环境科学  2019, Vol. 40 Issue (4): 1680-1687   PDF    
雾-霾天人体平均呼吸高度处不同粒径气溶胶的微生物特性
杨唐1,2, 韩云平1,2, 李琳1,2, 刘俊新1     
1. 中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室, 北京 100085;
2. 中国科学院大学, 北京 101408
摘要: 粒径分布和微生物种群结构是雾-霾天气溶胶与人体健康密切相关的典型特征.采用安德森六级采样器在人体平均呼吸高度(近地面1.5 m)处对北京某地雾-霾天及晴天分别进行气溶胶样品采集,从不同粒径气溶胶中的可培养细菌、真菌浓度及种群结构角度展开研究.结果表明,雾-霾天不同粒径气溶胶中可培养微生物浓度呈现不均匀分布状态;不同粒径气溶胶中微生物浓度、种群结构差异性均明显高于晴天.雾-霾天条件下,在粒径大于3.3 μm的气溶胶中,芽孢杆菌(Bacillus sp.)占据优势地位,在粒径小于3.3 μm的气溶胶中,芽孢杆菌(Bacillus sp.)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)占优势地位.而当雾-霾过后,解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在所有粒径的生物气溶胶中均占优势地位.雾-霾天条件下,在粒径大于3.3 μm的气溶胶中共检出5种优势真菌,分别是链格孢菌(Alternaria sp.)、意大利青霉(Penicillium italicum)、蓝状菌(Talaromyces stollii)、枝孢菌(Cladosporium sp.)和Davidiella sp.;而当雾-霾过后,仅链格孢菌(Alternaria sp.)被检测为优势菌.无论雾-霾天还是晴天,在粒径小于3.3 μm的气溶胶中真菌均主要以意大利青霉(Penicillium italicum)和蓝状菌(Talaromyces stollii)为主.在人体平均呼吸高度处,雾-霾天与晴天不同粒径气溶胶中微生物浓度和种群结构存在明显差异.雾-霾天人体平均呼吸高度处微生物浓度高、且种群结构较为复杂,其微生物特性对人体健康的潜在风险不容忽视.
关键词: 雾-霾天      生物气溶胶      呼吸高度      粒径分布      种群结构     
Microbial Properties of Different Size Aerosols at Human Average Respiratory Height During Fog-haze Days
YANG Tang1,2 , HAN Yun-ping1,2 , LI Lin1,2 , LIU Jun-xin1     
1. Department of Water Pollution Control Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China
Abstract: Size distribution and microbial population structure are typical characteristics of bioaerosols that are relevant to human health. The concentrations and population structure of bioaerosols associated with size-segregated airborne particulate matter at human average respiratory height were studied using a 6-stage Andersen impactor during and after fog-haze days in the area of Beijing. The results showed that the size distribution of the cultured microbial populations was uneven during fog-haze days, and that the microbial concentration and the difference in the population structure of the size-segregated airborne particulate matter were higher during than after the fog-haze days. During the fog-haze days, Bacillus sp. was the dominant bacteria present in bioaerosols of >3.3 μm, whereas Bacillus sp. and Bacillus amyloliquefaciens were the dominant bacteria in bioaerosols of < 3.3 μm. In contrast, after the fog-haze days, Bacillus amyloliquefaciens was dominant in all the bioaerosol sizes. Five species (Alternaria sp., Penicillium italicum, Talaromyces stollii, Cladosporium sp., and Davidiella sp.) were detected as the dominant fungi in the bioaerosols >3.3 μm during the fog-haze days, and only Alternaria sp. was detected in the bioaerosols >3.3 μm after fog-haze. Penicillium italicum and Talaromyces stollii were also detected in the bioaerosols of < 3.3 μm during and after the fog-haze. There were significant differences in the concentration and population structure of the size-segregated airborne particulate matter at human average respiratory height collected during and after the fog-haze days. The high concentration of microorganisms and the relatively complex population at human average respiratory height on haze days indicate that the potential risks of the microbiological characteristics of the bioaerosols to human health cannot be ignored.
Key words: fog-haze day      bioaerosols      respiratory height      size distribution      population structure     

近年来随着空气污染的日益严重, 越来越多的学者开始关注雾-霾[1~3].有研究已经证实, 雾-霾的形成与大气中不同粒径颗粒物的浓度密切相关[4~9].更为重要的是, 有研究证实颗粒物的粒径大小导致其在肺部的沉降位置和速率不同[10~13].例如, 1~5 μm的颗粒物主要粘附于气管、支气管、细支气管; 而小于1 μm的颗粒物在肺泡里的沉积效率最高[13], 颗粒物的这种沉降差异也将直接导致其对人体健康影响的不同.因此, 世界卫生组织在2015年将颗粒物列为了全球对人体健康具有危害的污染物之一, 并称其和抽烟对人体造成的危害相当[14].

近年来越来越多的研究发现, 在雾-霾天颗粒物中, 除化学组分之外, 微生物也是重要的组分之一, 这些包含微生物等活性成分的颗粒物被称之为生物气溶胶[12].采用培养及分子生物学技术等, 对户外气溶胶中微生物组分的研究已逐步展开[15~18].结果表明, 户外气溶胶中微生物种群具有多样性及复杂性; 气溶胶的浓度已不是决定其危害的唯一因素, 微生物种群结构也同等重要[18], 尤其是在人体平均呼吸高度处(近地面高度1.5 m处)[19, 20].有研究对雾-霾天1.5 m处总颗粒物进行采集并分析其微生物种群结构, 结果发现, 雾-霾天气与雾-霾过后的气溶胶中总微生物种群存在明显差异[21].目前关于这种差异性还仅体现在气溶胶总微生物种群上, 不同粒径气溶胶中微生物种群在雾-霾天及过后是否存在差异仍不明确, 揭示雾-霾天人体平均呼吸高度处不同粒径气溶胶中微生物种群特征, 将对于探明雾-霾天气溶胶对人体健康的危害以及对其进行进一步防护具有重要的理论及现实意义.

基于此, 本研究采用安德森六级采样器, 分别在雾-霾天及雾-霾过后人体平均呼吸高度处采集气溶胶样品, 采用克隆文库技术分析其种群结构.通过比较不同气象条件下人体平均呼吸高度处不同粒径气溶胶中微生物的浓度及组成特征, 初步揭示气象条件对人体平均呼吸高度处不同粒径气溶胶中微生物浓度、种群结构的影响, 以期未来对气溶胶的危害潜力及控制技术提供理论基础.

1 材料与方法 1.1 采样地点及生物气溶胶的采集

本研究的采样地点位于北京市(经度:116.34°E, 纬度:40.01°N).根据《气象标准汇编》(QX/T 113-2010)中霾观测的辨识条件, 以能见度和相对湿度数据作为参考, 区分雾-霾天和晴天.采样于2016年1月1~4日(雾-霾天)和2016年1月4~6日(晴天)进行.雾-霾天每次采样时间为3 min, 采样间隔为57 min, 每天总采样持续时间为8 h; 晴天每次采样时间为3 min, 采样间隔为57 min, 每天总采样持续时间为12 h, 采样间隔中进行样品储存、采样器酒精消毒和培养基准备等.采样器选择安德森六级撞击式采样器(228~9 530 K, SKC Gulf Coast Inc., USA), 采样点设置于人体平均呼吸高度(近地面1.5 m高度)处(图 1).细菌和真菌分别采用LB培养基和孟加拉红培养基(Aobo xing Biotech, Co., China)培养.样品采集过程中选用安德森六级撞击式采样器配套气泵, 流量为28.3 L·min-1, 采集的粒径分布范围[19]为:>7、4.7~7.0、3.3~4.7、2.1~3.3、1.1~2.1和0.65~1.1 μm.采样前, 采样器所有部件均进行高温灭菌.细菌和真菌各设置2个平行采样器同时采集, 最终结果为2次平均数, 单位为每立方米空气中的菌落数(CFU·m-3).共收集到雾-霾天细菌和真菌不同粒径的样品288个, 晴天样品细菌和真菌不同粒径的样品285个.细菌在30℃下培养24 h, 真菌在30℃下培养7 d.采用正孔校正法确定菌落数浓度[18].

图 1 采样器设置示意 Fig. 1 Schematic of the sampling setup

采样期间, 实时观测气象条件如表 1所述.温度和湿度采用温湿度计(WD~35612, Oakton, Germany)进行记录, 风速和光照度采用便携式风速仪(HD2303, Delta Ohm, Italy)和手持式照度计(HD2302.0, Delta Ohm)进行记录.采样期间, 中国国家气象局发布的实时PM2.5浓度和24 h平均浓度如图 2所示.

表 1 采样期间的气象条件参数 Table 1 Meteorological parameters on the sampling dates

图 2 采样期间PM2.5质量浓度的变化 Fig. 2 Variation of the PM2.5 mass concentration on the sampling dates

1.2 DNA提取和聚合酶链式反应(PCR)扩增

培养后, 使用1.5 mL的1×磷酸缓冲盐溶液冲洗每个培养基表面, 同时使用三角刮刀刮涂[18].为了保证足够的微生物量, 收集可培养的菌液, 分别将雾-霾天气和晴天内的同一粒径的样品混合均匀.在无菌条件下, 采用核酸自动提取仪(TanBead, Chinese Taipei)分别提取其总DNA, 并采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取纯度.共得到24个细菌DNA样品和24个真菌DNA样品.细菌和真菌通用引物F16S-27/R16S-1492[22]和ITS1/ITS4[23], 分别用来扩增细菌16S rDNA片段和真菌ITS片段. PCR扩增[21]和测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行.

1.3 构建克隆文库

经手动去除载体序列后, 分别采用Bellerophon (http://greengenes.lbl.gov/)进行嵌合体筛除和DNAMAN软件进行序列相似性分析, 将相似度高于97%的序列归并为一个操作单元(OTU), 然后挑选每个操作单元的代表性序列在NCBI基因库中进行序列比对, 获得生物气溶胶微生物组成结构.克隆文库的覆盖度(C)和多样性(Shannon index, H)分别采用公式(1)和公式(2)进行计算.

(1)

式中, N指16S rDNA克隆文库的库容; n1指在16S rDNA克隆文库中仅出现一次的OTUs的数量; C值大于等于75%方可认为挑取的克隆数足以反映真实的群落结构.

(2)

式中, Pi指第i个OTU在克隆文库库容中所占的比例; S表示克隆文库中OTUs的总数目.

1.4 数据统计分析

微生物种群多样性热图、非参度量多维统计分析(NMDS)和相似性分析(SIMPER、ANOSIM)采用R语言进行统计分析, 描述性统计参数(paired t-test)采用SPSS 21.0计算.

2 结果与分析 2.1 人体平均呼吸高度处不同粒径气溶胶中细菌和真菌的浓度变化特征

对雾-霾天及其雾-霾过后晴天人体平均呼吸高度处不同粒径气溶胶中细菌、真菌浓度进行分析, 结果如图 3所示.细菌和真菌浓度在各个粒径气溶胶范围内, 均呈现雾-霾天高于晴天的趋势(paired t-test, P=0.031).在雾-霾天条件下, 细菌、真菌浓度在不同粒径气溶胶中都呈现不均匀分布状态.对于细菌浓度而言, 在雾-霾天条件下, 细菌气溶胶浓度随粒径降低呈先降低后升高趋势.在粒径>7.0 μm的气溶胶中, 细菌浓度为107~843 CFU·m-3; 随着粒径减小, 细菌浓度逐渐呈升高趋势, 当粒径为2.1~3.3 μm时, 其中细菌浓度可高达922 CFU·m-3.但是, 但雾-霾消散后, 晴天不同粒径生物气溶胶中细菌浓度基本保持平均分布状态, 最高浓度也仅为166 CFU·m-3.

图 3 不同粒径生物气溶胶中微生物浓度 Fig. 3 Concentrations of microorganisms associated with the size-segregated bioaerosols

相对细菌浓度而言, 真菌浓度在不同粒径气溶胶中的分布趋势则略有差异, 尤其是在雾-霾天气条件下.随着气溶胶粒径减小, 真菌浓度呈现先升高后降低的趋势.在4.7~7.0、3.3~4.7和2.1~3.3 μm的气溶胶中, 其浓度分别为35~261、11~346和35~333 CFU·m-3.而当雾-霾消散后, 不同粒径气溶胶中真菌浓度较低, 最高浓度也仅为100 CFU·m-3.

结合中国国家气象局空气质量实时预报(图 2)和《环境空气质量标准》(GB 3095-2012), 可以看出, 本研究过程中, 雾-霾天期间, PM2.5的24 h平均浓度均超过了150μg·m-3, 为重度污染; 而晴天的PM2.5的24 h平均浓度低于75μg·m-3, 为优或良.综合以上结果说明, 当空气中颗粒物浓度较高时, 近地面处气溶胶中微生物的浓度也相应大幅度增高.

2.2 人体平均呼吸高度处不同粒径气溶胶中细菌、真菌种群特征

采用克隆文库技术对人体平均呼吸高度处气溶胶中细菌及真菌种群进行了研究, 总共获得1 500个细菌OTU和900个真菌OTU, 所有文库的覆盖度均大于90%, 证明本研究构建的克隆文库提供了准确可靠的微生物种群特征.

2.2.1 细菌种群结构

可培养细菌种属检测结果(图 4图 5)表明, 与气溶胶中细菌浓度相对应, 在粒径大于7.0 μm和小于2.1 μm的气溶胶中, 雾-霾天细菌多样性明显高于晴天.雾-霾天条件下, 粒径大于7 μm的气溶胶中, 检出的芽孢杆菌属分别为31.48%的芽孢杆菌(Bacillus sp.)、15.87%的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和9.52%的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium); 当雾-霾消散后, 同样在粒径大于7 μm的气溶胶中检出的为2.09%的芽孢杆菌(Bacillus sp.)、29.17%的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和2.09%的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis), 而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)则均未检出.粒径在1.1~2.1 μm的气溶胶中, 雾-霾天和晴天均检出4种芽孢杆菌细菌; 粒径在0.65~1.1 μm的气溶胶中, 雾-霾天和晴天则分别检出5种和4种芽孢杆菌属细菌.而在粒径介于2.1~7.0 μm的气溶胶中, 细菌多样性则呈现相反特征.粒径在4.7~7.0 μm的气溶胶中, 雾-霾天仅检出两种芽孢杆菌细菌, 分别为34.71%的芽孢杆菌(Bacillus sp.)和27.27%的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens); 而晴天共检出4种, 分别为29.16%的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、16.67%的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、10.42%的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和2.09%的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).粒径3.3~4.7 μm的气溶胶中, 雾-霾天和晴天分别检出4种和6种芽孢杆菌属的细菌.

图 4 不同粒径生物气溶胶中细菌分布热图 Fig. 4 Heat-map of the bacteria associated with the size-segregated bioaerosols

图 5 芽孢杆菌属细菌在不同粒径生物气溶胶中的相对比例 Fig. 5 Relative proportions of Bacillus associated with the size-segregated bioaerosols

对不同气象条件下气溶胶中细菌结构相似性进行分析, 结果如图 6所示.根据相似性百分数分析(SIMPER)进行组间比较, 发现雾-霾天和晴天的细菌结构存在较高的差异性, 差异度为72.88%(Global Test; R=0.243; P=0.006).雾-霾天各粒径气溶胶的细菌结构相似性为30.18%(ANOSIM), 雾-霾消散后, 各粒径气溶胶的细菌结构的相似度则更高, 为51.43%, 说明雾-霾天气溶胶中细菌种群结构更为复杂.

图 6 生物气溶胶中细菌NMDS分析结果 Fig. 6 Result of nonmetric multidimensional scaling ordination (NMDS) of the bacteria in the bioaerosols

2.2.2 真菌种群结构

真菌检测结果表明, 在所有粒径气溶胶中, 雾-霾天真菌多样性明显高于晴天(图 7).雾-霾天, 在粒径大于7.0 μm的气溶胶中, 检出6种真菌, 分别是47.37%的链格孢菌(Alternaria sp.)、22.63%的子囊菌(Pezizomycotina sp.)、20.00%的球囊霉菌(Glomus sp.)、5.00%的Davidiella sp.、2.50%的枝孢菌(Cladosporium sp.)和2.50%的意大利青霉(Penicillium italicum); 在粒径为4.7~7.0 μm的气溶胶中, 检出4种真菌, 分别是47.12%的链格孢菌(Alternaria sp.)、33.32%的意大利青霉(Penicillium italicum)、10.87%的Davidiella sp和8.70%的枝孢菌(Cladosporium sp.); 在粒径为3.3~4.7 μm的气溶胶中, 检出3种真菌, 分别是56.34%的的枝孢菌(Cladosporium sp.)、36.53%的Davidiella sp.和4.76%的腐皮镰刀菌(Fusarium solani).而当雾-霾消散后, 在同样这3级粒径气溶胶中, 检出的均为链格孢菌(Alternaria sp., 100%).当气溶胶粒径小于3.3 μm时, 晴天气溶胶中真菌多样性有所增加, 并且两种气象条件下优势真菌种属逐步趋于一致.在粒径为2.1~3.3 μm的气溶胶中, 意大利青霉(Penicillium italicum)在雾-霾天和晴天均占据优势地位; 在粒径为0.65~1.1 μm的气溶胶中, 意大利青霉(Penicillium italicum)和蓝状菌(Talaromyces stollii)是其优势真菌.

图 7 不同粒径生物气溶胶中真菌分布热图 Fig. 7 Heat-map of the fungi associated with the size-segregated bioaerosols

对不同气象条件下气溶胶中真菌结构相似性进行分析, 结果如图 8所示.根据相似性百分数分析(SIMPER)进行组间比较, 发现雾-霾天和晴天不同粒径的真菌结构存在较高的差异性, 差异度为81.70%(Global Test; R=0.74; P=0.02).雾-霾天各粒径气溶胶的真菌结构相似度为14.48%(ANOSIM), 当雾-霾消散后, 各粒径气溶胶的真菌结构相似度明显高于雾-霾天, 为25.39%, 说明雾-霾天气溶胶中真菌种群结构更为复杂.

图 8 生物气溶胶中真菌NMDS分析结果 Fig. 8 Result of nonmetric multidimensional scaling ordination (NMDS) of the fungi in the bioaerosols

3 讨论

连续的雾-霾天及雾-霾消散后晴天的不同粒径气溶胶中可培养微生物浓度及种群结构存在明显差异.首先, 雾-霾天不同粒径气溶胶中微生物浓度均明显高于晴天, 这与PM2.5水平是一致的.根据相关研究中规定安德森六级撞击式采样器粒径小于3.3 μm的颗粒为可吸入性颗粒[24], 在本研究中的雾-霾天粒径小于3.3 μm的气溶胶中可培养细菌及真菌浓度为总浓度的50%左右.因此, 雾-霾天气溶胶中微生物对人体健康的潜在风险不容忽视.其次, 在粒径大于7.0 μm的气溶胶中, 雾-霾天主要检出的为厚壁菌门细菌(>75%), 而当雾-霾消散后, 厚壁菌门细菌的含量下降至40.18%, 降低了约49.78%.而在小于7.0 μm的气溶胶中, 雾-霾天粒径3.3~4.7、2.1~3.3、1.1~2.1和0.65~1.1 μm的气溶胶中, 变形菌门细菌含量分别为95.5%、45%、23.53%和45%.当雾-霾消散后, 未检出可培养变形菌门细菌.对于真菌种群而言, 雾-霾天不同粒径气溶胶中均检出了隶属于子囊菌门、担子菌门和球囊菌门的真菌, 而雾-霾消散后则只检出隶属于子囊菌门的真菌.雾-霾天及晴天不同粒径气溶胶微生物特性的差异可为后续雾-霾天近地面处气溶胶的控制提供一定的参考依据.

雾-霾天的相对湿度(63.50%~86.50%)高于晴天(35.00%~40.00%), 较高的湿度利于气溶胶中微生物的生长[25].已有研究表明, 低风速会影响颗粒物的扩散与传播[26].本研究中, 雾-霾天的风速仅为0.02~0.07m·s-1(而晴天的风速可达到1.10~7.83m·s-1), 极易造成雾-霾天气溶胶颗粒物及其上微生物的富集.对于粒径大于1 μm的生物气溶胶, 在其扩散过程中, 重力作用远重要于布朗运动[27].本研究采样位置设置在近地面高度1.5 m处, 低风速下的不同粒径气溶胶的沉降速率是不同的, 进而影响人体平均高度不同粒径的微生物浓度.

不同于以往户外气溶胶研究主要针对其中化学组分来展开, 且样品采集位置较高.本研究主要从与人体健康直接相关的人平均呼吸高度处不同粒径的气溶胶中微生物的浓度和种群结构角度展开, 并且得出初步的结果.但是, 目前本研究仍存在以下问题, 需进一步深入研究:①样品采集时间较短.下一步应展开长期的、不同地域的、不同高度的样品采集与分析, 获得长期不同气象条件下气溶胶中微生物的浓度及种类变化的基础大数据, 进而综合分析气象条件与气溶胶微生物特征之间的时空相关关系, 为雾-霾的控制提供理论基础; ②气溶胶样品采集方法单一.下一步应展开不同样品采集方法(例如安德森六级采样器、八级采样器、SKC液相撞击采样器、总颗粒物采样器等)的采集效率研究, 进一步细化不同研究目的条件下采样器的选择, 为气溶胶样品中微生物的准确收集提供依据; ③微生物种群结构分析方法需进一步优化.本研究主要针对可培养微生物而言, 因而选择了引物扩增片段较长(1 500 bp)的引物, 通过克隆文库技术进行分析.下一步应在不同粒径气溶胶总微生物群落研究方面着重展开, 可采用二代高通量技术、宏基因组技术对气溶胶中总微生物种群、病毒种类、抗生素抗性基因等与人体健康相关的组成展开更为细致精确的研究.

综合以上结果与讨论, 由于气象条件的影响, 雾-霾天人体平均呼吸高度处的不同粒径气溶胶中微生物浓度明显高于晴天, 且其中微生物种群与晴天存在明显差异, 这些均有可能会加剧雾-霾对人体健康的潜在危害.因此, 在雾-霾控制时, 考虑其中微生物组分具有重要意义.同时, 应加强雾-霾天户外人员的生物防护措施, 防止其受到进一步危害.

4 结论

本研究针对雾-霾天及雾-霾过后晴天人体平均呼吸高度的气溶胶中微生物浓度和种群结构展开初步研究.结果表明, 雾-霾天不同粒径气溶胶中微生物浓度均远高于晴天, 而且其中微生物种群结构也与晴天存在明显差异, 这些差异与气象参数的变化有关.同时这些差异可能与其对人体健康潜在风险具有一定相关性.因此, 进一步深入细致研究不同气象条件下、不同地域气溶胶中微生物特征对下一步气溶胶风险控制具有重要的意义.

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