2019, Vol. 40
在石油的开采、运输、提炼和使用过程当中, 由于泄漏或者运输不当造成的土壤污染问题日益严重[1].石油类污染物进入土壤环境后, 会使土壤结构和性质发生改变, 破坏土壤生态平衡, 影响土壤微生物群落组成和结构[2, 3].
微生物修复法被认为是最有前景的石油污染土壤修复技术[4, 5].在利用微生物技术对土壤进行修复时, 石油烃的去除效果与土壤微生物活性、降解菌数量及土壤菌群结构变化密切相关.一些研究认为当土壤中石油烃降解菌数量达到1×108 CFU·g-1, 土壤C/N/P比接近100/10/1时, 降解菌活性较大, 对土壤中石油烃的去除作用最好[6~8].修复过程中土壤菌群结构发生相应变化, 石油烃的去除与土壤微生物群落结构变化有关[9].有研究发现, 利用微生物法修复油污土壤前期, 细菌菌群对易降解石油烃的去除起主要作用, 修复后期, 难降解石油烃的去除主要依靠土壤真菌的代谢作用完成[10].经微生物修复处理的土壤中烃降解菌所占丰度明显增加, 石油烃降解效果的提高与土壤中烃降解菌丰度的增加有关[11].
对于微生物修复油污土壤过程中菌群结构变化, 已有研究多采用变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)[12, 13], 磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA)[14, 15], 末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)[16]等技术.这些传统的分子指纹图谱一次分析获得的微生物序列通常低于100条, 检测限较低, 在对土壤中复杂的微生物进行分析时, 具有较大的局限性.
高通量测序技术是近几年发展起来的新兴分子生物学测序技术.高通量测序技术(high-throughput sequencing)可以在一次分析测定中对几十万到几百万条DNA分子进行序列分析.利用高通量测序技术能够准确反映土壤微生物群落结构变化情况[17].本文利用MiSeq高通量测序平台对微生物修复石油污染土壤过程中的菌群结构变化进行详细研究, 结果对于明确修复过程中的土壤菌群变化机制并定向调控石油污染场地土壤菌群结构, 以提高土壤中石油烃的去除效果具有重要的理论和现实意义.
1 材料及方法 1.1 土壤基本理化性质石油污染土壤取自陕北地区某油井周围.对采集的土样进行除杂、碎散、过筛(0.85 mm)并混匀后, 作为生物修复实验的供试土壤.土壤的基本理化性质及测定方法如表 1所示.
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表 1 石油污染土壤的理化性质 Table 1 Physiological properties of oil-polluted soil |
1.2 生物修复方案设计
称取12份0.8 kg石油污染土壤分装于圆形花盆中, 分别对土壤进行保持土壤湿度为15%(WHC)、生物强化(BA)和生物刺激(BS)的修复处理, 连续修复12周.以未进行任何修复处理的石油污染土壤为控制实验(IS), 每个处理3个平行, 具体修复方案见表 2.
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表 2 石油污染土壤的修复方案 Table 2 Remediation of petroleum-polluted soil with different treatments |
表 2中, 生物强化修复(BA)中所用的石油烃降解菌群为课题组从石油污染土壤中分离获得[18].降解菌群主要由变形菌门(Proteobacteria 96.26%)与厚壁菌门(Firmicutes 3.71%)组成.主要的纲、目、科、属分别为γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria 90.03%)、假单胞菌目(Pseudomonadales 89.98%)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae 89.95%)、假单胞菌属(Pseudomonas 87.22%)、无色杆菌属(Achromobacter 6.12%)、芽孢杆菌属(Bacillus 3.51%).
生物刺激修复(BS)为向土壤中加入NH4NO3和KH2PO4调节土壤C: N: P=100: 10: 1.
1.3 测定方法 1.3.1 高通量测序分析对修复第1周和修复结束时(第12周)的土壤样品进行高通量测序分析.主要分析步骤如下.
利用OMEGA试剂盒提取土壤样品的总DNA, 利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量, 利用V3-V4通用引物进行第一轮PCR扩增, 引入Illumina桥式PCR兼容引物后, 进行第二轮扩增[19].
扩增结束后, 对PCR产物进行琼脂糖电泳检测, 对于细菌的PCR产物和正常扩增片段在400bp以上的PCR产物, 选用0.6倍的磁珠(AgencourtAMPure XP)处理进行纯化回收.利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量, 以方便按照1: 1的等量混合后测序.等量混合时, 每个样品DNA量取10 ng, 最终上机测序浓度为20 pmol.
对测序结果按图 1所示进行处理及分析.利用Prinseq软件对高通量测序结果进行质量控制, 将所测序列与RDP数据库进行序列比对, 使用Mothur软件归类同种可操作分类单元(OTU), 计算多样性指数并绘制稀释性曲线, 对测序结果进行物种分类分析和菌种差异分析.
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图 1 高通量测序分析流程 Fig. 1 High-throughput sequencing analysis program |
利用超声破碎法提取土壤中的石油烃并用重量法进行测定[20].将土壤样品置于通风橱中风干, 准确称取风干后的土样3.000 g于玻璃管中, 加入15 mL正己烷与二氯甲烷(1: 1)混合液, 冰浴条件下利用超声细胞破碎仪(JY92-Ⅱ, 美国SONICS)超声萃取10 min(萃取功率为170 W), 8 000 r·min-1离心15 min, 过滤并收集提取液于已烘干的三角瓶中, 重复萃取3次, 合并萃取液置于通风橱中, 使萃取剂完全挥发至恒重后称重.石油烃的总降解率和修复第1周的周降解率计算分别见式(1)和式(2).
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(1) |
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(2) |
式中, wi为土壤石油烃初始含量; w1为修复1周后土壤石油烃含量; w12为修复12周后土壤石油烃含量.
2 结果与讨论 2.1 生物修复对土壤中石油烃的去除作用一些研究认为, 向石油污染土壤中接种降解菌群对石油烃的去除效果好于单株降解菌[21~23].本研究中, 利用从石油污染土壤中筛选出的降解菌群对土壤进行生物强化(BA)处理, 同时对土壤进行了生物刺激(BS)及保持土壤湿度为15%(WHC)的修复处理, 3种不同处理对石油烃的总降解率及第1周降解率结果如图 2所示.
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图 2 生物修复对土壤中石油烃的去除效果 Fig. 2 TPH degradation efficiencies by different remediation treatments |
修复结束时, WHC、BA和BS处理的土壤中总石油烃的去除率分别为13.94%、11.29%和38.45%. 3种处理在修复第1周时对石油烃的去除率分别为8.92%、14.80%和15.80%.结果表明, 与生物强化修复处理相比, 利用生物刺激法对土壤中石油烃的去除效果相对较好.且在修复第1周时石油烃的降解最为快速有效.
2.2 土壤菌群的高通量测序结果 2.2.1 优化序列统计及测序质量评价表 3中WHC1、BA1、BS1、WHC12、BA12和BS12分别为保持土壤湿度为15%、生物强化、生物刺激第1周和第12周的土壤样品高通量测序优化及质量评价结果.利用Usearch软件去除序列中的嵌合体与靶区域外序列后, 对测序结果进行优化序列统计及测序质量评价, 获得的有效序列均在30 000以上, 除WHC1样品优化率略低外, 其余样品的序列优化率均在90%以上, 说明本次序列优化步骤有效.各样品的覆盖率在98%以上, 说明测序量合理, 能够满足后续的分析要求.
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表 3 优化序列统计及测序质量评价 Table 3 Sequence statistics and quality evaluation of high-throughput sequencing |
根据97%相似度对处理后剩余序列进行OTU分类, 利用Mothur软件进行rarefaction分析, 绘制稀疏性曲线, 结果如图 3所示.随着序列数目增加, 各处理的稀疏性曲线趋于平缓.说明扩增序列可以真实反映各个土壤样品的细菌群落结构, 测序深度足够.
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图 3 测序结果的稀疏性曲线 Fig. 3 Rarefaction curves of high-throughput sequencing |
多样性指数是评价土壤微生物群落丰富度和均匀度的综合指标, Ace指数和Chao 1指数大, 说明土壤菌群的丰富度高. Shannon指数值大, 辛普森指数值小, 说明土壤菌群的均匀度越高[24, 25].
表 4为土壤微生物群落多样性指数测定结果.经生物强化(BA)修复的土壤样品, 其Ace指数与Shannon指数值与石油污染原土壤相比显著降低.说明向油污土壤中投加降解菌群抑制了土著菌的生长, 使得土壤微生物的丰富度与均匀度降低.利用生物刺激法修复处理的土壤(BS1、BS12)与原土壤相比, 生物多样性略有降低.
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表 4 不同处理土壤的微生物群落多样性 Table 4 Biodiversity of petroleum-polluted soil remediated by different treatments |
保持土壤湿度为15%的处理(WHC1、WHC12)与原土壤(IS)相比, Ace指数值略有降低, Shannon指数值在修复第1周时减小, 第12周时增大, 说明保持土壤湿度为15%修复1周时, 会使土壤微生物均匀度和丰富度降低, 随着修复时间的增加, 菌群均匀度逐渐增加.
有研究认为, 向农业土壤中施入NPK肥会使农田土壤微生物多样性降低[26, 27].本研究中, 向石油污染土壤中补充氮磷进行生物刺激修复处理时, 土壤微生物的多样性也略有降低.原因可能是由于施入的NPK肥或者补充的氮磷营养(本研究中使用了NH4NO3和KH2PO4)多为酸性物质, 加入后改变了土壤pH值, 进而对某些土壤微生物的生长起到抑制作用, 结果导致了土壤微生物多样性降低.
2.2.3 土壤微生物群落结构变化(1) 门水平群落结构分析
对各样品前12种优势菌门的相对丰度进行分析, 结果如图 4所示.变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)与放线菌门(Actinobacteria)为所有土壤样品的主要优势菌门.这3种菌门是石油污染土壤中普遍存在的微生物菌门[28~30].
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图 4 土壤微生物门水平相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of the dominant phyla in different treatments |
当对土壤的修复方法不同时, 优势菌门的相对丰度发生变化.与石油污染的原土壤(IS)相比, 保持土壤湿度修复1周后(WHC1), 变形菌门(Proteobacteria)与放线菌门(Actinobacteria)丰度分别从37.44%、47.34%降至14.72%与19.44%, 厚壁菌门(Firmicutes)丰度从9.16%增至62.29%.修复12周之后, 变形菌门(Proteobacteria)与放线菌门(Actinobacteria)的丰度略有增加, 厚壁菌门(Firmicutes)的丰度降低至40.81%.
利用生物刺激法修复的土壤(BS1和BS12)中, 3种优势菌门丰度变化趋势与WHC处理类似.
利用生物强化法修复的土壤中, 变形菌门(Proteobacteria)成为主要优势菌门, 相对丰度为87.44%, 其他各菌门丰度相对较低.
(2) 属水平群落结构分析
对各土壤样品前20种优势菌属丰度进行分析, 结果如图 5所示.未经修复处理的石油污染土壤(IS)中的优势菌属为原小单胞菌属(Promicromonospora, 18.96%), 次优势菌属包括微小杆菌属(Exiguobacterium, 8.49%)、诺卡氏菌属(Nocardioides, 5.56%)和柠檬酸细菌属(Citrobacter, 5.76%).
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图 5 土壤微生物属水平相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of the dominant genera in different treatments |
调节土壤湿度为15%修复1周(WHC1)后, 芽孢杆菌属(Bacillus)的丰度由原来的0.29%增至38.2%, 成为最主要的优势菌属.原小单胞菌属(Promicromonospora)与诺卡氏菌属(Nocardioides)丰度由原来的18.96%和5.56%分别降低为10.63%与1.18%.修复12周时, 芽孢杆菌属(Bacillus)丰度变为22.46%, 原小单胞菌属(Promicromonospora, 18.62%)与诺卡氏菌属(Nocardioides, 6.94%)丰度略有增加.
生物刺激修复处理(BS)的土壤中, 大部分优势菌属丰度的变化趋势与WHC处理类似, 修复12周时, 诺卡氏菌属(Nocardioides)丰度明显增加, 成为BS处理中最优势菌属.
利用生物强化法修复的土壤(BA1和BA12), 优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas, 75.24%和76.37%), 次优势菌属为无色杆菌属(Achromobacter, 8.81%和7.57%), 其余菌属丰度较小.
在本次生物强化修复处理中, 接种的石油烃降解菌群主要由变形菌门(Proteobacteria)、假单胞属(Pseudomonas)组成.对污染土壤进行生物强化修复处理1周后, 变形菌门(Proteobacteria)、假单胞属(Pseudomonas)成为土壤中的主要优势菌, 说明生物强化修复处理中接种的石油烃降解菌可在土壤中存活并迅速生长为土壤中最主要的优势菌属, 并抑制了土壤微生物的生长.由于生物强化处理使土壤微生物多样性显著降低(表 4), 菌群结构上的失衡有可能导致了土壤中石油烃的去除效果相对较差.
3 结论(1) 利用高通量测序技术对微生物修复石油污染土壤过程中的微生物群落结构变化进行分析.测序结果表明, 所测样品的序列优化率均在90%以上, 覆盖率在98%以上, 随着序列数目的增加, 稀疏性曲线趋于平缓.说明本次序列优化步骤有效, 测序深度足够, 测序结果可以真实反映各个土壤样品的细菌群落结构.
(2) 生物刺激修复处理的石油污染土壤中, 厚壁菌门(Firmicutes)丰度增加为35.32%, 变形菌门(Proteobacteria)丰度降低为10.90%.属水平上, 诺卡氏菌属(Nocardioides, 28.95%)和芽孢杆菌属(Bacillus, 22.70%)成为土壤中的优势菌属, 原小单孢菌属(Promicromonospora, 14.97%)和微杆菌属(Exiguobacterium, 2.19%)为土壤中的次优势菌属.
(3) 投加降解菌进行生物强化处理的土壤菌群结构发生明显变化, 变形菌门(Proteobacteria, 87.44%)成为土壤中的优势菌门, 放线菌门(Actinobacteria, 5.46%)丰度显著降低.属水平上, 假单胞菌属(Pseudomonas, 76.37%)成为土壤中的最优势菌属, 无色杆菌属(Achromobacter, 7.57%)和原小单胞菌属(Promicromonospora, 2.58%)成为土壤中的次优势菌属.生物强化修复处理引起土壤菌群结构发生明显变化.
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