我国南方稻田磷素含量低, 土壤有效磷供应能力差, 水稻生长易受到磷素供给缺乏的限制^[1].为提高土地生产力和水稻产量, 施用磷肥已成为常规的农业增肥增产措施^[2].磷肥的加入使得土壤理化性质和土壤酶活性发生变化^{[3, 4]}, 同时也会影响土壤磷素周转的主要驱动者—微生物的生长代谢活动^[5~7].由于土壤微生物之间存在“生物地下交易”法则, 因此, 磷素的添加也会一定程度地影响土壤碳循环相关的微生物的生长和代谢活动^{[8, 9]}.

自养微生物能将大气中的CO₂转化为土壤有机质, 对土壤碳循环有着重要影响^[10].稻田土壤中的固碳自养微生物以兼性自养菌为主, 专性自养菌所占比例小^[10~12].兼性自养菌不仅能自养生长, 而且还能够利用有机物作为碳源进行异养繁殖^[13], 因此, 施肥带来的土壤环境和养分的变化也会对固碳自养微生物的生长繁殖产生影响.以往研究发现, 碳同化微生物对土壤特性和环境因子变化比较敏感, 植被类型、土壤有机质含量、土壤质地、施肥方式、根际效应、光照和深度等因素对土壤固碳关键基因的丰度均有显著影响^[14].王群艳等^[15]的研究发现, 土壤SOC含量更高时, 具有更好的固碳潜力.固碳功能基因微生物多样性和丰度受土壤性质的影响, 一定的田间管理措施可增强自养固碳微生物的活性和多样性^[14].已有研究表明, 单施化肥或化肥配施有机肥均可显著提高卡尔文循环中固碳关键基因cbbL的丰度, 主要是因为施肥提高了土壤中营养物质含量, 为含cbbL基因的兼性自养菌的生长提供了丰富的能源和碳源^{[16, 17]}.然而, 以往的研究多针对卡尔文循环的关键固碳基因^{[14, 18]}, 而对参与其他固碳途径的关键功能基因的研究还比较少.事实上, 由于地球大气环境的演变, 自养微生物固定CO₂的途径也发生了变化, 不同的自养微生物固定CO₂的途径有多条, 每条固碳途径由不同的关键基因控制^{[19, 20]}.

为了更全面地揭示施肥对固碳自养微生物及其固碳过程的影响, 本研究采用实时荧光定量PCR技术研究了磷素添加对土壤中3条重要的CO₂固定途径(卡尔文循环、还原性三羧酸循环和3-羟基丙酸/4-羟基丁酸)的关键功能基因(cbbL、cbbM、accA和aclB)数量的影响, 并分析了固碳自养微生物丰度与土壤理化性质之间的关系, 以期为稻田土壤养分的高效管理提供一定的科学依据.

供试土壤为花岗岩母质发育的红壤性水稻土, 采自湖南长沙农业环境观测站试验田, 该区域属于亚热带季风气候, 年平均气温17.5℃, 年均降水量为1 330 mm.采用铁锹挖取0~20 cm表层土壤, 去除植物残体和石块后自然风干, 取部分土壤过0.25 mm和0.149 mm筛, 用于土壤基本理化性质测定; 剩余土壤用于室内培养实验.供试土壤基本理化性质为:pH值5.43, 有机质(SOC)含量14.26 g·kg^-1, 全氮(TN)含量1.45 g·kg^-1, 总磷(TP)含量0.75 g·kg^-1, 有效磷(Olsen-P)含量4.96 mg·kg^-1, 阳离子交换量(CEC)7.71 cmol·kg^-1.

剩余土壤过2 mm筛, 25℃预培养14 d后添加硫酸铵和氯化钾作为基肥, N和K的添加量(以干土计)分别为250 mg·kg^-1和160 mg·kg^-1.混匀后称取1.0 kg(干基重)土壤分装于PVC盆钵(直径17.2 cm, 高度20 cm), 盆钵中部放入尼龙网袋, 内装0.5 kg土壤代表根际土壤.为了探讨磷素添加对固碳自养微生物数量的影响, 设置添加磷素处理(P)和不添加磷素的对照处理(CK), 每个处理设置9个重复.磷素以磷酸二氢钾的形式加入, P添加量(以干土计)为80 mg·kg^-1.

水稻品种选用“籼性常规水稻中早39”, 稻苗在田间培养14 d后, 选取长势一致的稻苗, 小心洗净根系后, 移栽至PVC盆钵的尼龙网袋(φ5 cm×17 cm, 48 μm)内, 每盆移栽3株.移栽后的稻苗置于阳光充足、通风良好的空地.生长期间用去离子水浇灌, 并及时除草.于2015年6月29日将水稻盆栽移入标记箱进行标记.培养装置和方法参见文献[21].¹³C-CO₂通过¹³C-NaHCO₃(50% atom ¹³C, 100 mL, 1 mol·L^-1)和H₂SO₄(50 mL, 0.5 mol·L^-1)反应自动产生.通过控制H₂SO₄加入速度使标记箱内CO₂维持在380~400 μmol·mol^-1.标记箱内外安置两个温度传感器(智能型精密数显温度控制器, SNT-96S, 杭州), 箱内安置控温空调, 使标记过程中标记箱内外温度控制在±1℃.标记过程中隔天补充去离子水以保持土壤呈淹水状态(土壤表层保持2~3 cm水层).分别于水稻生长的分蘖期(移栽后14 d)和拔节期(移栽后22 d)进行破坏性取样, 采集添加磷素和对照处理水稻根际土壤.土壤分成3份:一份于4℃保存, 用于土壤微生物量碳(MBC)测定; 一份液氮速冻后于-80℃保存, 用于分子生物学分析; 一份室内自然风干, 用于土壤基本理化性质测定.

土壤pH采用电位法测定, 测定水土比为2.5:1, 土壤可溶性有机碳(DOC)采用0.05 mol·L^-1硫酸钾直接浸提, 土壤微生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提-碳自动分析法测定, 有效磷(Olsen-P)采用碳酸氢钠浸提-比色法测定, 铵态氮(NH₄⁺-N)和硝态氮(NO₃^--N)采用氯化钾浸提-自动连续流动分析仪测定.

土壤总DNA采用Fast DNA^® Spin Kit for Soil(MP Bio, USA)试剂盒提取, DNA的浓度和纯度通过微量紫外分光光度计(NanoDrop ND-1000)进行测定.采用实时荧光定量PCR仪(ABI7900, USA)对cbbL、cbbM、accA和aclB基因拷贝数进行定量分析.cbbL、cbbM、accA和aclB基因PCR扩增引物分别为K2f/V2r^[22]、cbbM-f/cbbM-r^[23]、Crena_529F/Crena_981R^[24]和892F/1204R^[25](表 1).扩增体系为上游引物0.15 μmol·L^-1, 下游引物0.15 μmol·L^-1, 1×SYBR Premix Ex Taq(Takara)5 μL, DNA模板5 ng, 用无菌水补充至终体积10 μL.qPCR反应程序见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 qPCR反应引物和程序 Table 1 Primers and thermal cycling conditions for qPCR 基因 引物序列 qPCR反应程序 cbbL K2f:5′-ACCAYCAAGCCSAAGCTSGG-3′ V2r:5′-GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC-3′ 95℃ 30 s; 95℃ 30 s, 62℃ 30 s, 40个循环; 72℃ 20 s cbbM cbbM-f:5′-GGCACCATCATCAAGCCCAAG-3′ cbbM-r:5′-TCTTGCCGTAGCCCATGGTGC-3′ 95℃ 30 s; 95℃ 30 s, 57℃ 30 s, 40个循环; 72℃ 20 s accA Crena_529F:5′-GCWATGACWGAYTTTGTYRTAATG-3′ Crena_981R:5′-TGGWTKRYTTGCAAYTATWCC-3′ 95℃ 30 s; 95℃ 30 s, 50℃ 30 s, 40个循环; 72℃ 20 s aclB 892F:5′-TGGACMATGGTDGCYGGKGGT-3′ 1204R:5′-ATAGTTKGGSCCACCTCTTC-3′ 95℃ 30 s; 95℃ 30 s, 54℃ 30 s, 40个循环; 72℃ 20 s

表 1 qPCR反应引物和程序 Table 1 Primers and thermal cycling conditions for qPCR

采用SPSS 16.0 for Windows和Microsoft Excel 2010软件进行数据处理和统计分析.不同处理之间、相同处理不同生育期之间土壤理化性质和固碳功能基因的差异显著性采用独立样本t检验.利用Canoco 5.0软件以cbbL、cbbM、accA和aclB基因的丰度作为响应变量, 土壤理化性质作为解释变量进行约束性排序分析, 考察了土壤理化性质对固碳自养微生物群落的影响.

由图 1可以看出, 添加磷素后土壤理化性质表现出不同的变化趋势.施磷后, 土壤MBC含量在分蘖期和拔节期分别达493.0 mg·kg^-1和475.7 mg·kg^-1, 比CK处理分别降低7.0%和30%, 且分蘖期处理间差异达显著性水平(P < 0.05).P处理DOC含量在分蘖期和拔节期分别为50.3 mg·kg^-1和97.4 mg·kg^-1, 均高于对照处理, 但不同处理间差异不显著.与DOC相反, P处理NH₄⁺-N含量在分蘖期和拔节期分别比CK处理显著低41%和82%(P < 0.05).Olsen-P含量在P和CK处理间差异显著(P < 0.05), 分蘖期和拔节期P处理土壤Olsen-P含量分别为18.2 mg·kg^-1和6.7 mg·kg^-1, 比CK处理分别高105%和80%.在不同的生长时期, P处理和CK处理NO₃^--N含量均呈显著性差异(P < 0.05), 拔节期P处理NO₃^--N含量比CK处理显著增加78%, 而分蘖期规律相反.分蘖期和拔节期P处理pH均高于CK, 且在拔节期处理间差异达显著性水平(P < 0.05).

图 1

Fig. 1

CK:对照处理, P:添加磷素处理; 大写字母不同表示不同处理之间差异显著, 小写字母不同表示相同处理不同生育期之间差异显著, 下同 图 1 添加磷素对土壤理化性质的影响 Fig. 1 Effect of phosphorus addition on physical-chemical soil properties

随着培养时间的推移, P处理MBC、NH₄⁺-N、NO₃^--N、Olsen-P和pH均呈下降趋势, 而DOC含量表现出相反的变化规律.与分蘖期相比, P处理MBC、NH₄⁺-N、NO₃^--N、Olsen-P和pH分别比拔节期降低4%、79%、14%、63%和1%, 而DOC含量显著增加了94%.CK处理土壤理化性质随着水稻生长的变化规律与P处理不同, 随着培养时间的推移CK处理DOC、MBC和pH呈增加趋势, 而NH₄⁺-N、NO₃^--N和Olsen-P含量呈下降趋势.

添加磷素后土壤固碳自养微生物的数量发生了变化(图 2).在分蘖期, P处理cbbL、cbbM、accA和aclB基因拷贝数分别为1.93×10⁹、1.23×10⁸、1.98×10⁷和3.5×10⁸ copies·g^-1, 分别比CK处理显著提高156%、99%、110%和193%.在拔节期, 除cbbM基因外, P处理提高了cbbL、accA和aclB基因数量, 分别比CK处理增加16%、8%和73%, 但处理间差异未达显著性水平.

图 2

Fig. 2

图 2 添加磷素对固碳自养微生物数量的影响 Fig. 2 Effect of phosphorus addition on the abundances of autotrophic CO2-fixation microorganisms

P和CK处理固碳自养微生物数量随水稻生长发育而发生的动态变化具有较好的一致性.随着水稻的生长发育, P和CK处理cbbL、accA和aclB基因拷贝数呈下降趋势, 且P处理3种基因拷贝数在水稻不同生长期的差异达显著性水平.相反, P和CK处理cbbM基因拷贝数随着水稻生长表现出上升趋势.

选择冗余分析(RDA)考察了不同处理土壤cbbL、cbbM、accA和aclB基因丰度与土壤理化性质之间的关系(图 3), 其中黑色箭头表示土壤理化性质, 灰色箭头表示固碳功能基因.可以看出, 在分蘖期和拔节期, P处理和CK处理土壤在二维排序图中的位置彼此分离明显, 说明施磷造成了土壤固碳自养微生物群落的分化(蒙特卡罗检验值为P=0.018), 而且相比拔节期, 在分蘖期P处理和CK处理之间固碳自养微生物差异更大.第一和第二排序轴特征值占总特征值的78.58%, 说明所测定的环境因子能解释大部分固碳自养微生物数量的变化, 其中Olsen-P是对固碳功能基因丰度影响最显著的环境因子(蒙特卡罗检验值为P=0.002).

图 3

Fig. 3

图 3 不同处理土壤固碳自养微生物群落的RDA分析 Fig. 3 RDA analysis of the autotrophic CO2-fixation microbial community in soils with or without phosphorus addition

土壤理化分析结果显示土壤pH值在5.92~6.36之间, P处理土壤pH值均高于CK处理, 这可能与CK处理土壤中铵态氮含量相对较高有关^{[26, 27]}.添加磷素后土壤Olsen-P含量升高, 而MBC和NH₄⁺-N含量下降.产生这一结果的原因是P处理土壤中加入了无机磷肥, 无疑会增加土壤Olsen-P含量.MBC则不同, 虽然微生物在生长繁殖过程中需要磷素^[28], 但有研究表明施用适量的磷肥可促进微生物的生长, 增加MBC含量, 但是过量磷素反而会对微生物的生长产生抑制作用^[29].与CK处理相比, P处理土壤磷素供应充足, 水稻生长快, 为了满足自身生长需求, 水稻也需要从土壤中吸收大量的氮素^[30], 从而使得P处理NH₄⁺-N(氮源)消耗量相比CK处理高.由于氮素是水稻和微生物生长都必须的养分元素, 所以水稻和微生物在氮素利用上具有竞争关系^[31].相比未施肥处理, P处理促进了水稻的生长, 增加了水稻对氮素的消耗, 使得土壤对微生物的供氮能力下降, 微生物生长变缓, 造成添加磷素后MBC含量的下降.NO₃^--N是反硝化功能微生物进行反硝化作用的底物, 磷素添加可能促进了水稻分蘖期反硝化功能微生物的生长, 增强了反硝化作用^[32], 从而加速了NO₃^--N的损耗, 使得该时期P处理NO₃^--N含量低于CK.然而, 反硝化作用是一个厌氧的过程, 随着水稻的生长, 在拔节期P处理水稻根系愈来愈发达, 水稻根系的泌氧功能可能反而抑制了反硝化作用^{[33, 34]}, 使得拔节期P处理NO₃^--N含量反而高于CK.反硝化微生物并不是影响NO₃^--N变化的唯一因素, 水稻在不同生育期对NO₃^--N需求量的变化可能与反硝化微生物共同影响着土壤NO₃^--N含量.

添加磷素和不施肥对照处理中, 从水稻分蘖期到拔节期NH₄⁺-N、NO₃^--N、Olsen-P和pH均降低, 其中NH₄⁺-N和Olsen-P呈显著下降趋势, 这与魏亮等^[31]的研究结果一致, 可能与水稻在不同生育期对养分的需求不同有关.从分蘖期到拔节期, 水稻植株对氮、磷等养分的需求量不断增加, 因而使得土壤中氮磷含量下降^[35].随着水稻的生长, 水稻根系越来越发达, 根系分泌物增加, 因此, 相比分蘖期, 拔节期P和CK处理DOC含量均显著增加^[36].CK处理中MBC含量随着水稻的生长升高, 而P处理MBC含量下降, 这可能是因为磷素添加改变了水稻与微生物之间的营养竞争, 导致不同处理中MBC含量随水稻生长呈现不同的变化规律.

磷素添加改变了土壤中cbbL、cbbM、accA和aclB固碳自养基因的丰度.有研究表明, 添加磷素后土壤养分元素化学计量关系和理化性质的变化不仅会影响磷素转化相关酶及功能微生物, 还会调控参与碳循环过程的酶及其功能微生物数量^[37].相比其他3个基因, aclB基因受磷素添加的影响最明显.这可能是因为添加磷素后水稻生长和根际环境发生了变化^[38], 而参与不同固碳途径的关键酶及其编码基因对变化的根际环境响应不同.qPCR和RDA分析结果显示在水稻不同生育期磷素添加对不同固碳途径固碳自养微生物数量的影响程度不同.水稻分蘖期, P处理固碳自养微生物数量显著高于CK处理, 而拔节期处理间差异变小且差异并不显著.这是因为微生物的生长繁殖需要多种养分元素来维持^{[20, 28]}, 添加磷素后虽然土壤Olsen-P含量显著升高, 土壤磷素供应充足, 但由于磷素添加促进了水稻生长, 因而加剧了水稻和微生物之间对其他养分的竞争.在这种情况下, 微生物对异养途径获取外源营养物质的依赖性降低, 可能更倾向于通过自养固碳途径来获取碳以满足自身生长对养分的需求^[39].在拔节期, 随着水稻的生长, 水稻根系生物量和根系分泌物增加(如DOC含量), 因此, P处理水稻和微生物之间对养分的竞争有所缓解, 对自养途径固碳的依赖性下降, 因而处理间固碳自养微生物数量差异变小.

从分蘖期到拔节期, cbbL、accA和aclB基因丰度随着水稻的生长有所下降, 而cbbM基因丰度随着水稻的生长呈增加趋势, 这可能与水稻根际土壤CO₂和O₂浓度的相对变化有关.由于不同固碳基因编码酶对CO₂和O₂的敏感程度不同^[40], 因此, 水稻生长带来的根际环境的变化可能对不同固碳基因产生不同影响.一般cbbM基因的编码酶在低氧和高二氧化碳浓度具有较高活性^[41], 在淹水条件下水稻土壤溶解氧含量低, 加上根系和微生物的呼吸作用消耗O₂释放CO₂, 容易形成低氧和高二氧化碳环境, 随着水稻根系生长, 这种情况可能会加剧, 从而有利于携带cbbM基因的微生物生长.

陈晓娟等^[42]的研究认为土壤中固碳自养微生物数量主要与土壤有机质含量、土壤碳氮比显著正相关, 与土壤全磷含量并无显著性相关关系, 而本研究中RDA分析表明Olsen-P含量是显著影响固碳自养微生物的环境因子.这是因为本研究是取自同一土壤的磷素添加室内培养实验, 有机质含量并无差异, 而磷添加直接增加土壤Olsen-P的含量.因此, CK和P处理中Olsen-P的差异可能掩盖了土壤有机质和土壤碳氮比对固碳自养微生物的影响.

(1) 磷素添加改变了根际土壤理化性质, 与CK相比, 分蘖期和拔节期P处理MBC含量分别下降7%和30%, NH₄⁺-N含量分别下降41%和82%;而DOC、Olsen-P和pH分别比CK处理提高6%和3%、105%和80%、7%和6%;分蘖期P处理NO₃^--N含量比CK处理低56%, 而拔节期P处理NO₃^--N含量反而比CK处理高78%.

(2) 磷素添加改变了根际土壤固碳自养微生物的丰度, 随着水稻的生长, 磷素添加对固碳自养微生物数量的影响减弱.在分蘖期, P处理cbbL、cbbM、accA和aclB基因拷贝数分别比CK处理显著提高156%、99%、110%和193%.在拔节期, 除cbbM基因外, P处理提高了cbbL、accA和aclB基因数量, 分别比CK处理增加16%、8%和73%, 但处理间差异未达显著性水平, 说明磷素的添加能够长效刺激缺磷土壤中固碳自养微生物的生长.

(3) RDA分析显示低磷稻田土壤固碳功能基因丰度受Olsen-P含量影响最显著.