗生素含量组成存在差异, 结果显示果园高于菜地.潘霞等^[38]的研究发现, 菜地表层土壤抗生素总量明显高于林地与果园, 这与本研究结果有所不同, 主要原因在于研究区果园主要种植需肥量较大的桃与核桃, 有机肥的长期大量施用导致该区域土壤抗生素含量偏高.相比之下, 区内桃园、露天菜地种植面积较广, 长期大面积大量施肥会导致土壤抗生素含量较高且有较明显的外源输入情况, 此外, 大面积种植无法进行经常性均匀轮作, 同样会延缓抗生素的降解速度.一般来说大棚温度较露天条件高5~10℃, 适当的高温高湿有利于抗生素的降解, 该研究区年均温度及湿度较低, 大棚土壤种植频率比露天高, 施用禽畜粪便更多^[15], 众多因素共同作用导致研究区露天菜地与大棚菜地抗生素含量及组成存在一定差异.此外, 抗生素在土壤中的含量与环境行为也会受土壤pH值、SOM等土壤性质的调节^{[39, 40]}, 本研究的分析结果显示土壤性质中的各土壤因子均在不同程度上影响着土壤中抗生素的组成与积累.已有研究显示, SOM所带的活性官能团可与有机污染物发生物理化学作用, 从而影响抗生素在土壤中积累, 酸性强的土壤对抗生素具有较强的吸附能力, 如TCs在酸性土壤中吸附性强, 土壤对磺胺嘧啶的吸附性随SOM浓度及pH变化而变化等^{[41, 42]}, 这些均与本研究结果相似.

(1) 研究区TCs、MLs、SAs平均含量处于较低水平, 但3类抗生素检出率较高, 抗生素总量的检出率达100%, 因而今后各抗生素间的联合毒性尤其是耐药性问题不容忽视. TCs为研究区抗生素的主要成分, 约占总量的94%, 其中DXC及CTC最大值已达333.62 μg·kg^-1和297.42 μg·kg^-1, 超过国际兽药指导委员会规定的土壤生态效应触发值(100 μg·kg^-1), 应适当加强该区域TCs的使用管理.空间预测显示抗生素含量整体水平较低, 主要聚集于研究区西北角及东北角.

(2) 区内土壤抗生素的残留含量与距养殖场、公路及河流间的距离, 不同种植模式, 不同土壤性质有关.不同抗生素的检出率及含量基本随土壤样点与养殖场、公路、河流间距离的增大而降低, 其中抗生素含量与距离禽畜养殖场的距离呈显著负相关(P＜0.05), 距离河流50 m内的样点3类抗生素的检出率均达到100%.不同种植模式下抗生素含量整体趋势为：果园＞菜地＞菜果混种地, 主要原因为果园种植需肥量较大的桃与核桃. PCA结果显示桃园及露天菜地中抗生素的来源、含量与其它种植类型具有差异性.土壤pH、SOM、CEC、AP、AK这5种因子对土壤抗生素含量影响较大, 最为密切的是AK, 而TN的影响较弱.

(3) 研究区土壤抗生素的组成特征与积累规律受人类活动及土壤性质的共同作用, 其中有机肥(主要为禽畜粪便)的施用是区内农用地土壤抗生素的重要来源.因此, 为发展可持续农业及保障农产品安全, 需从源头上减少抗生素进入土壤, 并不断深入研究抗生素在有机粪肥-土壤-植物之间的迁移规律.