2018, Vol. 39
2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125
2. Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
丛枝菌根真菌是专性共生微生物, 可与陆地90%的植物形成共生关系[1], 与植物形成共生关系之后, 能够与植物建立起一种互惠互利的关系, 有利于促进植物的生长发育.然而, 不同植物由于其生理代谢、根系形态结构与分泌物等方面的差异, 必然会影响到丛枝菌根对宿主植物的侵染[2], 进而影响其群落组成、多样性等.同时, 宿主植物本身需要适应其生存环境, 丛枝菌根面临宿主和环境的双重选择, 只有适应当地特有生态环境的丛枝菌根才能够生存并更好地发挥其生态功能[3], 因而, 丛枝菌根与宿主植物存在某种程度上的选择特性, 与早期的研究认为丛枝菌根全球随机分布矛盾.因此, 丛枝菌根与宿主植物是否具有选择特性的问题仍然存在着争议, 成为菌根学研究的热点问题之一.
岩溶地貌主要分布在中国西南地区, 面积约550 000 km2, 是世界上分布面积最大的岩溶区[4].由于岩溶区独特的地形地貌, 例如:土层浅薄, 岩石裸露度高, 受人为干扰敏感, 导致生态系统脆弱, 容易发生石漠化现象.虽然, 近几年来, 岩溶区实施了大量石漠化治理工程措施, 并取得了一定的成效, 但整体形势还是比较严峻的.植被恢复是石漠化治理最有效的措施之一, 灌丛在岩溶区具有分布广、旱生、岩生、嗜钙等特点[5], 是该地区植被从草丛恢复到乔木林的关键过渡阶段[6].苏宗明等[7]的研究表明, 檵木、红背山麻杆、黄荆、龙须藤、灰毛浆果楝、小果蔷薇、火棘、雀梅藤、金合欢等是广西岩溶石山主要的优势灌丛植物.然而, 由于不同灌丛群落类型其物种组成及多样性随植被的恢复往往具有各自的规律[8], 加上不同灌丛群落类型在不同植被恢复阶段中其生态位存在差异[9], 对资源的需要与获取也不一样, 从而导致某些灌丛群落类型在植物恢复过程中逐渐占优势, 而某些群落类型的优势地位进一步削弱.灌丛植物在植被恢复过程中出现不同的变化趋势, 除了与植物本身的生理生态功能有关外, 与其根系共生微生物多样性变化密切相关, 例如丛枝菌根.因此, 探究不同灌丛植物根系丛枝菌根多样性的变化规律, 有利于明晰共生丛枝菌根在灌丛植物演替中所起的作用.
目前, 国内只有少数学者开展了岩溶区丛枝菌根真菌多样性的研究, 例如, Li等[10]、魏源等[11]和何跃军等[12]进行贵州岩溶高原或云南干热河谷中的丛枝菌根真菌多样性调查; 而对于岩溶峰丛洼地生态系统中丛枝菌根真菌群落结构及其生态功能的研究较少, 只有Qiao等[13]、Zhang等[14]和张中峰等[15]探讨了丛枝菌根真菌对植物生理生态的影响.本项目组前期在岩溶峰丛洼地区也开展了一些工作:发现岩溶峰丛洼地不同植被恢复生态系统中土壤丛枝菌根真菌多样性在草丛阶段最低, 在原生林阶段最大[16]; 微生境(岩性、坡位)对土壤丛枝菌根真菌多样性产生显著的影响[17, 18].结果表明, 岩溶区土壤丛枝菌根真菌的种质资源丰富, 但针对岩溶峰丛洼地区灌丛植物根系丛枝菌根的研究很少.因此, 本研究运用T-RFLP的方法分析了岩溶区灌丛植物根系丛枝菌根群落结构变化特征, 探讨丛枝菌根与宿主植物是否存在选择特性, 以期从微生物学的角度为岩溶区植被恢复提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究样区研究样区位于广西壮族自治区环江毛南族自治县同进村(24°50′N, 105°55′E), 木伦村(25°04′N, 107°57′E)、仪凤村(24°57′N, 108°02′E), 属于亚热带季风气候, 年均气温18.5℃, 年均降雨量1 389 mm, 雨季主要集中在4~9月, 尤以6月中旬至7月中旬最多, 空气平均相对湿度为79%, 灌木群落样地有15~20 a的退耕历史.
1.2 植物根系与根际土壤样品采集植物选择:于2012年在同进村、木伦村和仪凤村共布设21个灌丛样方, 采用经典植物群落调查方法调查植物多样性, 然后, 根据研究目的与植物重要值, 确定目标植物, 其中, 包括4种豆科植物:香合欢(Albizia odoratissima)、老虎刺(Pterolobium punctatum)、羊蹄甲(Bauhinia purpurea)、龙须藤(Bauhinia championii), 9种非豆科植物:檵木(Loropetalum chinense)、火棘(Pyracantha fortuneana)、子凌蒲桃(Syzygium championii)、灰毛浆果楝(Cipadessa cinerascens)、貂皮樟(Litsea coreana)、红背山麻杆(Alchornea trewioides)、三脉叶荚蒾(Viburnum triplinerve)、四子海桐(Pittosporum tonkinense)和清香木(Pistacia weinmannifolia).
植物根系及根际土壤样品采集:考虑到植物树龄会影响根际养分, 选择地茎约2 cm目标植物, 采集其根系与根际土.不同植物根际土壤样品采集采用抖落法[19].在上述所选的典型样地内挖取具有完整根系的土体(根系主要分布的范围), 先轻轻抖动植物, 抖落不含根系的大块土壤, 然后采集粘附在根围的土壤(距离根围0~5 mm)作为根际土, 并尽可能去除混杂于根际土中的根系.采集完粘在根系上的土壤后, 每株植物采集2 mm细根, 用于AM群落分析.一共获得204个样品(102个根与102个根际土壤样品), 其中, 香合欢3个, 老虎刺6个, 羊蹄甲6个, 龙须藤5个, 清香木3个, 灰毛浆果楝4个, 貂皮樟11个, 红背山麻杆5个, 三脉叶荚蒾3个, 四子海桐5个, 檵木14个, 火棘19个, 子凌蒲桃18个.在采集豆科植物根系与根际土壤时, 记录植物是否形成根瘤.将采集到的土壤样品, 风干保存用于土壤基本理化性质分析; 采集到的根系样品快速置于液氮中运回实验室-70℃保存, 用于分子生物学分析.
1.3 土壤基本理化性质的测定用电位法(土水比为1:2.5)测定土壤pH值; 用重铬酸钾-硫酸氧化法测定有机碳[20]; 用半微量凯氏法测定全N[20]; 用0.5 mol·L-1 NaHCO3浸提、钼锑抗比色法测定土壤Olsen-P[21]; 用烘干法测定含水量.
1.4 植物根系DNA提取、目的片段PCR扩增利用植物提取试剂盒(天根, 北京)提取植物根系DNA.获得的总DNA, 经1%的琼脂糖凝胶电泳进行定性检测, 片段大小约为20 kb; 然后, 用紫外分光光度计(Nanodrop, PeqLab, Germany)对获得的DNA进行定量检测, 获得产量与纯度较好的DNA后用于进行下一步的分子生物学分析.
采用巢式PCR扩增AM真菌18S rRNA, 其中, 第一次PCR扩增引物对为GeoA2/Geo11 (上游5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′、下游5′-ACCTT GTTACGACTTTTACTTCC-3′)[22], 第二次PCR扩增引物对为NS31/AM1(上游5′-TTGGAGGGCAAGTCT GGTGCC-3′、下游5′-CTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3′)[23], 并在引物对NS31/AM1正向引物5′添加FAM用于T-RLFP分析的, 所有引物由上海英俊生物技术公司合成, PCR扩增仪为Eppendorf Mastercycler(Germany).
第一次PCR扩增体系(25 μL):DNA模板20 ng, 2×PCR Premix(0.1U PrimeSTAR HS DNA Polymerase, 0.5 mmol·L-1 dNTPs, Takara) 12.5 μL, 上游和下游引物各1 μL, ddH2O补至25 μL; 扩增程序为94℃ 2 min; 35个循环为95℃ 60 s, 62℃ 60 s, 72℃ 60 s; 72℃终延伸10 min.
第二次PCR反应体系(50 μL):取第一次PCR产物2.5 μL为模板, 上游和下游引物各1 μL, 2×PCR Premix(0.1U Prime STAR HS DNA Polymerase, 0.5 mmol·L-1dNTPs, Takara)25 μL, ddH2O补至50 μL; 扩增程序为94℃ 2 min; 35个循环为95℃ 60 s, 64℃ 60 s, 72℃ 60 s; 72℃终延伸10 min.
1.5 限制性片段长度多态技术(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RLFP)检测采用试剂盒“Wizard SV Gel and PCR clean-up Systems”(Promega, Madison, US)对PCR产物进行切胶回收纯化, 具体操作步骤见试剂盒说明书.PCR产物用限制性HinfI内切酶进行酶切, 酶切体系(50 μL):DNA约为200 ng, 其它试剂加入量及酶切反应温度均按照说明书操作; 酶切条件:水浴反应12 h, 热变性(65℃, 20 min)使酶失活从而终止酶切反应.取10 μL酶切产物, 用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检查是否酶切完全.T-RFLP检测由上海桑尼生物科技有限公司完成(Sunny Biotechnology Co., Shanghai), 所用仪器为ABI Prism 3100 Genetic Analyzer.
1.6 数据分析(1) T-RFLP数据分析
利用PeakScan 1.0软件显示末端片段大小(T-RFs)和相对丰度.每个末端片段(T-RFs)的荧光值除以所有片段荧光值的总和为该末端片段的相对百分比, 去掉1%以下的末端片段, 去掉末端片段长度小于50 bp的T-RFs, 将相差2 bp的T-RFs合并为同一个, 将相对丰度≥5% T-RFs定义为优势种.
基于T-RFLP数据, 利用CANOCO 5.0软件进行AM真菌群落结构分析.首先, 数据进行趋势对应分析法(detrended correspondence analysis, DCA), 获得轴长梯度大小, 确定数据适合采用的排序方法; 最终, 根据本研究数据轴长梯度小于3, 确定利用冗余分析(redundancy analysis, RDA)来探讨环境因子与AM真菌群落结构的关系.
(2) 统计分析
数据统计分析分别在SPSS 19.0 for Windows(SPSS Inc., 芝加哥, 美国)和Microsoft Excel 2010软件中进行.数据不服从正态分布将进行lg(x+1)的转化.差异显著性用One-way ANOVA(一维方差分析)分析, 多重比较采用LSD法.
2 结果与分析 2.1 典型灌丛植物根际土壤理化性质表 1显示, 13种灌丛植物根际土壤有机碳、全氮、Olsen-P含量的变化范围分别为64~191 g·kg-1、4~17 g·kg-1、4~17 mg·kg-1; 土壤pH的变化范围为7.21~7.79.
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表 1 典型灌丛植物根际土壤理化性质1) Table 1 Soil properties in different shrub rhizospheres |
单因素方差分析表明, 不同灌丛植物根际土壤有机碳、全氮、Olsen-P含量存在显著性差异(表 1), 其中, 豆科灌丛植物根际土壤养分显著高于非豆科灌丛植物; 在豆科植物中, 香合欢根际土壤养分显著高于其它3种豆科植物; 在非豆科植物中, 三脉叶荚蒾与四子海桐根际土壤养分显著低于其它植物.
2.2 典型灌丛植物根系丛枝菌根群落结构由T-RFLP图谱可见(图 1), 不同灌丛植物根系一共获得44个T-RFs AM, 其中, 香合欢、老虎刺、羊蹄甲、龙须藤、清香木、灰毛浆果楝、貂皮樟、红背山麻杆、三脉叶荚蒾、四子海桐、檵木、火棘、子凌蒲桃根系中分别获得16、22、21、24、18、19、26、27、16、19、33、34和34个T-RFs.除貂皮樟外, 其余灌丛植物根系AM优势种群T-RFs为105、138、189、300和348 bp, 占总种群的46%以上; 貂皮樟中优势AM优势种群T-RFs为134、182、295和325 bp, 占总种群的62%以上.
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图 1 不同灌丛植物根系AM(HinfI酶)群落组成分析 Fig. 1 Average relative abundances of AM T-RFs as determined by endonuclease digestion with HinfI in the root samples from different shrubs |
灌丛植物根系AM群落组成结构差异显著[图 2(a)], 其中, 豆科与非豆科植物根系AM群落组成结构存在显著差异; 而4种豆科植物中, 其根系AM群落组成结构不存在显著差异[图 2(b)]; 9种非豆科植物中, 其根系AM群落组成结构存在显著差异[图 2(c)].
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图 2 不同灌丛植物根系AM群落组成聚类分析 Fig. 2 Cluster analysis of the AM community in root samples from all shrubs, leguminous plants, and non-leguminous plants |
RDA分析表明, 土壤Olsen-P(P=0.001, F=3.5)、pH(P =0.008, F=2.4)和全氮(P=0.026, F=2.1)是影响不同灌丛植物根系AM群落组成结构的主要因子[图 3(a)]; 土壤全氮(P=0.049, F=1.7)是影响豆科灌丛植物根系AM群落组成结构的主要因子[图 3(b)]; 土壤有机碳(P=0.002, F=3.4)和pH(P=0.006, F=2.7)是影响非豆科灌丛植物根系AM群落组成结构的主要因子[图 3(c)].
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图 3 不同灌丛植物、豆科植物和非豆科植物根系AM群落结构影响因子分析 Fig. 3 Effect of factors on the AM community structure in root samples from all shrubs, leguminous plants, and non-leguminous plants |
不同植物由于其生理生态功能不一样, 导致其根系分泌物各异[24].本研究发现, 岩溶区不同灌丛植物根际土壤养分存在显著差异(表 1), 尤其是豆科与非豆科植物之间, 与Chen等[25]的研究结果一致.本研究选择的4种豆科植物:香合欢、羊蹄甲、老虎刺与龙须藤, 均发现根瘤, 表明这4种豆科植物具有固氮能力, 因此, 其根际土壤全氮含量显著高于其它非豆科固氮植物(表 1).
在生物地球化学循环中, 氮、磷循环呈现出一种很好的耦合关系[26].本研究结果表明:相对于非豆科植物, 豆科植物根际土壤全氮含量高伴随着高磷素含量(表 1), 与已有的研究结果一致.例如, Chen等[25]报道, 亚热带地区豆科植物根际土壤全磷含量显著高于非豆科植物; Shi等[27]发现在造林过程中, 将固氮植物移植于草丛生态系统后, 草丛根际土壤全磷含量显著增高.以上的研究表明, 氮的输入显著影响磷循环, 其可能的机制为:①氮的输入将改变微生物活性及群落结构, 因而影响有机磷矿化成无机磷[28]; ②氮的输入通过刺激初级生长力来增加有机磷的形成, 从而刺激微生物与植物对无机磷的需求[29]; ③氮的输入影响磷素各种形态之间的转化速率[30].因此, 相对于非豆科植物而言, 豆科植物固氮速率高伴随较高的磷素需求量, 随之, 磷酸酶活性增强, 植物对磷吸收速率提高, 从而加快磷循环.
3.2 岩溶区典型灌丛植物根系AM群落结构的影响因子本研究通过T-RFLP技术获得不同灌丛根系44个T-RFs AM, 与其他非岩溶区用同样的技术研究植物根系AM真菌群落结构相比较, 岩溶区植物根系AM真菌丰富度高[31], 表明岩溶区AM真菌种质资源丰富.这与岩溶区生境异质性高有关, 因为异质性环境可以为AM真菌提供多样化的栖息地及资源[32], 从而促进AM真菌生长进而提高其数量.
丛枝菌根真菌是专性共生微生物, 可与陆地90%的植物形成共生关系[1], 然而, 丛枝菌根与植物是否具有选择特性仍然存在着争议, 成为菌根学研究急需解决的问题.本文在岩溶区选择13种典型灌丛植物作为研究对象, 通过T-RFLP分子生物学技术, 发现均是丛枝菌根共生植物, 表明丛枝菌根在岩溶区的宿主植物范围广.同时, 聚类分析表明, 岩溶区不同灌丛植物根系丛枝菌根群落结构存在显著差异[图 2 (a)], 尤其是豆科与非豆科植物.在此基础上, 又分别对豆科与非豆科植物根系丛枝菌根真菌群落结构进行聚类分析, 发现只是单独考虑豆科植物或者非豆科植物, 根系丛枝菌根群落结构在非豆科植物中差异显著[图 2 (c)], 而在豆科植物中则差异不显著[图 2(b)].以上的结果表明, 岩溶区灌丛植物根系丛枝菌根与植物存在选择特性, 而植物功能群对丛枝菌根选择特性比植物种类大[33].可能的机制为:①本研究中, 植物功能群划分为豆科与非豆科植物, 相对于非豆科植物, 豆科植物根系能够形成根瘤菌, 根瘤菌与丛枝菌根真菌虽然在生态功能上具有一定的互补作用[34, 35], 但是, 为了满足自身生长需要, 又存在着对宿主植物碳水化合物竞争的关系, 所以, 根瘤菌与丛枝菌根真菌在竞争-协同相互作用中, 朝着有利于两者生存的方向进行选择, 从而影响两者的群落组成; ②相对非豆科植物, 豆科植物形成的根瘤菌能够固定氮素, 固氮速率的增强将会影响植物对磷素的吸收以及其转化[30], 而磷素是影响丛枝菌根真菌群落结构的一个重要驱动因子[36], 即使侵染豆科与非豆科植物根系的优势丛枝菌根种类没有发生改变, 但是豆科植物通过增加氮素的输入, 对根系优势的丛枝菌根种群相对丰度也将产生显著的影响(图 1).
除了植物外, 土壤根际养分对植物共生的丛枝菌根真菌群落结构也产生显著影响.本研究发现, 土壤Olsen-P是影响岩溶区灌丛植物根系AM群落变化的主要驱动因子[图 3(a)], 与Xiang等[36]和Lin等[37]的研究结果一致.在岩溶区, 土壤磷素总含量较同纬度地带性土壤高, 但是受高钙镁和pH等的制约, 导致土壤中可利用的磷素养分较低[38], 从而成为影响植物根系AM群落结构的一个重要限制因子.同时, 笔者还发现, 岩溶区不同功能群植物根系AM群落结构的影响因子各异:例如, 土壤全氮是影响岩溶区豆科灌丛植物根系AM群落组成结构的主要因子[图 3(b)], 土壤有机碳和pH是影响岩溶区非豆科灌丛植物根系AM群落组成结构的主要因子[图 3(c)].这表明, 不同功能群植物根系AM群落结构影响因子不一样, 与植物生态功能密切相关.
4 结论(1) 岩溶区不同灌丛植物根际土壤养分存在显著差异, 豆科植物根际土壤养分显著高于非豆科植物, 与豆科植物具有固氮功能, 显著影响植物对磷吸收及转化密切相关.
(2) 本研究选择的岩溶区13种灌丛植物均能被丛枝菌根侵染, 不同灌丛植物根系丛枝菌根群落结构存在显著性差异, 且植物功能群对丛枝菌根群落结构的影响比植物种类大.
(3) 与非岩溶区相比, 岩溶区灌丛植物根系AM丰富度高, 与岩溶区独特的植物区系及环境资源空间异质性高密切相关.
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