2019, Vol. 40
氮(N)和磷(P)元素属于营养元素, 水体营养元素含量过高会引起水体富营养化.目前, 从废水中去除氮、磷营养物的最为经济的方法仍然是生物法(bio-nutrients removal, BNR).而当前国内、外有关脱氮、除磷的研究更着力于对过程中高附值的副产品进行回收利用(nutrients removal and source recovery), 对污水中的营养物质回收为水资源以及农业产业等方向提供了可持续发展的可能性.近年来在传统厌氧/好氧BNR工艺基础上形成生物除磷-磷回收工艺[1], 能够在反应器厌氧阶段获得高浓度的磷回收液, 并通过鸟粪石法进行回收磷, 实现磷的资源化同时减少剩余污泥的产量.这一过程, 充分利用了生物除磷的基本原理, 即利用聚磷菌厌氧释磷好氧过量吸磷的特性, 厌氧/好氧交替生物的生物反应器内的聚磷菌将磷富集在体内, 在厌氧条件下通过投加高浓度有机碳源, 让聚磷菌吸收有机碳同时释放体内的磷, 得到含磷的高浓度回收液, 最后通过鸟粪石结晶法回收高浓度磷回收液中的磷.在此过程, BNR内的重要菌群, 如聚磷菌(phosphate accumulating organisms, PAO)或聚糖菌(glycogen accumulating organisms, GAO)及其它异养型微生物[2~4], 能够合成聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate, PHA), 为后续好氧/缺氧条件下脱氮、除磷提供碳源与能源. Tian等[5]在其研究中讨论了碳源调控磷回收模式, 研究了同步硝化反硝化[以polyhydroxybutyrate (PHB)做电子供体的反硝化], 提出了新的脱氮除磷脱碳模式.在好氧或者缺氧利用硝酸盐作为电子受体, 能够利用PHB和糖原物质进行反硝化和除磷的微生物叫反硝化聚磷菌和反硝化聚糖菌[6~8]. Lei等[2]和Wang等[9]研究内源碳驱动生物脱氮除磷, 在低C/N比的条件内源碳同时硝化反硝化(部分反硝化)脱氮除磷.有研究报道聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)作为电子来实现反硝化或者部分反硝化[10, 11].有研究认为PHA还可以作为一种能量贮存物质或者能量库, 能够更好地抵御外界的压力[12, 13].课题组在研究脱氮除磷发现, 采用传统的生物脱氮除磷工艺很难达到理想的同时脱氮、除磷效果, 而如果通过传统的投加甲醇、乙酸钠等外加碳源方式来提高脱氮除磷的效果, 不仅会增加污水处理的成本, 也会造成污水中磷资源的浪费, 从而建立与开发以污水磷回收、同时脱氮除磷的新工艺——碳源调控/磷回收强化脱氮除磷工艺(BBNR-CPR).通过磷回收过程在BBNR-CPR系统(生物质)内贮存聚羟基烷酸酯(PHA), 为提高系统脱氮除磷提供补充性碳源.
温度是影响微生物活动的主要因素.通常温度低于15℃便是低温[14, 15], 低温不利于微生物的代谢活动, 还会影响基质等传质的效率.温度降低会造成和脱氮相关的硝化作用及反硝化作用显著下降[16].然而有研究发现低温对聚磷菌并无影响, Helmer等[17]利用中试规模的连续流活性污泥系统, 研究温度在5~20℃变化时系统的除磷效果, 结果发现, 在水温为5℃时, 虽然厌氧段释磷量减少, 但好氧段的吸磷量仍维持在较高的水平, 系统出水TP效果达标.
由于无论在缺氧或者好氧条件下, 脱氮除磷反应器中的混合菌群能够利用外源碳或者内源碳进行反硝化脱氮, 由于脱氮与PHA含量正相关, 因此可以推测生物体内大量贮存的PHA可能减缓温度的下降对脱氮效果的影响.然而, 当前研究主要集中于微生物合成PHA的最佳条件[18~20], 而未见有关贮存PHA的微生物在低温条件下脱氮除磷的报导.本研究的目的是探究温度对BBNR-CPR反应器脱氮除磷的影响; 分析BBNR-CPR反应器中合成PHA的功能菌群; 用间歇实验研究反应器生物膜预贮存PHA的耐低温特性, 以期为在低温条件下提高BNR系统的运行效果提供理论与经验参考.
1 材料与方法 1.1 生物反应器及进水组成本实验采用课题组自主研发的碳源调控磷回收强化生物脱氮除磷(biological bio-nutrient removal-carbon regulation and phosphorus recovery, BBNR-CPR)反应器.反应器为石英砂+火山岩组合式填料的生物滤池, 内直径为100 mm, 正常运行实际高度为1.3 m. BBNR-CPR反应器装置参照之前研究[1, 5].反应器的进水为模拟生活污水, 模拟生活污水的组成及其浓度：TP(15.9~16.9 mg·L-1)、NH4--N(48~60 mg·L-1)、乙酸钠配制的COD(180~200 mg·L-1)、MgSO4·7H2O(70 mg·L-1)、KCl(40 mg·L-1)、NaHCO3(200 mg·L-1)、CaCl2(20 mg·L-1)、FeCl3(2 mg·L-1).
1.2 反应器运行方式反应器接种污泥取自松江污水厂二沉池.生物滤池的厌氧/好氧周期为8 h, 厌氧阶段时长3 h和好氧阶段时长5 h.在厌氧阶段, 进水箱中贮存的模拟生活污水经恒流泵打入生物滤池, 出水回流进入中间水箱; 在好氧阶段, 采用空压机曝气, 废水自中间水箱由隔膜泵提升进入生物滤池的下端, 起始2 h出水回流至中间水箱, 最后好氧3 h出水直接外排.厌氧/好氧交替型生物滤池每运行7 d进行一次磷回收.进行磷回收操作时, 在厌氧条件下, 向生物滤池泵入含有高浓度碳源的磷回收液(由丙酸钠配制的COD 2 000 mg·L-1的溶液), 刺激生物膜体内释放出大量的磷酸盐, 并同时在生物膜内贮存高水平的PHA[21].
1.3 预贮存PHA的生物膜耐低温的实验采用厌氧/好氧间歇实验研究预贮存PHA的生物膜耐低温的特性.当反应器运行140 d时, 在BBNR-CPR反应器距底部进水端0.7m处取出(环境温度为12℃±2℃)分别在不同温度(8、15和25℃)进行间歇实验.间歇实验在恒温摇床(ZHWY-211B, 上海)进行, 每组间歇实验做4个平行样, 并确保样品的条件一致, 即, 每个血清瓶(250 mL)含有0.3g生物膜, 投加100 mL已配好的反应溶液, 保证反应过程MLSS为3 000 mg·L-1.
本实验分为：①厌氧条件在生物膜内预先贮存PHA、②在好氧条件下利用贮存PHA的生物膜, 进行无外加碳源的好氧除磷、反硝化实验.实验①中, 配制COD浓度约1000 mg·L-1的乙酸钠反应溶液, 不加入氮磷等营养元素, 其它矿物元素与反应器进水含量相同, 然后向血清瓶中加入反应液和生物膜并向瓶内持续鼓入氮气15 min, 加盖密封, 反应12 h.每间隔一定时间采用针管取水样测定COD, 总磷(TP).厌氧反应结束后测定生物膜内PHA含量.实验②中, 仅利用实验①中预先贮存PHA的生物膜进行脱氮除磷, 反应溶液内含有24 mg·L-1氨氮, 16 mg·L-1硝酸盐氮, 16 mg·L-1总磷, 其它矿物元素与实验①相同.实验②的反应连续进行3轮(每轮24 h), 每一轮反应结束后, 取出生物膜清洗离心后向血清瓶内加入相同的好氧反应溶液, 继续下一轮的好氧反应.每一轮的PHA都被消耗掉, 形成了生物膜贮存PHA高、中、低3个反应水平.每一轮好氧反应末需要测定生物膜内残留PHA含量.
1.4 主要水质参数分析方法测量的指标有TP、COD、TN、NH4+-N、NO3--N、PHA, 所取样品测量前需经过0.45 μm滤膜过滤. TP采用过硫酸钾消解钼酸铵显色紫外分光光度法, 测定COD采用微波消解滴定法测定, TN采用碱性过硫酸钾消解分光光度法测定(HJ 636-2012), NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法(HJ 636-2009), NO3--N采用紫外分光光度法测量[22]. PHA的测定方法参考文献[23], 生物膜内PHA组分的测定, 则采用10%浓硫酸的酸化甲醇作为酯化液, 用苯甲酸钠作内标建立标准曲线; 采用日本Shimadzu公司的QP-2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和DD-5型色谱柱测定, 测得数据通过与美国国家标准局数据库(NIST11)质谱比对获得PHA含量与组分.
1.5 16S rRNA微生物物种组成分析使用AxyPrepDNA提取盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, U. S)提取生物膜样品DNA, 并用1%琼脂糖凝胶电泳检测.采用细菌通用引物为515F-907R对细菌16S核糖体RNA的V4-V5区域进行PCR扩增. PCR扩增采用95℃高温变性3 min, 25次循环(95℃ 30 s; 55℃退火30 s; 72℃ 45 s), 最后72℃延伸10 min.对PCR扩增结果进行产物确认扩增条带大小与浓度后, 上机建库测序.经过DNA提取和PCR扩增, 采集样品的扩增子由上海美吉生物医药科技有限公司(中国, 上海)在MiSeq PE300平台(Illumina Inc., CA, US)进行高通量测序.并将序列数据在NCBI SRA数据库获得序列编号.
对所有序列进行OTU(operational taxonomic units)划分, 在97%的相似水平下对OTU进行生信分析[Usearch(version 7.0, http://drive5.com/uparse/)], 分别在各个分类水平：domain(域)、kingdom(界)、phylum(门)、class(纲)、order(目)、family(科)、genus(属)、species(种)统计样本的群落组成.采用I-Sanger云平台(上海美吉生物医药科技有限公司)进行数据分析.
2 结果与讨论 2.1 反应器长期运行效果图 1分别表示反应器运行阶段运行150 d实验室环境温度变化、反应器的进出水总磷、氨氮、总氮浓度.反应器中的生物膜驯化培养10 d左右, 反应器出水总磷、氨氮、总氮浓度趋于稳定.驯化阶段, 氨氮进水浓度30 mg·L-1左右, TP进水浓度15.9 mg·L-1, 进水COD浓度200 mg·L-1, 待反应器趋于稳定, TP和COD进水浓度不变, 进水氨氮浓度由30 mg·L-1升至48 mg·L-1、60 mg·L-1, 以便富集反应器内硝化与反硝化菌群.
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图 1 BBNR-CPR反应器长期运行效果 Fig. 1 Effect of long-term operation of the BBNR-CPR reactor |
图 1(b)为反应器除磷效果, 在反应器稳定运行阶段, 反应器除磷基本不受温度影响, 反应器进水总磷平均浓度为(16.40±0.90) mg·L-1, 出水总磷平均浓度为(1.45±1.00) mg·L-1, 总磷平均去除率为91.20%±6.02%. 图 1(c)和图 1(d)表明, 随着温度的降低, 氨氮与总氮的去除率也逐渐下降; 反应器进水氨氮平均浓度为(53.47±5.11) mg·L-1, 在常温条件下(22℃±2℃), 氨氮出水平均浓度为(2.23 ±3.17) mg·L-1, 平均去除率达到了96.06%±5.38%, 总氮平均去除率65.28%±11.03%;而在低温条件(12℃±2℃), 反应器氨氮出水平均浓度为(10.16±6.69) mg·L-1, 氨氮平均去除率为81.10%±11.89%, 总氮的平均去除率为58.62%±11.04%.常温(22℃±2℃)条件下, 氨氮的去除率在84.31%~100%变化, 总氮的去除率在58.71%~92.78%变化; 低温条件(12℃±2℃), 氨氮去除率在75.17%~99.96%之间变化; 总氮去除率在40.11%~82.43%之间变化.对比常温时运行效果可以看出, 在低温条件下, 总磷的去除效率基本不变, 但是氨氮的平均去除率下降了14.96%, 总氮的平均去除率下降了7%, 氨氮去除率在上述运行结果表明, 低温对硝化过程影响较大, 而对反硝化效果影响较小.但总体来讲, BBNR-CPR反应器在低温阶段, 低C/N比条件下能够稳定运行.
2.2 不同温度条件下生物膜功能菌群组成分析如图 2所示, Innoc.是松江污水处理厂菌群物种组成, A、B、C、D和E分别是在反应器运行30、60、90、110和140 d的菌群物种组成, 获得不同温度条件下生物膜菌群物种的相对丰度数据的热图(图 2).
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图 2 不同温度条件下生物膜菌群优势物种的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of the dominant species of the biofilm under different temperature conditions |
从图 2可知, 在研究阶段, 生物膜内的优势种群的类别及其丰度发生较大程度的转变.接种污泥内的优势菌群(为活性污泥内常见菌群构成), 如Anaerolineaceae_norank、Dokdonella、Dechloromonas、Nitrosomonas、Nitrospira、Zoogloea的丰度随着温度的降低而不断下降, 而生物膜内种属Candidatus_Competibacter、Candidatus_Accumulibacter、Run-SP154、Thauera、Candidatus_Nitrotoga的相对丰度随着温度的降低而不断升高, 成为优势物种.其中, 菌属Candidatus_Accumulibacter是污水处理系统中常见的聚磷菌(phosphorus accumulating organsim, PAO)[24], 而菌属Run-SP154、Zoogloea以及菌属Candidatus_Competibacter的部分物种也具有吸磷功能.用图 2中E阶段的生物膜做间歇实验, 此时, BBNR-CPR反应器生物膜内Candidatus_Competibacter属的丰度最高. Candidatus_Competibacter属中属于γ变形菌纲的Candidatus_Competibacter phosphatis已被证实也具有合成和水解聚磷酸盐的能力[25].作为聚磷菌, 这些种属都具有合成PHA的功能.典型的反硝化菌陶厄氏菌属(Thauera), 动胶菌属(Zoogloea)均可以利用外碳源进行反硝化, 且均可以合成PHA[26].此外, 随着温度的降低, 接种污泥中原本丰度较高的氨氧化菌(如Nitrosomonas)以及亚硝酸盐氧化菌(如Nitrospira)的丰度不断下降, 与此同时具有硝化功能的Candidatus_Nitrotoga的丰度却不断升高. Candidatus_Nitrotoga是一种耐低温的亚硝酸盐氧化菌(NOB), 属于β变形菌纲[27, 28].运行时间和温度是引起微生物种群的变化的主要因素, 反应器的运行时间变长, 使得具有脱氮除磷功能细菌不断富集; 因为温度的降低, 才会使得反应器中的功能细菌随着温度下降而适应这种温度的变化, 至低温阶段, 反应器里富集了具有耐低温的硝化细菌和反硝化细菌.当然, 微生物逐渐适应环境, 是会改变种群; 如BBNR-CPR反应器逐渐适应低温, 适应较高的氨氮浓度, 适应低C/N比; 这些因素都会促进反应器微生物的功能种群的变化, 但这些变化都是有利于反应器系统中的菌群结构更加稳定.比如, 随着氨氮浓度的提高, 硝化细菌的丰度也会提高, 具有硝化功能的细菌的种类及其丰度也会增加.由于BBNR-CPR反应器在低温条件下仍然具有较好的氨氧化以及脱氮能力, 因此推测, 反应器生物膜内存在部分能够氨氧化的物种来保障低温硝化效果, 需要采用宏基因组等其他方法辨别这些耐低温型AOB物种.通过碳源调控磷回收的方式, 使得反应器中具有合成PHA的功能菌群的物种相对丰度不断提高, 使得反应器内生物膜具有贮存PHA能力.
2.3 混合菌群厌氧预贮存PHA图 3是在厌氧条件下, 生物膜吸收COD的量以及厌氧末生物膜内贮存的PHA的量.进水COD浓度控制在1 000 mg·L-1左右.
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图 3 不同温度混合菌群贮存内源碳 Fig. 3 Storage of endogenous carbon by mixed growth microbial community at different temperatures |
如图 3所示, 3个温度(25、15和8℃)条件下, 在厌氧吸收碳源(乙酸钠)12 h后, 生物膜对乙酸钠吸收率分别为54.91%、49.37%和45.68%, 与25℃条件相比, 在8℃条件, 生物膜对COD吸收率下降了约10%, 说明低温首先会影响微生物对VFA的吸收[20], 推测生物膜内菌群在低温条件下吸收碳源速率下降, 需要较长的时间来适应这种低温的反应条件[29]; 此外, 低温下, 微生物需要耗费更多能量来源维持基本生命活动. 3个温度条件下合成的PHA含量分别占生物膜干重的16.24%、11.49%和9.01%.与Jiang等[18]和Johnson等[20]研究SBR反应器内混合菌群PHA的累积量与温度的关系相比, 实验结果较为一致, 即PHA的含量随着温度的升高而增加.而Pittmann等[30]研究了仅在20℃菌群产生PHA的累积量最高, 并且PHB高于PHV, 而提高与降低反应温度都会降低PHA的累积量.通过厌氧间歇实验发现, 在控制进水碳源浓度(COD浓度1 000 mg·L-1)、合成PHA时间一致的条件下, PHA的合成受低温的影响.
2.4 温度和PHA含量对混合菌群好氧同步脱氮除磷的影响图 4表示间歇实验, 在不同温度和PHA含量条件下, 生物膜在持续好氧过程对反应溶液中的氮、磷去除情况.
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图 4 不同温度和不同PHA含量对脱氮除磷的影响 Fig. 4 Effect of different temperatures and PHA contents on the nitrogen and phosphorus removal |
图 4(a)表明不同温度条件下(8、15和25℃)反应溶液内总磷浓度变化. 3个温度的总磷下降趋势大致相同.在高PHA水平, 反应过程中的总磷的去除率分别达到了97.46 %、100%和100%.反应至中PHA水平, 混合菌群仍然表现出较强的吸磷作用, 总磷的去除率分别达到了74.74%、87.29%和81.71%.而在低PHA水平总磷的去除率分别为11.39%、35.02%和38.08%, 主要原因是生物膜内PHA含量低.整个反应过程的吸磷基本不受温度影响.
图 4(b)表示间歇实验中好氧过程中总氮含量的变化, 在无外加碳源的条件下, 混合菌群可以利用PHA作为反硝化碳源和能量进行反硝化.且在高PHA水平, 温度为8、15和25℃时, 总氮去除率分别达到了55.15%、82.55%和95.89%; 8℃反应过程总氮去除率不高的原因是菌群贮存的PHA含量较低, 没有充足的PHA作为反硝化碳源, 因而消耗的PHA量也较低; 中PHA水平, 3个温度下的总氮含量表现出较大差异, 主要原因是PHA含量不同所带来的差异; 低PHA水平, 3个温度条件下的总氮的下降趋势大致相同, 基本无反硝化现象.分析图 4(b)和4(d)中高PHA水平, BBNR-CPR反应器的反硝化细菌(反硝化聚磷菌, 反硝化聚糖菌等)可以利用硝酸盐作为电子受体以及PHB作为电子供体进行反硝化脱氮, 与之前的研究结果相似[5].低温条件(≤15℃)下, 反应过程中有较明显的脱氮除磷效果.与Liu等[14]在研究低温(15℃)下发现反硝化聚磷菌(DNPAOs)具有很好的耐低温特性, 能够维持SBR系统的同时脱氮除磷效率的结论一致.说明微生物在低温条件进行厌氧反应并贮存PHA, 在好氧过程中能够同时除磷、反硝化.
图 4(c)是反应过程氨氮浓度的变化, 在PHA贮存量较高(高、中2个水平条件下), 氨氮的去除和除磷、反硝化的趋势相同; 但低温(8℃和15℃)氨氮的去除比高温(25℃)差, 主要原因是低温条件下合成的PHA含量较低; 还可能是硝化细菌的活性受温度影响较大.有研究报道氨氧化细菌对温度变化非常敏感[29, 31, 32], 低温会抑制硝化细菌的活性和降低硝化作用率.从高PHA水平实验结果来看, 即使在低温条件(15℃)生物膜仍然具较强的硝化能力, 可以表明贮存的PHA可以减缓低温的抑制; 还可能是生物膜中存在低温硝化功能菌群和低温反硝化菌群; 由本文2.2节中分析结果表明, 生物膜中存在具有硝化功能的Nitrotoga或者反硝化功能菌群Thauera, 这两类细菌都具有抵抗低温环境的特性; 此外, 由于反硝化细菌能够及时通过反硝化作用去除亚硝态氮, 减缓亚硝酸盐的抑制, 有利于硝化反应的正常进行.
结合图 4中各实验结果表明, 混合菌群在贮存了PHA的前提下, 能够很好地利用内源碳进行除磷、反硝化, 营养元素的去除在3组温度条件下的变化趋势相同.对比高、低PHA水平, 结合3组温度下的反硝化除磷结果, PHA含量是影响脱氮除磷的主要因素; 在高PHA水平, 即使在低温条件, 混合菌群也保持着良好的除磷和反硝化能力, 说明贮存了PHA的混合菌群具有耐受低温的特性.
2.5 混合菌群在不同温度条件下PHA含量变化图 5(a)表示3个好氧周期后的生物膜中的残余PHA含量, 图 5(b)表示每一轮好氧反应消耗PHA的量.
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图 5 PHA含量的变化 Fig. 5 Changes in the content of PHA |
分析图 5(b), 第一轮好氧反应阶段的PHA变化, 可以发现3个温度的条件下消耗的PHA含量大致相同, 8、15和25℃这3个温度条件在高PHA水平消耗PHA量分别占生物膜干重的6.19%、8.65%和7.86%;分析0~24 h好氧过程(高PHA水平), 温度为8、15和25℃时总磷的去除率分别达到了97.46 %、100%和100%, 总氮去除率分别达到了55.15%、82.55%和95.89%, 磷和氮都有明显的去除趋势(除总氮在8℃条件外, 主要原因是8℃合成的PHA低, 消耗的PHA也低); 可以发现混合菌群除磷和反硝化能力与PHA含量密切相关.此外, 15℃和25℃反应条件, PHA充足, 混合菌群率先利用PHB, 然后消耗PHV, 说明分子量小的PHB比PHV更容易被微生物吸收利用.此外, 混合菌群经0~24 h的好氧脱氮除磷后, 仍然能够利用体内贮存的残留PHA维持新一轮(24~48 h)的脱氮除磷反应.然而, 微生物在15℃和25℃条件的脱氮除磷效率仍可以维持较高的水平, 但在8℃条件下, 尽管微生物体内贮存一定量的PHA, 但此时PHA的消耗量也很少, 这些能源物质很有可能优先被用于维持微生物新陈代谢所需的基本能量, 而不足以提供满足反硝化所需的碳源与能量. BBNR-CPR反应器碳源调控磷回收的运行方式, 能够合成富集大量的具有贮存PHA能力的功能菌群, 并通过厌氧磷回收合成大量的PHA抵御低温的影响.反应器贮存足够的PHA是反应器能够在耐受低温冲击的重要原因.
3 结论(1) 通过实施反应器碳源调控-磷回收的运行方式, BBNR-CPR反应器在低温(≤15℃)、低C/N比条件也能够维持较好的除磷、脱氮效率.
(2) 随着温度的降低、反应器运行时间的增加, BBNR-CPR反应器内具有脱氮除磷功能种属(Candidatus_Competibacter、Candidatus_Accumulibacter、Run-SP154、Thauera、Candidatus_Nitrotoga)的相对丰度不断升高, 成为低温条件下的优势种属; 这些种属都具有贮存PHA的功能.
(3) 采用低温运行时反应器的生物膜进行间歇实验, 发现在进水碳源浓度、反应时间一致的条件下, 低温会降低PHA的合成量.
(4) 研究BBNR-CPR反应器的混合菌群在不同PHA水平的耐低温能力, 发现生物膜的PHA预贮存量较高时, 具有较好的脱氮除磷效率, 能够降低温度对脱氮除磷的影响.
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