2018, Vol. 39
2. 哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室, 哈尔滨 150090
2. State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China
厌氧氨氧化是指在厌氧条件下, 厌氧氨氧化菌以NO2--N为电子受体, 直接将NH4+-N氧化成N2的过程, 是一种新型生物脱氮工艺[1, 2], 因其低耗高效的优势, 使其在废水生物脱氮领域具有广阔的应用前景.但厌氧氨氧化菌生长极其缓慢, 倍增时间长达11~19 d, 细胞产率(以VSS/NH4+-N计)仅有0.11 g·g-1[3~5].厌氧氨氧化菌难以富集, 导致厌氧氨氧化工艺启动周期过长, 工艺难以启动[6], 极大限制了其工程化应用.接种不同种类污泥进行驯化启动该工艺耗时过长, 所用时间普遍在2~3个月[7~10], 高活性的厌氧氨氧化种泥很难在短期内通过普通污泥筛选得到, 因此直接接种厌氧氨氧化种泥成为污水处理厂快速启动ANAMMOX(anaerobic ammonium oxidation)工艺的首要选择[11].厌氧氨氧化菌对温度、毒物、pH值、DO、生长基质等环境条件异常敏感, 环境发生变化就会致使厌氧氨氧化菌活性降低、失稳后难以恢复[12~16], 污水处理厂的启动需要大量的种泥, 种泥在运输过程中需要一定时间, 这使得种泥需要适当的短期储存方法, 这对种泥的储存提出了更高的要求.汪彩华等[17]研究了保存基质类型、温度对该菌储存的影响, 结果表明, 在常温(15℃±2℃)下以(NH4)2SO4为保藏基质进行保存是一种经济高效的方法[18]; 黄佳路等[19]研究了保存时间对该菌的影响, 结果表明储存时间对于该菌活性影响很大; 基质浓度作为一种容易调控的参数, 对于保存过程中生物的活性有着重要影响, 而目前鲜有关于基质浓度对于ANAMMOX菌储存的研究.
本实验结合上述研究, 在15℃±1℃条件下, 采用厌氧氨氧化种泥(正常运行所处的NH4+-N和NO2--N基质浓度为120 mg·L-1), 将其置于不同保存基质浓度(0、60、120 mg·L-1)下进行短期储存(15 d), 通过比较储存前后菌种活性、有机物及EPS含量, 以及系统脱氮性能恢复情况, 找到了适合厌氧氨氧化菌短期保存的基质浓度, 以期为ANAMMOX的工程化应用提供理论支撑和技术指导.
1 材料与方法 1.1 接种污泥和实验用水储存前的污泥来自于实验室小试SBR反应器中, 其运行温度为35℃, 进水基质中NH4+-N、NO2--N浓度为120 mg·L-1, C/N为5, 水力停留时间为12 h, 总氮去除速率为1.852 kg·(m3·d)-1, 总氮去除率为80%以上, 其消耗的NH4+-N、NO2--N与产生的NO3--N实测值之比为1:1.37:0.23, 具有良好厌氧氨氧化活性的厌氧氨氧化污泥.
本实验采用人工配水, (NH4)2SO4提供NH4+-N, NaNO2提供NO2--N, NaHCO3提供无机碳源和碱度, 其C/N为5, KH2PO4为2.5 mg·L-1, CaCl2为12.5 mg·L-1以及1.00 mL·L-1的微量元素; 微量元素成分为: EDTA(15 g·L-1), CoCl2·6H2O(0.25 g·L-1), ZnSO4·7H2O(0.42 g·L-1), CuSO4·5H2O(0.24 g·L-1), MnCl2·4H2O(0.98 g·L-1), H3BO4(0.015 g·L-1), NiCl2·2H2O(0.020 g·L-1), NaWO4·2H2O(0.060 g·L-1).
储存期间, 1号装置采用低基质浓度保存, 无基质添加; 2号装置采用中基质浓度保存, 其基质浓度为60mg·L-1 NH4+-N、60 mg·L-1 NO2--N; 3号装置采用高基质浓度保存, 其基质浓度为120mg·L-1NH4+-N、120 mg·L-1NO2--N.
恢复期间(NH4)2SO4、NaNO2根据系统恢复情况按需配制(表 1).
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表 1 反应器不同阶段基质配比 Table 1 Matrix ratios in different stages |
1.2 实验装置及运行参数
本实验分为两个阶段：污泥储存阶段和活性恢复阶段.
污泥储存阶段：将600 mL种泥置于2 L的厌氧瓶中, 分别加入高、中、低浓度的配水, 定容至2 L, 并塞紧保证其厌氧环境; 为减小温度波动过大对菌种保存造成影响, 将装有菌种的厌氧瓶置于装有水浴的容器中于避光处进行常温水浴; 将水浴容器放置于室内, 在15℃±1℃环境中保存15 d.
活性恢复阶段：将储存后的菌种用蒸馏水冲洗3遍, 并分别置于3组相同规格的SBR反应器1、2、3号中进行恢复实验, 反应器高60 cm, 内径10 cm, 有效容积4 L, 换水比是66.7%, 采用低基质浓度逐步恢复方法, 恢复初期基质浓度为60mg·L-1 NH4+-N、60mg·L-1 NO2--N, 待效果提升后恢复至120mg·L-1NH4+-N、120mg·L-1NO2--N.水力停留时间根据反应器的恢复效果由24 h逐渐递减至储存前的12 h; 置于35℃(储存前温度)下进行恢复, 并对相关参数进行测定.
1.3 分析方法NH4+-N的测定采用纳氏试剂分光光度法; NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N采用紫外分光光度法, 污泥形态采用光学显微镜(Olympus BX51)进行观察和记录.污泥的粒径分布采用激光粒度仪(Malvern Mastersizer 2000)进行测定.荧光物质采用三维荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司F97)测定, EPS中PS:苯酚-硫酸比色法; PN:考马斯亮蓝法.
比厌氧氨氧化活性(SAA)测定：将厌氧氨氧化污泥5 g于初始NH4+-N和NO2--N浓度分别为120 mg·L-1和158 mg·L-1的100 mL配水置于厌氧瓶中, pH值在7.7~8之间, 通过高纯氮气曝气20 min以保证配水的厌氧环境.然后避光培养于30℃、140 r·min-1的水浴摇床, 每隔1.5 h取水样测定NH4+-N和NO2--N浓度.由基质浓度降解曲线, 计算出污泥的SAA, 每个样品设置3个平行样.
三维荧光测定：首先取泥水混合样品于10 mL离心管中, 室温下用离心机以8 000 r·min-1离心15 min, 倒掉上清液, 加入适量磷酸盐缓冲溶液, 将污泥稀释至原体积.之后将污泥摇散后超声处理3.5 min, 接着80℃水浴30 min(每隔10 min左右将泥摇匀1次), 最后用离心机8000 r·min-1离心15 min, 取上清液进行测定; Ex(激发光谱)扫描范围为200~900 nm, Em(发射光谱)扫描范围为200~900 nm, 扫描步长均为10 nm, 扫描速度1 000 nm·min-1.其中X轴代表发射波长, Y轴代表激发波长, 等高线颜色深浅反映样品的荧光强度.
2 结果与讨论 2.1 储存前后污泥的活性变化在15℃±1℃不同基质浓度(低、中、高)条件下, 进行15 d的短期储存, 分别在储存前后上述标准方法测定反应器中种泥的SAA, 通过SAA的变化可以间接反映ANAMMOX菌的丰富程度和反应器的运行效果, 从而表征污泥的活性变化.
在储存前对种泥SAA测定, 其值(以N/VSS计, 下同)为0.223 g·(g·d)-1, 将污泥从储存环境中取出, 置于纯净水中淘洗3遍后, 立即对其SAA进行测定取平均值.由图 1可知室温条件下在不同基质浓度中储存15 d后储存的菌种活性下降程度差别较大, 1、2、3号反应器其活性分别下降41.8%、17.4%、33.4%.由于储存期间温度降低, 使得1、2、3号反应器中菌种厌氧氨氧化活性均出现了较大幅度的降低, 这与Dosta等[20]的研究发现降低反应器运行温度后, 重新恢复至原温度运行ANAMMOX菌活性会出现大幅下降的研究结果一致[21, 22], 储存期间基质浓度这个重要参数较储存前也发生了较大的变化, 温度和基质浓度的巨大变化对系统产生了极大冲击, 打破系统原来的稳态, 使得菌种活性产生不同程度的下降.经过15d的储存后, 2号反应器中的菌种活性保留最高为0.184 g·(g·d)-1, 这是因为在该储存条件(15℃±1℃)下, 温度降低导致厌氧氨氧化菌活性降低, 底物消耗速率降低, 适当的基质浓度为其反应提供了相对充足的底物, 支撑其在短期储存过程中的物质能量需求; 除此之外, 由于温度对于厌氧保存状态下的ANAMMOX菌的影响比其他异养菌的影响更大[23], 因此要保持ANAMMOX菌的优势地位, 必须考虑在储存过程中不同菌种之间的竞争问题, 而NO2--N对于很多微生物具有毒害作用, 但ANAMMOX菌对NO2--N的耐受度比其他菌更高[24], 2号反应器的NO2--N的基质浓度在为ANAMMOX菌提供反应底物的同时, 还起到抑制系统中其他异养菌的作用, 这对于抵消温度对ANAMMOX菌冲击, 保持该菌在系统中的优势菌群地位具有重要作用. 3号反应器中SAA为0.149 g·(g·d)-1, 因为储存过程中NO2--N的基质浓度过高, 由于在该温度下菌种活性较低, 导致过量的NO2--N不能被及时消耗, 系统长时间处于较高浓度的NO2--N中, 在抑制其他异养菌的同时, 对ANAMMOX也产生了抑制作用.由此可知, 在保存过程中及时解除NO2--N的抑制对于菌种活性的保存具有重要意义; 1号反应器中菌种活性保留更低SAA仅为0.13 g·(g·d)-1, 只是由于在无基质的环境中, 系统中ANAMMOX长期处于饥饿状态, 导致部分细菌死亡, 而死亡的菌体为系统中异养菌提供营养物质, 致使系统中其他菌种繁殖, ANAMMOX失去在系统中的菌种优势.
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图 1 SAA变化及活性下降率 Fig. 1 Change of the SAA and activity decline rate |
在ANAMMOX常温短期储存过程中, NH4+-N和NO2--N浓度为60mg·L-1储存环境更有利于菌种活性和菌种优势的保留.除此之外, 与无基质(0mg·L-1)饥饿状态相比, 较高的基质浓度(120mg·L-1)抑制更有利于系统中ANAMMOX菌种优势.
2.2 储存前后污泥内有机物及EPS的变化胞外聚合物(EPS)是细菌在一定的环境条件下分泌于细胞体外的一些高分子聚合物, 有利于细胞膜的稳定, 对保持生物膜微观结构和功能的完整性起着关键作用, 而且还可以在不利环境中为微生物提供营养物质. EPS中PN含有大量带有不同官能团的芳香环结构和不饱和脂肪酸, 其组分及含量对污泥性能有重要影响[25], 这些官能团具有荧光特性, 是可以表征污泥活性和稳定性的一个重要参数.
三维荧光光谱技术是通过在不同的激发波长上扫描发射荧光谱以获得激发-发射矩阵(EEM), 基于EEM数据构建三维立体图或等高线(指纹图)描绘监测对象特性[26].本实验利用化学分析结合三维荧光光谱分析对储存前后种泥中有机物类型和EPS含量更直观地表征, 进一步解释储存前后污泥的性能变化.
在种泥储存前后, 对预处理后的污泥进行三维荧光光谱分析, 根据Coble[27]等基于13C核磁共振分析研究和DOM(dissolved organic matter, DOM)组分分级[28], 将废水处理出水中可溶性微生物产物分为5类主要荧光基团：类腐殖酸(Ex/Em=237~260/400~500 nm)、类酪氨酸(Ex/Em=225~237/309~321 nm及Ex/Em=275/310 nm)、类腐殖酸(Ex/Em=300~370/400~500 nm)、类色氨酸(Ex/Em=275/340 nm)、类色氨酸(Ex/Em=225~237/340~381 nm).
由图 2所示, 经过处理的泥样在三维荧光光谱中存在着两个荧光尖峰: PeakA、PeakB, 其分别代表的物质为类色氨酸、类腐殖酸.根据峰的颜色深浅可以表征峰强度, 通过比较储存前后不同污泥三维荧光光谱可知, 经过15 d的储存后, 样品的三维荧光光谱中PeakA与PeakB的颜色都出现了不同程度的变浅, 表明PeakA与PeakB的峰强降低, 即类色氨酸、类腐殖酸物质在储存的过程中被不同程度地消耗或分解, PeakA下降较明显, 即类色氨酸消耗较多.除此之外, 不同基质浓度保存条件下的泥样, 该物质的消耗程度各有不同, 高基质浓度中颜色保持较好, 表明该物质被消耗得最少, 其次是中基质浓度, 而低基质浓度的泥样中该物质跟储存前相比已经被大量消耗, 荧光尖峰颜色发生较大的削弱, 上述物质的含量变化表明该物质可能作为在污泥饥饿的阶段一种储能物质, 在储存期间作为内源呼吸的营养物质被菌体吸收.
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图 2 储存前后种泥三维荧光图 Fig. 2 Three-dimensional fluorescence map of seed sludge before and after storage |
待测污泥样品因其DOM组分复杂, 在采用三维荧光光谱技术对系统中DOM定性定量分析的同时, 为进一步提高其分析能力, 本实验结合标准EPS测定方法, 以期对储存前后污泥的活性变化做出合理解释; 这是因为以往研究表明, EPS中所存在的DOM主要包含了类蛋白、类富里酸、类腐殖酸和各种亲水性有机酸、羧酸、氨基酸和碳水化合物等, 其中的类色氨酸、类腐殖酸含量较高占据EPS中较高比例, PeakA与PeakB中大部分的类色氨酸、类腐殖酸中主要来源于EPS.除此之外, 还有小部分来自于细胞死亡, 导致细胞内溶有机物水解释放出一定量的类色氨酸、类腐殖酸.
由图 3可知, PeakA与PeakB所对应的物质在污泥储存前后的变化与EPS的变化趋势大致相同, 即储存基质浓度越低, 物质消耗量越大.同储存前相比, 储存后种泥中的EPS含量均出现不同程度的下降, 1、2、3号反应器中种泥EPS含量分别下降50.9%、41.7%、23.7%, 且随着基质浓度的减小, EPS的消耗量迅速增大, 这是因为EPS可以在基质匮乏时充当碳源和能源物质发生水解并被消耗导致, 3号反应器基质相对充裕, 这是因为较高的总氮质量浓度可以提高EPS的含量[29], 一定的基质浓度为EPS的消耗提供一定的缓冲作用, 减少了EPS的消耗, 使得EPS剩余最多, 而1号反应器中一直处于无基质供应状态, 过长的基质匮乏阶段导致了EPS作为碳源和能源物质在菌体内源呼吸阶段被大量消耗.
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图 3 储存前后污泥EPS组分变化 Fig. 3 Change of the EPS composition of the sludge |
将储存后的污泥按照一定的恢复策略进行恢复, 本阶段对污泥储存前后、污泥性状和污泥粒径进行了观测和对比, 以明晰污泥厌氧氨氧化过程中活性恢复和菌群变化情况.
如图 4、图 5所示, 储存前后污泥形态颜色、大小以及污泥粒径都发生了较大的变化, 表明在短期储存过程中, 不同的基质浓度会对污泥的性状和粒径产生影响.储存前污泥结构紧实, 颜色深红, 颗粒饱满, 平均粒径为491 μm; 储存后污泥结构都有变松散的趋势, 污泥颗粒颜色变浅, 1、2、3号反应器中污泥的粒径分别下降为原来的68.4%、83.3%、91.8%, 在1号反应器中污泥粒径骤降31.6%, 污泥颜色变灰, 颗粒污泥发生解体, 这是菌体死亡、污泥活性基本丧失的体现, 表明在该条件下储存, 大部分污泥已经开始内源呼吸, 并伴随着菌种死亡, 导致生物量锐减. 2号反应器内污泥颗粒颜色和形态结构相对保存较好, 因其有部分基质, 减少环境冲击对污泥的影响, 并在基质匮乏期为菌种提供适当的物质储备, 减少了污泥的内源呼吸期对颗粒污泥的损耗, 使其较1号反应器相比具有相对完整的污泥形态和粒径大小, 生物量保持较好. 3号反应器内污泥颗粒颜色和形态结构保存最好, 颜色同储存前一致, 仅颗粒变小, 表明在3号反应器中菌种死亡较少, 生物量保持最好.
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(a)储存前;(b)储存后1号;(c)储存后2号;(d)储存后3号 图 4 储存前后污泥形态变化 Fig. 4 Change of the sludge morphology before and after storage |
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图 5 储存前后污泥粒径变化 Fig. 5 Change of the sludge particle size |
将污泥从储存结束后进行恢复, 储存前进水中NH4+-N、NO2--N为120mg·L-1左右, 由于储存后菌种活性降低, 为避免较大基质浓度对菌群造成冲击, 在恢复阶段, 采用较低的进水NH4+-N、NO2--N浓度(60mg·L-1), 对菌种进行复壮, 随着反应器中菌种活性的增强, 系统脱氮效果的恢复, 逐渐将进水基质浓度恢复至原水平.通过反应器脱氮性能和化学计量数的变化, 间接反映菌种恢复情况.
此阶段通过测定反应器脱氮性能和化学计量数的变化, 间接反映菌种恢复情况.由图 6可知.储存前种泥的处理效果较为稳定, NH4+-N、NO2--N出水均维持在较低水平, 其总氮去除率均为82.3%以上. 1、2、3号反应器在恢复初期其总氮去除率仅为25.2%、45.3%、51.1%, 由于1号反应器中种泥经过较长时间的基质匮乏期, 导致菌体开始内源呼吸, 造成菌体消耗和大量菌体死亡, 死亡的菌体为系统中其他异养菌提供了营养物质, 异养菌开始繁殖, 进一步削弱了厌氧氨氧化菌在系统中的竞争优势, 导致较低的厌氧氨氧化菌生物量, 进而影响到反应器恢复初期的去除率, 系统需要较长时间来重新富集厌氧氨化菌使其生物量达到储存前程度, 才能使系统脱氮性能恢复; 2号反应器与1号相比因有部分基质缓冲, 储存过程中的内源呼吸期较短, 厌氧氨氧化菌种死亡较少, 加上一定程度的基质抑制使得厌氧氨氧化菌在系统中还保存有一定的优势, 因此较1号相比2号需要重新富集厌氧氨化菌量较少, 需要较短的恢复时间, 就可以使系统脱氮性能恢复; 3号反应器中由于较高的基质浓度, 抑制了系统中其他菌种, 保证了厌氧氨氧化菌在系统中的优势地位.除此之外, 还提供了充足的基质, 使得厌氧氨氧化菌体死亡较少, 生物量保持较好, 但是由于较长时间处于高基质浓度环境中, 厌氧氨氧菌活性也受到了一定程度的抑制, 因此在3号反应器中需要通过恢复菌种活性解除基质抑制的方式来恢复系统脱氮性能; 通过表 2中开始恢复时1、2、3号中化学计量数同标准0.26:1:1.32偏离大小比较, 表明了3个系统中反硝化现象的逐渐减弱, 进一步支撑了上述观点.
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图 6 恢复期脱氮性能对比 Fig. 6 Comparison of the denitrification performance |
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表 2 反应器化学计量数变化 Table 2 Change of the stoichiometry in the reactor |
1、2、3号反应器分别经过了15、10、7 d的活性迟滞期, 化学计量数之比分别从刚恢复时的0.1:1:1.6、0.16:1:1.49、0.19:1:1.42恢复至0.21:1:1.39、0.24:1:1.37、0.23:1:1.37, 反应器脱氮性能逐渐恢复至原水平.厌氧氨氧化种泥活性恢复的实质就是系统内厌氧氨氧化菌的活化、扩增、功能增强的过程.厌氧氨氧菌的世代周期为10~15 d左右, 厌氧氨氧化菌必须达到一定的生物量才能体现出厌氧氨氧化活性. 1、2号反应器中细菌经过适当的增殖后, 生物量才能依次恢复至原水平, 逐渐补充因内源呼吸导致减少的数量, 实现活性的恢复; 3号中因基质相对充足, 细菌总量因内源呼吸损失较少, 恢复过程主要是解除厌氧氨氧化菌高基质抑制, 使系统脱氮性能提升至原水平.相比于菌体重新增殖恢复而言, 通过这种方式系统脱氮性能恢复时间更快.
3 结论(1) 在15℃±1℃条件下, 经过15 d短期储存后, 储存在基质浓度为0、60、120 mg·L-1的NH4+-N和NO2--N中的厌氧氨氧化菌种泥的SAA下降为原来的58.2%、82.6%、66.6%, 60mg·L-1NH4+-N和NO2--N由于其适当的底物缓冲以及该浓度下抑制其他菌种的原因使得其活性保留最高.
(2) 在储存期间, 由于基质匮乏导致细胞内源呼吸消耗有机物, 使得1、2、3号反应器内污泥粒径分别下降为原来的68.4%、83.3%、91.8%, EPS含量分别下降50.9%、41.7%、23.7%, 在一定浓度范围内, 储存基质浓度越低, 污泥自身有机物的消耗越高, 即一定的基质浓度可以缓解其污泥内源呼吸导致的自身消耗.
(3) 1、2、3号反应器分别经过15、10、7 d实现系统脱氮性能和厌氧氨氧化活性恢复, 表明储存在高基质环境中的菌种恢复时间更快, 即对菌种进行活化和功能增强同菌种增殖补充内源呼吸损失的生物量相比, 更有利厌氧氨氧化活性的恢复.
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