土壤碳库是陆地生态系统最大的碳库, 对气候变化和陆地生态系统碳循环有重要的影响^{[1, 2]}.因此, 碳库的演变已经成为研究土壤有机碳的热点领域^[3].据报道, 稻田有机碳积累对我国农田土壤固碳的贡献达70%~74%^[4], 近30年数据表明, 我国亚热带稻田土壤具有持续固碳的功能, 其有机碳的动态变化对整个亚热带地区的碳平衡意义重大.土壤中有机碳的积累是长期的, 要在短期内检测到碳库的显著差异较为困难^[5], 但是通过模拟实验在短时间内研究土壤碳库的动态变化, 对于理解土壤碳循环的生物地球化学过程具有重要意义^[2].已有大量研究通过外源添加不同类型的外源碳研究其在土壤中的周转过程, 如葡萄糖^[6]、纤维素^[7]等简单碳化合物以及有机肥^[8]、秸秆^[9]等复杂有机碳.土壤有机碳转化过程是土壤循环的最基本过程^[10], 探索外源易利用有机碳在稻田土壤中的转化、分配过程, 系统科学地管理外源碳向土壤有机碳库的输入, 对于提高稻田土壤碳储存具有重要意义.

易利用有机碳在土壤碳库的周转过程中具有关键的作用^[6].由于微生物的存在, 外源碳的量和土壤中新增加的碳量并不相等^[11].外源碳的种类^[11]和添加水平^[12]是影响土壤碳形态转化的重要因素. Fontaine等^[7]将¹³C标记的纤维素添加到草地后导致土壤总SOC含量降低, SOC矿化排放CO₂的速率增加, 且非标记碳源是其主要来源.田慎重等^[13]的研究得出, 在小麦的不同生育期, 秸秆还田使土壤SOC提高, 其中表层土壤(0~10cm)的提高幅度最显著.综上可知, 各实验所得的碳源可利用性高低对土壤有机碳的影响随着实验环境以及碳源自身的不同而各有差异.根际沉积是稻田土壤有机碳的重要来源, 对于维持稻田土壤碳平衡有着重要的作用^[14]. Yevdokimov等^[15]认为根际沉积物更易被微生物利用代谢.葡萄糖是根系分泌物中的简单碳水化合物, 约占总碳的32%^[16], 同时是可直接被微生物利用的碳.土壤微生物碳量(MBC)是土壤演化的一个非常重要的指标. Blagodatskaya等^[17]发现外源添加碳数量高于、等于和低于MBC量对土壤微生物活性的影响不同, 并提出计算土壤C底物时应该考虑土壤微生物量C值.因此, 以葡萄糖为典型外源有机碳, 研究其在土壤中转化与分配规律尤其是微生物酶学响应特征, 对于理解稻田土壤外源有机碳的周转过程具有重要意义.

土壤微生物是土壤碳循环过程中关键的驱动者和调节者^[18].微生物可调节所分泌的生态酶比例, 进而获取自身所需的元素^[10].外源碳输入土壤后为微生物提供了一个良好的土壤环境, 微生物为适应这个新环境会分泌微生物酶来促进土壤有机质和外源碳之间的共代谢作用^[19]. β-葡糖苷酶(β-Glu)是土壤多糖分解酶系中主要的一种, 可将多糖分解为单糖^[20], 纤维二糖水解酶(CBH)是纤维素类酶, 其活性可以反映土壤有机碳分解转化的规律^[21].荣勤雷等^[22]的研究发现有机肥对土壤酶活性有很大的影响, 例如β-Glu酶得到提高, 进而加快土壤有机碳的转化.本实验通过对CBH和β-Glu两种土壤微生物酶活性的动态变化的研究, 探讨外源碳输入土壤时微生物对土壤碳转化的响应.

因此, 本研究选择¹³C-葡萄糖作为稻田土壤典型易利用态外源有机碳, 基于土壤MBC量进行梯度添加, 分析不同有机碳供应水平条件下微生物对有机碳的分解转化与碳固持规律及其微生物酶学响应特征, 对于提高稻田土壤碳储存具有重要意义.

供试土壤为多年种植水稻的典型红壤, 采集于中国科学院长沙农业环境观测研究站(113°19′52″E, 28°33′04″N), 该地属亚热带季风湿润气候, 平均气温16~18℃, 年降雨量1 200~1 700 mm, 无霜期260~310 d, 年降雨量1 200~1 700 mm.采集耕作层(0~20 cm)土壤, 除去土壤可见植物残体(如根、茎和叶)、石块以及土壤动物等可见杂质, 土壤自然风干后过2 mm筛, 测定基本理化性质^[23].供试土壤基本理化性质见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Physiochemical properties of the test soil 项目 黏粒/% 砂粒/% 粉粒/% pH值 有机碳/g·kg-1 碱解氮/mg·kg-1 C/N Olsen-P/mg·kg-1 TP/g·kg-1 TN/g·kg-1 DOC/mg·kg-1 MBC/mg·kg-1 参数 14.05 6.72 79.23 6.00 18.63 126.05 10.17 47.48 0.301 1.64 29.74 867.31

表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Physiochemical properties of the test soil

以葡萄糖(3.0% atom ¹³C)为碳源, 采用室内培养实验, 设置5个不同的C添加量水平: ①0% MBC(0×MBC); ②50% MBC(0.5×MBC); ③100% MBC(1×MBC); ④300% MBC(3×MBC); ⑤500% MBC(5×MBC).

实验设计处理为: (A)土(干土计200 g)+①(CK); (B)土+②; (C)土+③; (D)土+④; (E)土+⑤, 每个处理3个平行.

土壤pH采用Mettler-toledo320 pH计(FE20K, 瑞士)测定(水:土=2.5:1);土壤有机碳(SOC)和全氮(TN)采用碳氮元素分析仪(Vario MAX C/N, 德国)测定(干烧法); 土壤速效磷(Olsen-P)采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定^[24]; 土壤机械组成采用激光粒度仪测定; NH₄⁺-N、NO₃^-N采用流动注射仪(Fiastar 5000, 瑞典福斯)测定; 生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸提取-碳自动分析法测定^{[25, 26]}; 土壤溶解性有机碳(DOC)采用有机碳分析仪(岛津Vwp, 日本)测定; 参与土壤碳转化的纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-Glu)酶活性采用96微孔酶标板荧光分析法测定^[27].

本实验所得数据采用Origin 8.5和SPSS 18.0进行处理和分析, 采用One-way ANOVA(单因素方差分析)进行显著性检验, 采用Duncan法进行多重比较, 用Canoco 5进行RDA(冗余分析)和方差分析.

外源碳输入影响了土壤中各形态碳的动态变化.土壤及其溶液中的¹³C-DOC和¹³C-SOC在培养初期随添加量的增加显著梯度增加(图 1), 培养后期均降低, 且与外源碳添加量成正相关. ¹³C-MBC在培养初期随添加量的增加表现为先增加后减少的趋势, 60 d后与¹³C-DOC变化趋势一致.土壤及其溶液中的¹³C-DOC和土壤¹³C-SOC含量在2 d培养时, 与C添加量成正比, 培养60 d时, 土壤溶液和土壤中¹³C-DOC分别降低至0.1 mg·L^-1和0.02 mg·kg^-1以下, 土壤¹³C-SOC降低至10 mg·kg^-1, 与外源碳添加量成正相关[图 1(a)、1(b)和1(d)].培养2 d时, ¹³C-MBC含量在3×MBC处理存在最大值18.96 mg·kg^-1, 60 d培养时均低于2 mg·kg^-1, 与¹³C-DOC变化趋势一致[图 1(c)].

图 1

Fig. 1

图 1 不同C添加量下13C在土壤溶液和土壤中的动态变化 Fig. 1 Effects of soil and soil solution 13C under varying amounts of carbon addition

通过比较¹³C在培养2 d和60 d时的分配率, 可揭示外源碳在稻田土壤中的转化与分配规律.培养初期, 土壤水溶液¹³C-DOC分配率受葡萄糖添加量影响不显著[图 2(a)]; 随着葡萄糖添加量的增大, 土壤¹³C-DOC和¹³C-SOC的分配率呈增长趋势[图 2(b)和2(d)]; ¹³C-MBC分配率先增后减[图 2(c)], 在3×MBC处理存在最大值35.2%[图 2(c)].与培养初期相比, 培养60 d时, 各有机碳组分中¹³C分配率均降低, ¹³C-DOC的分配率几乎为0, 土壤¹³C-MBC和¹³C-SOC的分配率与外源碳添加量呈显著梯度降低(P < 0.01), ¹³C-MBC分配率低于4%, ¹³C-SOC分配率则大于10%[图 2(c)和2(d)].

图 2

Fig. 2

图 2 不同C添加量下土壤13C-DOC、13C-MBC和13C-SOC分配率 Fig. 2 Recovery of soil 13C-DOC, 13C-MBC, and 13C-SOC under varying amounts of carbon addition

对不同培养时期的土壤DOC、MBC、SOC、¹³C-DOC、¹³C-MBC和¹³C-SOC进行了相关性分析(表 2和表 3), 在培养2 d时, ¹³C-DOC与¹³C-SOC、DOC和SOC之间呈极显著正相关(P < 0.01), ¹³C-SOC与DOC和SOC呈极显著正相关(P < 0.01).培养60 d时, ¹³C-DOC与¹³C-SOC呈极显著正相关(P < 0.01), 与MBC呈极显著负相关(R=-0.798, P < 0.01), ¹³C-MBC与¹³C-SOC呈极显著正相关(P < 0.01), ¹³C-SOC与MBC呈极显著负相关(R=-0.796, P < 0.01).

表 2 (Table 2)

表 2 培养2 d土壤13C-DOC、13C-MBC、13C-SOC、DOC、MBC和SOC的Pearson相关分析1) Table 2 Pearson correlation analysis of soil 13C-DOC, 13C-MBC, 13C-SOC, DOC, MBC, and SOC after 2 d of incubation 13C-DOC 13C-MBC 13C-SOC DOC MBC SOC 13C-DOC 1 — — — — — 13C-MBC 0.003 1 — — — — 13C-SOC 0.931** 0.358 1 — — — DOC 0.954** 0.294 0.997** 1 — — MBC 0.201 0.021 0.152 0.157 1 — SOC 0.767** 0.39 0.877** 0.862** 0.046 1

表 2 培养2 d土壤13C-DOC、13C-MBC、13C-SOC、DOC、MBC和SOC的Pearson相关分析1) Table 2 Pearson correlation analysis of soil 13C-DOC, 13C-MBC, 13C-SOC, DOC, MBC, and SOC after 2 d of incubation

表 3 (Table 3)

表 3 培养60 d土壤13C-DOC、13C-MBC、13C-SOC、DOC、MBC和SOC的Pearson相关分析1) Table 3 Pearson correlation analysis of soil 13C-DOC, 13C-MBC, 13C-SOC, DOC, MBC, and SOC after 60 d of incubation 13C-DOC 13C-MBC 13C-SOC DOC MBC SOC 13C-DOC 1 — — — — — 13C-MBC 0.655* 1 — — — — 13C-SOC 0.913** 0.835** 1 — — — DOC 0.635* 0.523 0.668* 1 — — MBC -0.798** -0.418 -0.796** -0.793** 1 — SOC 0.578* 0.418 0.587* 0.566 -0.671* 1

表 3 培养60 d土壤13C-DOC、13C-MBC、13C-SOC、DOC、MBC和SOC的Pearson相关分析1) Table 3 Pearson correlation analysis of soil 13C-DOC, 13C-MBC, 13C-SOC, DOC, MBC, and SOC after 60 d of incubation

土壤C添加量和培养时间对SOC、MBC、DOC、¹³C-DOC、¹³C-MBC和¹³C-SOC的转化存在影响, 通过多重比较分析发现, ¹³C-DOC、¹³C-MBC、¹³C-SOC和DOC均与土壤C添加量和培养时间以及其交互作用存在极显著关系(表 4).

表 4 (Table 4)

表 4 C添加量和培养时间对土壤SOC、MBC、DOC、13C-DOC、13C-MBC和13C-SOC量的多重比较1) Table 4 Effects of carbon addition and culture time on the SOC, MBC, DOC, 13C-DOC, 13C-MBC, and 13C-SOC in soil DOC MBC SOC 13C-DOC 13C-MBC 13C-SOC F值 P值 F值 P值 F值 P值 F值 P值 F值 P值 F值 P值 C添加量 3 563.33 0.00** 0.19 0.899 18.83 0.00** 6 356.22 0.00** 30.27 0.00** 3 552.25 0.0** 培养时间 11 195.56 0.00** 14.58 0.002* 73.45 0.00** 11 787.44 0.00** 56.77 0.00** 6 083.02 0.00** C添加量×培养时间 3 476.37 0.00** 0.53 0.667 7.01 0.03* 6 346.26 0.00** 29.34 0.00** 1 969.77 0.00** 1)*为在0.05水平(双侧)上显著相关, **为在0.01水平(双侧)上显著相关

表 4 C添加量和培养时间对土壤SOC、MBC、DOC、13C-DOC、13C-MBC和13C-SOC量的多重比较1) Table 4 Effects of carbon addition and culture time on the SOC, MBC, DOC, 13C-DOC, 13C-MBC, and 13C-SOC in soil

外源碳的输入水平影响土壤C周转酶活性大小(图 3).与CK相比, 外源碳的添加使培养初期CBH活性降低了4.9~6.5 nmol·(g·h)^-1, 但在培养后期, 其CBH活性增大了0.3~5.3 nmol·(g·h)^-1, 在3×MBC处理存在最高值5.47 nmol·(g·h)^-1, 是CK组的23倍, 显著高于其他处理(P < 0.05).培养初期, β-Glu活性随着C添加量的增加而逐渐减少, 培养后期3×MBC和5×MBC处理的酶活性分别增大了28.7 nmol·(g·h)^-1和9.3 nmol·(g·h)^-1[3×MBC处理为最高值54.502 nmol·(g·h)^-1], 其他两个处理分别降低了22.0 nmol·(g·h)^-1和20.5 nmol·(g·h)^-1.

图 3

Fig. 3

图 3 纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶的最大活性潜势(Vmax) Fig. 3 Maximum enzyme activity potential (Vmax) of cellobiose hydrolase (CBH) and β-glucoside (β-Glu)

对影响土壤¹³C分配率的主要因子进行了RDA分析(图 4).各指标对土壤¹³C-DOC、¹³C-MBC和¹³C-SOC的累计解释率分别为63.63%、82.18%和85.15%.在培养初期, ¹³C分配率主要受到MBC、Olsen-P和DOC的影响, 其中DOC的影响最显著.培养60 d时, NH₄⁺-N、pH、β-Glu和CBH成为主要影响因子, 其中, pH对¹³C-DOC和¹³C-MBC影响最显著, NH₄⁺-N对¹³C-SOC的影响显著.

图 4

Fig. 4

图 4 影响13C-DOC、13C-MBC和13C-SOC因素的RDA分析 Fig. 4 RDA of influencing factors on 13C-DOC, 13C-MBC, and 13C-SOC

碳源是土壤微生物生长代谢的重要限制因素, 外源碳添加到稻田土壤后, 显著改变了各形态碳在土壤中的分配.由于葡萄糖吸附性较差, 葡萄糖-C输入土壤后, 主要以易被微生物利用可溶性碳形式存在于土壤水溶液中, 随着土壤微生物对C的利用转化为MBC或可能以矿物结合态固存于土壤中^{[28, 29]}, 很少部分以葡萄糖形式存在于土壤中.本实验培养初期, 由于微生物对葡萄糖利用非常快, 在前期完成了同化, ¹³C-MBC和¹³C-SOC在短时间内增加, 但¹³C-MBC含量并没有与外源添加量成正比, 而是增加到最大值后开始下降, 这可能是因为, 外源碳转化为微生物量碳可能存在一个饱和阈值, 饱和阈值之内, 有机质的转化速率与添加量成正比; 超出饱和阈值, 有机质的转化速率反而变慢.微生物对外源碳的利用有限, 小于等于3×MBC添加量时, 外源碳主要用于微生物生长, MBC含量与外源碳添加量呈正相关; 而5×MBC添加量输入外源碳远超出微生物生长繁殖的需求, 从而出现负激发效应^[30], 导致MBC含量下降.同时, 超出饱和阈值, 土壤C大幅度增加, 由于土壤碳循环受其他养分因素(如N)计量比的影响, MBC的转化速率变慢^[10], 当外源碳大量添加使C/N比大幅度增加, 导致C/N比失衡, 由于微生物胞外物质, 如多糖的C/N比要远大于胞内物质, 为了实现胞内养分均衡, 微生物把大量碳源转化为胞外物质或是以气体形式释放^{[31, 32]}, 从而减少了MBC的生成量, 因此, 土壤中¹³C-MBC含量在3×MBC添加量时达到最大值, 之后有所下降.而¹³C-DOC和¹³C-SOC量与外源碳添加量呈正相关.培养60 d时, 由于微生物分解利用, 各碳库中外源碳含量存在显著的差异.水溶液及土壤中¹³C-DOC含量几乎为零, ¹³C-MBC和¹³C-SOC含量也有所降低, 但仍与外源碳添加量呈正相关, 这是由于外源碳的添加促进了微生物的活性^[33], 葡萄糖由于微生物利用, 变成代谢产物以及存在于死亡细胞中, ¹³C进一步成为底物, 被呼吸消耗, 以CO₂和CH₄的形式释放到大气中^[28], 由于外源碳逐渐消耗, C/N比达到平衡, ¹³C-MBC量与外源碳添加量呈正相关.土壤中¹³C在各碳库的分配率SOC>MBC>DOC, ¹³C-SOC分配率大于10%, 这可能是因为MBC和DOC为易被利用的碳库, 相较于SOC易被微生物分解利用, 输入的外源碳随着微生物的分解利用, 以SOC的形式固存于土壤中, 还有一部分¹³C分配到了其他碳库中, 以CH₄和CO₂的形式释放进入大气碳库.

酶是有机质转化的主要介导物质^[20].土壤中的微生物酶活性会随着外源碳的输入发生变化.培养初期, 葡萄糖添加导致β-葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶活性明显降低, 且与葡萄糖添加量呈负相关, 这可能是因为两种酶的主要功能均为水解有机碳, 将难利用的复杂多糖降解为易利用的单糖, 其大量分泌是碳源不足的象征, 外源葡萄糖以易分解的单糖形式进入土壤中被微生物利用, 微生物碳限制被解除, 进而减少两种酶的分泌, 与DOC的结果相一致.葡萄糖添加量对两种酶的活性有显著影响, 可能是由于微生物碳需求的饱和所致.培养60 d时, CBH和β-Glu酶活性在0×MBC、0.5×MBC和1×MBC这3个处理中较低, 可能是由于长期能量供应不足, 导致微生物整体活性下降, 酶分泌量减少, ¹³C-DOC含量一定程度上可以佐证该推断; 3×MBC处理中, 酶活升高, 可能是由于外源碳的添加提供了微生物生长所需要的能源, 群落结构发生改变, 其大量繁殖, 导致C需求增大, 从而引起酶活性升高; 5×MBC处理酶活反而减小, 可能是因为微生物可直接利用的葡萄糖较为充足, 后期碳源限制小于3×MBC处理.

(1) 外源葡萄糖碳的输入使得土壤CBH和β-Glu活性初期降低, 后期增加.

(2) 微生物将外源碳转化为微生物量碳可能存在一个饱和阈值, 饱和阈值之内, 有机质的转化速率与添加量成正比; 超出饱和阈值, 有机质的转化变慢.