2019, Vol. 40
2. 上海城投(水务)集团有限公司, 上海 200002;
3. 上海市供水调度监测中心, 上海 200080
2. Shanghai Chentou Water Group Co., Ltd., Shanghai 200002, China;
3. Shanghai Municipal Water Supply Control & Monitoring Center, Shanghai 200080, China
生物膜是饮用水输配管网中常见的微生物存在形式, 是悬浮水中微生物通过自凝聚附着在管壁上的膜状微生物聚集体[1].一方面, 生物膜上活性微生物通过自身新陈代谢活动和自发周期性脱落, 造成饮用水水质恶化[2](浊度、色度和嗅味等)和微生物诱导的化学腐蚀[3]等问题; 另一方面, 微生物以生物膜方式存在, 不仅大大增强了饮用水中细菌对高氯和寡营养等胁迫性环境的适应性[4], 而且为饮用水中残留受损微生物的恢复性再生长[5], 尤其是强吸附性致病菌的寄居生长创造了良好条件[6].管壁生物膜中的活性微生物可以通过细菌再生长后的脱落或代谢产物的扩散作用, 给居民饮水带来卫生学和感官上影响.
由于表面粗糙度和自身理化性能的差异, 供水管网中不同管材上形成的生物膜差别很大.管材特性成为影响生物膜形成的重要因素之一[7].张向谊等[8]采用平板计数琼脂(PCA)和营养琼脂(NA)培养的手段在数量上研究了镀锌钢、铸铁、硬质聚氯乙烯(UPVC)、不锈钢和聚乙烯(PE)管材对管壁微生物生长的影响; 王薇等[9]结合HPC、定量PCR(qPCR)和16S rRNA基因高通量测序等手段比较了灰口铸铁管、镀锌管和不锈钢复合管上生物量和种群多样性; Ren等[10]采用HPC、qPCR和454焦磷酸测序技术分别从数量和多样性上研究了球墨铸铁管(DCIP)、灰铸铁管(GCIP)、镀锌钢管(GSP)、不锈钢复合管(SSCP)和聚氯乙烯管(PVC)对生物膜形成的影响.这些研究多集中于城市供水干管, 对建筑区域内饮用水输配管材很少关注.同时, 以往管壁生物膜的研究多采用可培养计数方法和基于16S rDNA的分子检测方法, 不能反映供水管壁不可培养细菌数量和活性微生物多样性信息.
在已应用于管网生物膜生物多样性相关研究方法中, 常规16S rRNA基因高通量测序技术(high-throughput sequencing, HGS)测序对象为基因组DNA, 然而DNA会在细胞死亡后依旧持续存在于环境中[11], 因此常规16S rRNA基因高通量测序技术无法客观反映供水管网中活性微生物带来的风险. 16S rRNA高通量测序是一种直接利用半衰期较短的RNA进行测序的手段[12], 能够较为直接地反映出活性微生物的特征, 不仅能够进一步提高对饮用水中活性微生物群落多样性和细菌种群动态的理解, 还可以开发针对饮用水中活性细菌的分子谱学技术[13].另外, qPCR也是一种基于基因组DNA进行微生物定量的分子手段, 结果中包含了已经死亡的微生物以及胞外聚合物中的游离DNA.异养菌平板计数(HPC)可以反映饮用水中可培养细菌的数量, 但不能客观反映非培养细菌的信息.荧光染色与流式细胞术(FCM)的结合可以对饮用水中的活性不可培养微生物进行快速定量分析[14].本研究采用HPC、流式细胞术(FCM)和16S rRNA高通量测序技术, 利用生物膜环形反应器(BAR)分析了3种常用室内管材(PVC、PPR和STS)表面活性生物膜生长特性和活性微生物种群多样性特征.本文可对供水末端改善供水水质, 控制微生物风险提供有益参考.
1 材料与方法 1.1 生物膜培养装置与样品采集采用生物膜环形反应器(biological annular reactor, BAR, 图 1)研究不同管材生物膜生长[15].实验前用NaClO溶液对BAR反应器、挂片和进出水管进行消毒灭菌, 用自来水冲洗干净.本实验原水为末端龙头水. PVC、PPR和STS挂片各7个, 面积分别约7.07、6.60和4.71 cm2. BAR反应器的进水流量为285 mL·min-1, 水力停留时间为0.52 h, 有效容积为7 650 mL, 剪切力约为9.46×10-7 N·m-2.生长10个月后的生物膜为生物膜成熟期样本.运行启动后定期采样.取样方法为:用无菌棉擦拭一定面积挂片表面, 用无菌剪刀将棉签头剪入无菌2 mL离心管中, 加入1 mL无菌PBS, 冰浴超声1 min, 间歇1 min, 重复3次, 然后再漩涡振荡30 s, 4℃保存.
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图 1 生物膜环形(BAR)反应器装置示意 Fig. 1 Biological annular reactor for biofilm growth |
本实验用水为末端龙头水, 总磷、氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐等常规指标按国家标准方法测定[16], 采用HACH PC Ⅱ型水质分析仪(HACH, 美国)检测余氯浓度; HACH 2100Q便携式浊度仪(HACH, 美国)检测浊度; HACH DR2800分光光度计(HACH, 美国)进行总铁测定; TOC分析仪(SHIMADZU, 日本)进行TOC测定; 台式pH计(Mettler Toledo, 美国)进行pH值测定; 温度计进行水温检测; NA、R2A平板培养分别进行总菌和HPC计数.各项水质参数如表 1所示.
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表 1 实验用水水质(平均值±标准偏差) Table 1 Water quality parameters(mean±standard deviation) |
1.3 异养菌平板计数(heterotrophic plate count, HPC)
按标准方法配制R2A培养基, 将预处理后的样品逐级稀释至10-3、10-4、10-5这3个浓度梯度, 取100 μL进行平板涂布, 每个梯度3个平行, 并使用无菌水做空白对照.平板涂好后在28℃下倒置暗培养7 d后进行计数.
1.4 死活细胞染色与流式细胞计数(flow cytometry, FCM)将SYBR Green Ⅰ原液用0.22 μm滤膜过滤后的二甲亚砜(DMSO)稀释100倍配制成SYBR Green Ⅰ标准液, 称取10 mg碘化吡啶(PI)溶解于DMSO(0.22 μm滤膜滤后), 按1: 50与Green Ⅰ标准液混合为SYPI标准液.将样品使用中速定量滤纸过滤以去除大颗粒物质对检测结果的干扰, 稀释至合适浓度(102~105 CFU·mL-1), 取1 mL于37℃金属浴5 min后, 加入10 μL 0.5mol·L-1 EDTA-2Na, 混匀后加入10 μL SYBR Green Ⅰ标准液和10 μL SYPI标准液, 37℃避光孵育10 min后, 混匀上样.
流式细胞仪使用参照BD FACS Calibur使用说明[11].选择PI(630 nm)和SYBR Green Ⅰ (520 nm)光学过滤器, 绿色荧光(520 nm)通道(FL1)触发器, 在绿色荧光(520 nm)与红色荧光(630 nm)参数点上获得数据.
1.5 RNA提取、反转录和高通量测序取适量的预处理生物膜样本用Omega Soil RNA Kits提取细菌基因组总RNA, 于-80℃保存.将提取的RNA用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA, 于-20℃保存.以生物膜上提取活菌的基因组(cDNA)作为模板进行16S rRNA基因扩增和二代测序, 以515F和806R为引物, 采用Illumina S5平台进行目的条带为291bp的扩增.本次测序由上海烈冰生物医药科技有限公司完成.
1.6 HGS数据预处理和分析使用Fast-QC软件对所有的16S rRNA基因序列的reads进行处理分析.采用QiiME去除嵌合体序列后, 得到可以用于后续分析的Clean Data, 进而采用QiiME算法包中的Uclust聚类策略对所有序列进行聚类. OTU中序列相似性设为97%, 并选取其中的代表性OTU序列.基于Silva数据库(https://www.arb-silva.de/)对测序结果进行比对分析, 得到OTU的科属注释.
2 结果与讨论 2.1 不同管材表面生物膜的生长特性以末端龙头水为原水, 考察PVC、PPR和STS这3种管材上生物膜的生长规律.如图 2所示, PVC管上的生物量在约73 d后首先达到峰值, PPR和STS约90 d后达到.经过一个生命周期, 生物膜最终发展至成熟期, 微生物数量相对稳定.在此期间, 生长曲线峰值处显示的最大生物量规律为PVC＞PPR＞STS, 其中PVC最高, 达6.7×105 CFU·cm-2; 其次是PPR, 为6.3×105 CFU·cm-2; STS最少, 为3.6×105 CFU·cm-2, 最终成熟时期的生物量规律与最大生物量一致, 即PVC最多, 达6.7×105 CFU·cm-2; PPR次之, 为4.2×105 CFU·cm-2; STS最少, 为2.2×105 CFU·cm-2.显然, STS表面最不易生物膜生长.相对于PVC而言, 由于STS内壁存在由Cr2O3形成的致密的钝化膜, 不易造成微生物诱导的管壁腐蚀; 同时STS管壁粗糙度较低, 细菌附着生长的条件相对较差, 大分子营养物质也较难在管壁沉积, 因此细菌数量明显较低[9].而PVC和PPR是疏水性材料, 与悬浮微生物表面疏水基团的相互作用会极大地促进生物膜形成时的初始吸附[17]; 同时, PVC表面的孔洞和缝隙较多, 水中的余氯不易渗透, 水流不易冲刷, 因而形成了细菌生长的良好场所[18]; 另外, 由于微生物能够少量代谢塑料管材的特定成分[19], 因此塑料管材自身也可以一定程度上为微生物生长提供营养.
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图 2 不同管材表面生物膜的生长曲线 Fig. 2 Biofilm growth on different pipeline surfaces |
为进一步验证不同管材表面生物膜生长特征, 本研究采用SYBR green Ⅰ和碘化丙啶(PI)双染方法对管壁生物膜上细胞死、活状态进行了检测[14].其中, 染料SYBR能够穿透活细胞完整的细胞膜与核酸物质结合产生520 nm(绿色)荧光(FL1通道); 染料PI只能穿透结构受损的细胞膜与其核酸物质结合, 产生617 nm(红色)荧光(FL2通道).采用FCM测定生物膜上的总细菌数发现, PVC＞PPR＞STS(表 2). 3种管材生物膜上的微生物大部分以有活性的状态存在(90.35%~95.52%), 仅有少数以受损状态(1.86%~3.48%)或死亡的状态(0.27%~6.10%)存在(图 3).说明作为一个复杂的有机群体, 生物膜上的微生物虽然面临着寡养和余氯等外界环境胁迫和微生物群体间激烈的种间竞争.但是, 由于生物膜上物种间独特的合作与交流机制, 以及胞外聚合物对生物膜群落的保护作用, 使得生物膜上的大部分微生物能够存活并行使正常的生命活动.其中, STS管材上的活细胞占比最高, 达95.52%;其次为PVC, 活细胞占比为94.29%; PPR的活细胞比例最少, 为90.35%.这是由于STS管表面的生物量最少, 单个微生物能够获得更多的生长空间和生命活动所需的营养成分, 生物膜上的微生物能更好地在管壁占据相应的生态位进行生命活动, 整个微生物群体中物种间的生存竞争更小, 所以STS管壁生物膜上的微生物存活率更高. 3种管材表面的活细菌数量规律与总细菌数量规律一致, 虽然生物膜上可培养微生物的数量与流式细胞仪测定的活细菌数量之间有着极强的相关性(R2=0.999 8), 但生物膜上HPC数量仅占FCM活细菌数的0.11%~0.13%, 只能反映生物膜上整个微生物群落的可培养组分.
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表 2 不同管材表面生物膜的总菌数、活菌数及活菌比例(成熟时期) Table 2 Total bacteria, living bacteria, and the rate of living bacteria on different pipe surface(mature stage) |
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FL1-A:染料SYBR Green Ⅰ的荧光强度相对表达量, 用于表征活性细胞; FL2-A:染料PI的荧光强度相对表达量, 用于表征死亡细胞 图 3 不同管材生物膜中微生物的存在状态 Fig. 3 Survival status of microorganisms from biofilms of different pipelines |
各样本数据经抽平[20]后细菌的丰富度及多样性如表 3. Shannon指数显示, STS管上的活细菌物种多样性最小、群落结构最简单. PVC和PPR是疏水材料, 而饮用水中的微生物为了抵御消毒剂等毒害物质的渗入, 在外膜上大多会存在一些疏水结构(如纤毛等), 或者微生物自身会分泌一些具有疏水性的物质(如胞外蛋白等)包裹在细胞外层以实现自我保护[21], 因此水中悬浮微生物可以与上述两种管材通过彼此间疏水基团的相互作用在管材内壁更好地形成相对复杂的微生物群落结构.而STS管作为一种亲水材料, 不易与大多数具有疏水结构的微生物相互作用形成生物膜, 因此STS管上所形成的生物膜群落结构更加单一.不同管材上OTUs和丰富度的变化规律与多样性一致.
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表 3 不同管材生物膜微生物群落的丰富度与多样性指数 Table 3 Community richness and diversity index for microbial communities in the biofilms of different pipelines |
将所有样本进行抽平后, 对OTU进行注释得到不同管材生物膜上活性微生物的群落组成(图 4). 3种管材上活性微生物的整体组成大致相似, 优势菌群均为疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和变形菌门(Proteobacteria), 同时伴随少许差异: PVC管上的最优势活菌为疣微菌门(Verrucomicrobia), 占比为36%; PPR和STS管上活菌最优势菌门相同, 均为硝化螺旋菌门(Nitrospirae), 占比分别为29%和37%; PVC管壁生物膜中含有较多的活蓝藻细菌(Cyanobacteria), 占总活菌的12.40%, 而在PPR和STS中分别仅占8.87%和7.69%; PPR管壁生物膜中含有较多的活性放线菌(Actinobacteria), 占总活菌的0.83%, 在PVC和STS分别仅占0.48%和0.47%.
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图 4 不同管材生物膜上活性微生物相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of live bacteria in the biofilms of different pipelines |
由于蓝藻是硫醇、甲酯类等嗅味硫化物和土霉味嗅味物质的来源, 会引起饮用水鱼腥味和土霉味[22]; 放线菌会产生具有土霉味的代谢产物, 如Geosmin和2-MIB[23], 因此PVC和PPR管相较STS管材, 在饮用水输配过程中更易引发饮用水的嗅味问题.
在PVC和STS样本中, 存在较高丰度的有柄细菌属类, 如大多存在于铁丰富的自然环境中的生丝微菌属(Hyphomicrobium), 通过对铁和锰的氧化获取能量来源.供水管网中的有柄微生物也一般被包裹在不溶性的铁盐沉积物中[24].因此, 在3个样本中, 生丝微菌属更加倾向于在含有铁成分的不锈钢管壁上成膜.同时, 由于微生物自身结构特征, 生丝微菌属极易在粗糙度较高的管壁如PVC上形成生物膜.而在PPR样本中, 丰度最高的是Paludibaculum, 这个属别的某些微生物能够将3价铁作为电子受体, 从而进行3价铁的微生物还原[25].因此, PPR上的Paludibaculum通过将溶解在饮用水中的3价铁离子还原成不可溶的铁单质颗粒附着在PPR管上, 在增加管壁颗粒度以促进微生物黏附形成生物膜的同时, 还为已经形成的生物膜组分中某些铁氧化细菌提供能量来源. 3个样本中均含有高丰度的硝化螺旋菌属(Nitrospira), 这将会使饮用水中的亚硝酸盐氮充分转变为硝酸盐氮, 造成饮用水中硝酸盐积累.
3 结论(1) 3种研究管材中, PVC管壁上活性微生物量最先达到峰值, PPR和STS随后. 3种管材上单位面积最大生物量, 成熟时期生物膜生物量均为PVC＞PPR＞STS.相对于PVC和PPR, STS表面最不易生长微生物, 但生物量最少的STS管壁上活细胞比例最高.
(2) 相比PVC和PPR, STS管壁上的活性微生物种类最少、多样性最低、群落结构最简单. PVC和PPR管壁上致嗅微生物:活性蓝藻细菌和放线菌占比都较高, 在输配过程中更易产生嗅味问题.
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